郭艷麗，劉維麗，鞠愛霞，馬偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

金蓮花來源于毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花及花蕾[1]，具有清熱解毒、消腫明目功效，主治刃傷、瘡瘍多膿及咽喉腫痛等病癥[2]。現(xiàn)代藥理學研究金蓮花有很好的廣譜抗菌作用，臨床中主要用于治療上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎等[3-5]，近年來有報道稱其抗炎作用甚至高于常用抗菌素[6-8]，且副作用小，但其作用機理尚不明確。

中藥網(wǎng)絡藥理學從系統(tǒng)的角度和分子水平研究中藥及中藥方劑的藥效機理。中藥藥理學要解決的核心問題是，如何在疾病相關(guān)網(wǎng)絡的背景下，評價中藥的多成分、多靶點的協(xié)同作用[9]。網(wǎng)絡藥理學的研究思路與中醫(yī)藥整體觀念一致，可應用于解決中藥及復方研究中多成分、多靶點、協(xié)同作用特點帶來的難題[10]。目前已經(jīng)建立了若干數(shù)據(jù)庫，提供有關(guān)中藥的各方面信息，包括疾病、方劑、草藥或天然產(chǎn)物、生物活性成分和靶點。這些數(shù)據(jù)庫成為中醫(yī)藥與現(xiàn)代生物醫(yī)學之間的橋梁，在中藥藥理學研究中發(fā)揮了重要作用。本研究利用中藥網(wǎng)絡藥理學研究方法，探究金蓮花抗炎功能的作用靶點和相關(guān)基因，為金蓮花抗炎的機制研究和臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 金蓮花活性成分靶點的獲取及活性成分-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索金蓮花，查找金蓮花的活性成分，以口服利用度(OB)和類藥性(DL)兩個指標對活性成分進行篩選，篩選到的活性和其相關(guān)靶點整理。將去除重復的靶點蛋白輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫的Uniprot KB搜索，限定物種為人類，檢索到的蛋白與對應的基因整理成Excel表格，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點基因網(wǎng)絡圖。

1.2 炎癥相關(guān)基因的獲得及相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，選擇Gene選項，輸入檢索詞“inflammation”，得到與人類炎癥相關(guān)的基因，將這些基因數(shù)據(jù)整理后導入Cytoscape 3.7.2軟件，對“meaning of network edges項”和“minimum required interaction score項”進行參數(shù)設(shè)定，形成炎癥靶點相互作用網(wǎng)絡。

1.3 金蓮花活性成分-抗炎作用靶點基因網(wǎng)絡的構(gòu)建

將1.1中所得金蓮花活性成分的預測靶點與1.2中炎癥的相關(guān)靶點取交集，獲得金蓮花活性成分抗炎靶點，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建金蓮花活性成分-抗炎作用靶點網(wǎng)絡，并對其進行分析。

2 結(jié)果

2.1 金蓮花活性成分-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

在TCMSP平臺以金蓮花為關(guān)鍵詞，搜索到金蓮花活性成分共計51種，選擇OB≥30%、DL≥0.18，篩選到活性成分7種，能找到靶點蛋白的活性成分共計6種(有一種活性成分未有對應的靶點蛋白)，6種活性成分信息見表1。

表1 7種活性成分信息

檢索6種活性物質(zhì)共得到靶點蛋白244個，去除重復后得到183個靶點蛋白。將183個靶點蛋白在Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索，其中166個靶點蛋白能夠搜索到相應的靶點基因，共找到靶點基因 166 個。將6種活性成分與靶點基因數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2軟件，得到活性成分-靶點基因網(wǎng)絡，圖1。圖1中圓代表活性成分，三角代表基因靶點。用network analyzer插件進行網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)分析，自由度越大則表明通過該靶點發(fā)揮作用的可能性越大，以自由度≥5為篩選目標，得到靶點基因3個，分別是Ptgs1、Ptgs2、Ncoa2，其在網(wǎng)絡中的具體參數(shù)信息詳見表2。

2.2 抗炎靶點相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫，選擇Gene選項，輸入檢索詞“inflammation”，得到與人類炎癥相關(guān)基因1882個，下載數(shù)據(jù)整理成Exel表格，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2軟件，參數(shù)設(shè)定:meaning of network edges項選擇“evidence”、minimum required interaction score項選擇“highest confidence(0.900)”形成炎癥靶點相互作用網(wǎng)絡，圖2。圖中共有節(jié)點1 776個，邊條17 185個。

圖1 活性成分-靶點基因網(wǎng)絡圖

表2 靶點基因Ptgs1、Ptgs2、Ncoa2在網(wǎng)絡中的具體參數(shù)信息

圖2 炎癥靶點相互作用網(wǎng)絡圖

2.3 金蓮花活性成分-抗炎作用靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

將2.1所得6種活性化合物的166個靶點與2.2炎癥的相關(guān)1 882個靶點進行映射，即兩者取交集，構(gòu)建金蓮花-抗炎的預測靶點。即利用 Cytoscape 3.7.2軟件的merge功能獲得金蓮花活性成分-抗炎作用靶點網(wǎng)絡，圖3。圖3中金蓮花活性成分與抗炎靶點的交集(去除重復)共計87個。其中，刺槐素(acacetin)抗炎靶點16個，β-谷甾醇(beta-sitosterol)抗炎靶點15個，谷甾醇(sitosterol)抗炎靶點2個，果膠蛋白(Pectolinarigenin)抗炎靶點6個，玄參黃酮(Skrofulein)抗炎靶點5個，槲皮素(quercetin)抗炎靶點80個。6種活性成分相對應的抗炎靶點個數(shù)及名稱見表3。

圖3 金蓮花活性成分-抗炎作用靶點網(wǎng)絡圖

表3 6種活性成分相對應的抗炎靶點個數(shù)及名稱

3 討論

金蓮花作為傳統(tǒng)的清熱解毒藥，其抗炎效果好，不容易出現(xiàn)耐藥性，且毒副作用低，是臨床常用且好用的抗菌消炎的中藥，其中成藥制劑在治療感冒、發(fā)熱及咽喉腫痛等病癥中更是應用廣泛[11]。目前藥理學研究證實金蓮花提取物具有良好的抑制細菌能力及治療上呼吸道感染、咽炎和痤瘡方面的藥理作用，和臨床效果一致，但其抗炎機制的研究少見。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)平臺，共檢索到金蓮花口服利用度≥30%、類藥性≥0.18的活性成分7個，其中6個活性成分具有靶點蛋白，靶點蛋白對應的靶點基因中自由度≥5的共計3個，分別是Ptgs1、Ptgs2、Ncoa2基因；金蓮花-抗炎靶點基因共計87個，包括刺槐素抗炎靶點16個，β-谷甾醇抗炎靶點15個，果膠蛋白抗炎靶點6個，谷甾醇抗炎靶點2個，玄參黃酮抗炎靶點5個，槲皮素抗炎靶點80個，其中自由度≥5的抗炎靶點基因2個，分別是Ptgs1、Ptgs2，且Ptgs1、Ptgs2在5個活性成分(acacetin，beta-sitosterol，Pectolinarigenin，Skrofulein，quercetin)中均有出現(xiàn)，因此判斷Ptgs1、Ptgs2是金蓮花中5個活性成分共有的抗炎靶點。

前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS)，又稱環(huán)加氧酶，是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶，既是一種雙加氧酶又是一種過氧化物酶。PTGS有兩種同工酶：組成型PTGS1和誘導型PTGS2，它們在表達和組織分布調(diào)節(jié)上存在差異。PTGS2基因編碼誘導同工酶。它由特定的刺激事件調(diào)節(jié)，提示它與炎癥和有絲分裂發(fā)生相關(guān)的前列腺素生物合成有關(guān)。PTGS1和PTGS2主要參與前列腺素的合成、前列腺素的代謝過程、脂肪酸合成過程、脂肪酸代謝過程、脂質(zhì)代謝過程等，還參與對氧化應激反應和炎癥反應等。金蓮花主要化學成分有黃酮類、有機酸、生物堿等，黃酮類的含量最高，總黃酮約占金蓮花干重的 16%[12]，被認為是金蓮花中最主要活性物質(zhì)，藥理學研究也證實金蓮花抗菌抗炎的主要活性成分是黃酮類化合物[13]。槲皮素屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化以及減輕心肌肥厚、抑制T細胞體外活化等多種作用[14-16]；槲皮素的抗炎作用主要表現(xiàn)在能減少急性、慢性和亞臨床癥狀的炎癥過程，并能抑制巨噬細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞等，減少致命的休克反應[17-19]。本研究中金蓮花抗炎靶點基因共獲得87個，其中槲皮素抗炎靶點基因有80個，Ptgs1、Ptgs2是金蓮花中5個活性成分共有的抗炎靶點，因此我們推測金蓮花發(fā)揮抗炎作用的活性成分可能是槲皮素；推斷金蓮花抗炎的主要作用靶點是Ptgs1、Ptgs2基因。槲皮素是通過怎樣的途徑來影響Ptgs1、Ptgs2基因，進而發(fā)揮抗炎作用，是有待進一步研究的。