潘 騰 陳 星 沈清武 張 炎 羅 潔

(1.新希望六和股份有限公司， 北京 100102； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100102； 3.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院， 長沙 410128； 4.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院， 北京 100083)

0 引言

肌球蛋白是肌肉組織中的重要蛋白質(zhì)，占鹽溶性蛋白組分的55%～60%[1]，其熱誘導凝膠特性不僅影響肉制品硬度、黏度等質(zhì)構特性，同時對肉制品中水分、脂肪及風味物質(zhì)的保持也有顯著影響[2]。近年來，隨著消費者健康意識的增強，低脂肉制品的開發(fā)成為肉品工業(yè)的發(fā)展方向。不少學者利用肌球蛋白凝膠構建低脂肉制品模擬體系，通過研究肌球蛋白凝膠機制，探索低脂肉制品品質(zhì)的改善方法[3-4]。

肌球蛋白的凝膠過程實質(zhì)上是肌球蛋白的變性與聚集[5]。研究發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白的變性速率與聚集速率決定了肌球蛋白凝膠的特性。當變性速率小于聚集速率時，肌球蛋白未充分展開，功能基團未充分暴露，多形成粗糙、無序的凝膠網(wǎng)絡；當變性速率大于聚集速率時，蛋白結構充分展開，分子間結合充分，可形成均一、有序的凝膠網(wǎng)絡。另外，蛋白質(zhì)聚集體結構與形成的方式顯著影響蛋白質(zhì)凝膠體的形成能力和凝膠特性[6-7]。蛋白質(zhì)聚集速率主要取決于加熱溫度，聚集體結構的改變主要取決于蛋白質(zhì)溶液體系中的離子種類以及溶液pH值[8]。

溶液中Ca2+的存在主要促進疏水性氨基酸基團的暴露，影響蛋白質(zhì)聚集行為的發(fā)生程度[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10-11]， Ca2+濃度較低時，可以形成適宜的蛋白交聯(lián)程度，凝膠體質(zhì)構等凝膠特性得到提高；Ca2+濃度較高時，引起蛋白質(zhì)二級結構發(fā)生顯著改變，蛋白質(zhì)聚集體穩(wěn)定結構被打破，形成大的聚集體，導致蛋白凝膠性能降低。目前，相關研究多針對兔肉、雞肉以及魚肉中提取的肌球蛋白，且多集中在對蛋白凝膠形成特性的影響方面。探究Ca2+濃度對豬肉肌球蛋白熱聚集過程中聚集體結構改變的影響機制，有利于實現(xiàn)對豬肉肌球蛋白熱聚集行為的調(diào)控，從而達到良好的蛋白凝膠狀態(tài)。

本文以豬肉肌球蛋白為研究對象，通過測定肌球蛋白濁度、粒徑、變性率、蛋白結構穩(wěn)定性、Ca2+-ATP酶活、聚集體形態(tài)以及凝膠強度，研究不同Ca2+濃度下豬肉肌球蛋白的熱聚集行為，及其在熱聚集過程中聚集體結構的改變，以揭示豬肉肌球蛋白熱聚集形成機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬通脊肉：北京資源亞太食品有限公司，豬宰后立即取樣液氮冷凍，于-80℃凍藏備用。

蛋白Marker(#26630)，美國Thermo公司；三磷酸腺苷二鈉(ATP·Na2)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)等均購于美國Amresco公司；氯化鉀、焦磷酸鈉、氯化鎂、氯化鉀等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Prometheus NT.48型差示熒光掃描儀，美國 Quantum Design 公司；HT7700型透射電子顯微鏡，日本日立公司；Zetasizer Nano ZS型納米粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；LabRam HR800型顯微激光共聚焦拉曼光譜儀，法國 HORIBA JobinYvon 公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計，上海UNICO公司；DELTA 320型酸度計，瑞士梅特勒-托利多公司；Tecan M200 PRO型酶標儀，瑞士Tecan公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品制備

肌球蛋白提?。喝傇讱⒇i的通脊肉，剔除脂肪和結締組織，絞碎，用液氮速凍，之后放于-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?。肌球蛋白的解離純化參照文獻[12-13]的方法。

試驗樣品制備：將所得肌球蛋白沉淀溶于0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值 6.5)中，并以此緩沖液作為透析液透析24 h，中間透析液更換兩次。將透析所得蛋白溶液7等分，各組均加入氯化鈉與氯化鈣使蛋白溶液中氯化鈉濃度均為0.6 mol/L，氯化鈣濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.075、0.1 mol/L，同時配置含有相應氯化鈉濃度和氯化鈣濃度的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值6.5)，將蛋白溶液中蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至20 mg/mL，放于0～4℃貯存，7 d內(nèi)完成指標測定。

1.3.2濁度的測定

參照文獻[8]的方法，將蛋白溶液稀釋到2 mg/mL，由20℃升溫至80℃，每10℃收集樣品一次，以其320 nm處的吸光度來表示蛋白質(zhì)溶液的濁度。每個樣品測定3次平行，取平均值。

1.3.3粒徑的測定

參照文獻[14]的方法，將蛋白溶液稀釋到0.5 mg/mL，由20℃升溫至80℃，每10℃收集樣品一次，放于1 cm光程的石英比色皿中，散射角為173°。將樣品放入納米粒度分析儀，采用He-Ne激光在633 nm波長條件下進行測定，并用儀器自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。每個樣品測定3次平行，取平均值。

1.3.4變性率測定及熱變性動力學描述

參照文獻[15]的方法，將蛋白溶液稀釋到5 mg/mL，分別置于30、40、50、60、70、80℃條件下水浴加熱1、2、5、10、20、30 min，取出后迅速冰浴放于4℃貯存。取熱處理后的樣品10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定上清液中蛋白濃度，每個樣品測定3次平行，取平均值。肌球蛋白熱變性率計算公式為

A=(B-C)/B×100%

式中B——熱處理前溶液中蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

C——熱處理后樣品上清液中蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

以不同溫度、不同時間下肌球蛋白的熱變性率為試驗數(shù)據(jù)，進行肌球蛋白熱變性動力學描述。

1.3.5蛋白結構穩(wěn)定性分析

參照文獻[16]的方法，利用差示熒光掃描儀進行蛋白結構穩(wěn)定性的測定，將蛋白溶液稀釋到0.5 mg/mL，各組樣品10 μL吸入毛細管進行測定，溫度范圍20～80℃，升溫速率1℃/min，測定升溫過程中蛋白溶液F350 nm/F330 nm(F350 nm、F330 nm分別表示350、330 nm處的熒光強度)的變化，利用儀器自帶軟件分析蛋白升溫過程中變性溫度Tm。

1.3.6Ca2+-ATP酶活測定

參照文獻[17-18]的方法，略做修改。將蛋白溶液調(diào)至4 mg/mL，分別選取4、20、30、40、50、60、70℃進行樣品收集，按照表1配置反應混合液，配置時先將除ATP以外的溶液加入混勻，將反應混合液放于25℃水浴鍋中恒溫。之后加入ATP溶液，立即開始計時。反應進行3 min，加入2 mL 15%TCA(三氯乙酸)終止反應，之后10 000g離心2 min，取上清?？瞻捉M首先加入TCA，之后加入ATP。吸取4 mL上清液，分別加入3 mL 0.05 mol/L Tris-馬來酸緩沖液(pH值7.0)，振蕩混勻，之后加入3 mL定磷試劑(20%維生素c，3 mmol/L H2SO4，3%鉬酸銨以等體積混合)，放于45℃水浴鍋中恒溫30 min，取出冷卻，測定各組溶液640 nm波長處吸光度。每個樣品測定3次平行，通過磷酸標準曲線計算無機磷酸量，取平均值。

Ca2+-ATP酶活性定義為1 mg酶蛋白在1 min內(nèi)生成的無機磷酸量(μmol)。

表1 反應混合液的配置組成Tab.1 Components of mixed reaction solution

1.3.7肌球蛋白聚集體的形態(tài)觀察

參照文獻[14,19]的方法，利用負染透射電鏡技術觀察蛋白聚集體形態(tài)。將蛋白溶液稀釋到0.5 mg/mL，用于負染透射電鏡的樣品制備。吸取5 μL 熱處理后蛋白樣品滴于鍍碳膜銅網(wǎng)，靜置1 min，之后超純水沖洗3次，濾紙吸干。吸取3.5 μL乙酸鈾染液滴于銅網(wǎng)，預染兩次，濾紙吸干，之后染色45 s，濾紙吸干，干燥后用于透射電鏡觀察(加速電壓：80 kV)。

1.3.8凝膠強度測定

對經(jīng)過不同Ca2+濃度處理后的肌球蛋白溶液進行加熱處理，選取加熱溫度60、70、80℃條件下制得的蛋白凝膠進行凝膠強度的測定，將凝膠樣品分切為直徑2 cm、高1 cm的圓柱體，采用P/50型探頭進行兩次壓縮，壓縮比為50%，壓縮速度1.0 mm/s。每個處理測定6個平行，記錄樣品的硬度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結果表示為平均數(shù)±標準差。統(tǒng)計分析均采用軟件SPSS 17.0進行。各組間的數(shù)值用ANOVA和Duncan多重比較分析，當p<0.05認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 肌球蛋白熱聚集過程中濁度的改變

濁度的改變可以用于監(jiān)測溶液中蛋白質(zhì)聚集的程度，聚集程度越高，光散射越強，溶液吸光度越高，即溶液的濁度越大[15]。氯化鈣濃度對肌球蛋白加熱過程中濁度的影響如圖1所示。研究發(fā)現(xiàn)，在20℃時，氯化鈣并未對肌球蛋白濁度產(chǎn)生顯著影響(p>0.05)。隨著溫度逐漸升高，各處理組濁度均逐漸上升，各組趨勢一致。其中，相同溫度條件下氯化鈣濃度0.05、0.075、0.1 mol/L處理組濁度高于其他處理組。氯化鈣處理條件下，肌球蛋白濁度均在60℃時升高幅度最為顯著。當溫度升至80℃時，氯化鈣濃度0.075 mol/L與0.1 mol/L處理組中肌球蛋白濁度顯著高于其他處理組(p<0.05)。文獻[9]的研究也表明了不同氯化鈣濃度引起體系濁度的改變。

圖1 不同氯化鈣濃度條件下肌球蛋白加熱過程中濁度的改變Fig.1 Effects of CaCl2 concentrations on turbility of porcine myosin during heating

2.2 肌球蛋白聚集體的粒度表征

馬爾文粒度分析儀利用動態(tài)光散射技術通過測量樣品散射光強度起伏的變化得出樣品顆粒大小[20]，可用于表征蛋白聚集程度。如圖2所示，初始溫度時，各處理組間平均粒徑無顯著差異(p>0.05)。隨著溫度升高，各處理組粒徑均逐步上升，氯化鈣濃度0.05、0.075、0.1 mol/L處理組平均粒徑在升溫過程中均高于其他氯化鈣處理組。當溫度為70～80℃時，氯化鈣濃度0.01、0.02、0.03 mol/L處理組平均粒徑變化不顯著，但是氯化鈣濃度0.04、0.05、0.075、0.1 mol/L處理組平均粒徑仍在升高，最終粒徑分布為1 300～1 400 nm。

圖3 不同氯化鈣濃度下熱處理對肌球蛋白變性率的影響Fig.3 Effects of heat treatment on denaturation rate of porcine myosin with different CaCl2 concentrations

圖2 不同氯化鈣濃度條件下肌球蛋白加熱過程中粒徑的改變Fig.2 Effects of CaCl2 concentrations on particle size of porcine myosin during heating

2.3 肌球蛋白熱變性動力學分析

對蛋白質(zhì)熱變性動力學進行分析可以明確蛋白受熱變化規(guī)律，從而更好地利用其熱變機能，有利于凝膠制備與品質(zhì)提升。選取濃度為0.02、0.05 mol/L氯化鈣處理組進行肌球蛋白熱變性動力學分析。

如圖3a所示，0.02 mol/L氯化鈣處理下，不同溫度處理組隨著加熱時間的延長，熱變性率上升速率均先升高后趨于平緩，當加熱時間達到10 min時，隨著加熱時間的延長，各組熱變性率上升速率變化不顯著(p>0.05)。當加熱時間達到30 min時，70℃與80℃處理組肌球蛋白變性率均達到98%，加熱溫度60℃處理組肌球蛋白變性率達到89%，加熱溫度30℃和40℃處理組中蛋白變性率顯著低于其他處理組(p<0.05)。0.05 mol/L 氯化鈣處理下，肌球蛋白變性率隨著加熱溫度和加熱時間的變化趨勢與0.02 mol/L 氯化鈣條件下變化規(guī)律類似。但是，肌球蛋白熱變性率升高速率高于0.02 mol/L氯化鈣處理組，其中，加熱溫度80℃條件下，加熱時間5 min時肌球蛋白蛋白熱變性率即已經(jīng)達到95%，顯著高于其他溫度處理組(p<0.05)。0.1 mol/L 氯化鈣條件下，各組肌球蛋白變性率上升速率高于0.02 mol/L 氯化鈣處理組，其中，加熱溫度70℃條件下，加熱時間5 min變性率即已經(jīng)達到75%，高于其他氯化鈣處理組。加熱溫度50℃條件下，當加熱時間達到10 min后，變性率上升速率高于相同條件下0.02 mol/L 氯化鈣處理組。因此，氯化鈣濃度升高，肌球蛋白變性率升高速率逐步提高。

D值表征某一恒定溫度下90%肌球蛋白變性所需的時間，以某一溫度下熱處理時間t時刻時蛋白質(zhì)濃度Ct的對數(shù)為縱坐標，以熱處理時間t為橫坐標，進行作圖，所得擬合直線回歸方程的斜率取負倒數(shù)可得D值[21]。Z值作為一個溫差值，表征D值降低90%時溫度的變化，可以得出溫度對D值的影響，是體現(xiàn)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要指標[22]。同樣，以某一溫度下的D值取對數(shù)為縱坐標，以該溫度所對應的絕對溫度T為橫坐標作圖，所得擬合直線回歸方程的斜率取負倒數(shù)可得Z值。不同氯化鈣濃度條件下熱處理對肌球蛋白熱變性的影響如圖4，根據(jù)所得擬合直線回歸方程計算D值，之后肌球蛋白的lgD-T曲線如圖5，并根據(jù)所得擬合直線回歸方程計算Z值，計算所得D值如表2所示，CaCl2濃度0.02、0.05、0.10 mol/L所對應的Z值分別為29.94、29.94、29.07℃。

圖4 不同氯化鈣濃度條件下熱處理對肌球蛋白熱變性的影響Fig.4 Effects of heat treatment on thermal denaturation of porcine myosin with different CaCl2 concentrations

圖5 肌球蛋白lgD-T曲線Fig.5 lgD-T curves of porcine myosin

氯化鈣的加入造成肌球蛋白D值降低，本研究中氯化鈣濃度0.02 mol/L與0.05 mol/L處理組間D值無顯著差異，但是氯化鈣濃度達到0.10 mol/L時，肌球蛋白D值顯著小于其他氯化鈣處理組，說明隨著氯化鈣濃度的升高，在0.10 mol/L的氯化鈣濃度下，降低了肌球蛋白的熱穩(wěn)定性。因此，氯化鈣的加入降低了肌球蛋白的熱穩(wěn)定性。該結果與文獻[23]的研究相一致。

表2 不同處理條件下肌球蛋白熱變性反應的D值Tab.2 Thermal denaturation D values of porcine myosin with different CaCl2 concentrations s

2.4 肌球蛋白熱聚集過程中蛋白結構穩(wěn)定性分析

對加熱過程中肌球蛋白在350 nm與330 nm波長處熒光強度的比值進行測定繪圖后，對其曲線進行一階導數(shù)計算，確定肌球蛋白熱處理過程中的變性溫度Tm，從而可以判斷熱處理過程中肌球蛋白不同結構域變性行為的發(fā)生，確定不同結構域的變性溫度，對比不同處理條件下肌球蛋白結構熱穩(wěn)定性。

從圖6和表3可知，在鈣離子存在條件下肌球蛋白熱處理過程中主要有兩個結構域發(fā)生了解折疊行為，并且兩個結構域解折疊行為發(fā)生溫度不同。研究發(fā)現(xiàn)，隨著氯化鈣濃度的升高，Tm1與Tm2均逐漸下降，其中，當氯化鈣濃度由0.01 mol/L升高至0.1 mol/L時，Tm1由40.2℃降至36.5℃，Tm2由52.4℃降至50.8℃，Tm1下降程度大于Tm2，說明Ca2+的加入主要對肌球蛋白中首先發(fā)生解折疊行為的結構域產(chǎn)生影響。因此，氯化鈣的加入降低了肌球蛋白結構的穩(wěn)定性，使得肌球蛋白在35～40℃即開始出現(xiàn)第1個結構域解折疊行為，溫度高于50℃時，肌球蛋白出現(xiàn)第2個結構域的解折疊行為。

表3 氯化鈣對肌球蛋白變性溫度Tm的影響Tab.3 Effects of CaCl2 on thermal denaturation temperature of porcine myosin

圖8 不同氯化鈣濃度下熱處理過程中肌球蛋白的透射電鏡圖(×200 000)Fig.8 Transmission electron microscope of myosin with different CaCl2 concentrations during heating

2.5 肌球蛋白熱聚集過程中Ca2+-ATP酶活的變化

Ca2+-ATP酶活性位點位于肌球蛋白頭部，可以通過測定肌球蛋白的Ca2+-ATP酶活性變化，來反映肌球蛋白的變性情況[24-25]。Ca2+是激活Ca2+-ATP酶活性的關鍵因素之一[26]，如圖7所示，初始溫度4℃時，氯化鈣0.1 mol/L處理組Ca2+-ATP酶活高于其他氯化鈣處理組，說明Ca2+濃度的升高可以激活Ca2+-ATP酶的活性。文獻[27]也報道了CaCl2(<50 mmol/L)增加了Ca2+-ATPase活性。隨著加熱溫度的逐漸上升，Ca2+-ATP酶活性逐步下降，其中，溫度30～40℃時，Ca2+-ATP酶活下降速率明顯。當溫度達到50℃時，氯化鈣處理組Ca2+-ATP酶活均降為0。因此，Ca2+的加入可以激活Ca2+-ATP酶的活性，同時也促進了蛋白解折疊行為的進行，導致肌球蛋白頭部之間更易結合，降低了肌球蛋白熱聚集行為的發(fā)生溫度。

圖7 氯化鈣對肌球蛋白熱變性的Ca2+-ATP酶活性影響Fig.7 Effects of CaCl2 on Ca2+-ATPase activity of porcine myosin during heating

2.6 肌球蛋白聚集體的形態(tài)觀察

根據(jù)不同處理組間蛋白粒徑及蛋白結構穩(wěn)定性的差異，選取具有代表性的氯化鈣濃度0.03 mol/L和0.1 mol/L分別在20、50、80℃溫度條件下，對蛋白聚集體的形態(tài)進行觀察。

氯化鈣濃度0.03、0.1 mol/L處理組在加熱溫度20、50、80℃條件下蛋白形態(tài)如圖8。研究發(fā)現(xiàn)，在同一氯化鈣濃度條件下，隨著溫度的升高，蛋白逐漸聚集。氯化鈣濃度0.03 mol/L處理組中，在20℃時，肌球蛋白分散于鹽溶液中，蛋白之間未發(fā)生聚集現(xiàn)象，溫度達到50℃時，蛋白之間互相聚集，大部分蛋白頭部聚集在一起，尾部向外散射，當溫度達到80℃時，蛋白小的聚集體利用向外散射的尾部進一步聚集，形成大的聚集體。氯化鈣濃度0.1 mol/L處理組中，在20℃時，肌球蛋白形態(tài)與氯化鈣濃度0.03 mol/L處理組無顯著差異，當溫度升高至50℃時，蛋白聚集程度高于氯化鈣濃度0.03 mol/L處理組，蛋白除了頭部互相聚集，形成聚集體，蛋白尾部也已經(jīng)開始互相結合，部分蛋白結合成聚集體顆粒鏈，當溫度達到80℃時，蛋白發(fā)生團聚，聚集體體積顯著增大。

2.7 肌球蛋白熱誘導凝膠強度的差異

凝膠強度是表征蛋白凝膠特性的重要指標之一，與肉制品質(zhì)構品質(zhì)密切相關，凝膠強度反映蛋白凝膠網(wǎng)絡的結構質(zhì)量，凝膠強度與蛋白聚集體大小及蛋白聚集程度密切相關[28]。

不同氯化鈣條件下，肌球蛋白加熱過程中凝膠強度的變化如圖9。研究發(fā)現(xiàn)，同一氯化鈣濃度條件下，隨著加熱溫度的升高，肌球蛋白凝膠強度逐漸提高。相同溫度條件下，隨著氯化鈣濃度的升高，蛋白凝膠強度逐漸提高，當加熱溫度達到80℃時，氯化鈣濃度0.1 mol/L處理組凝膠強度顯著高于其他處理組，氯化鈣濃度由0.01 mol/L升高至0.1 mol/L，凝膠強度由4.58 N升至5.28 N。分析認為，Ca2+

圖9 不同氯化鈣濃度條件下肌球蛋白加熱過程中凝膠強度的改變Fig.9 Effects of CaCl2 concentrations on gel strength of porcine myosin gels during heating

可以促進ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸交聯(lián)的形成，促進蛋白結構伸展，主要通過增強疏水性相互作用力的方式促進蛋白聚集體的形成，氯化鈣濃度的提高使得蛋白聚集體體積增大，使得蛋白凝膠網(wǎng)絡粗糙同時硬度增大。

3 結束語

以豬背最長肌中提取的肌球蛋白為研究對象，通過添加不同濃度氯化鈣(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.075、0.1 mol/L)，研究了不同Ca2+濃度下肌球蛋白的熱聚集行為。對肌球蛋白進行熱變性動力學分析，研究加熱過程中聚集體形態(tài)結構的變化。結果表明，隨著溫度的升高、氯化鈣濃度的增加，肌球蛋白濁度、粒度、變性率逐步增大；Ca2+濃度增加，降低了肌球蛋白的熱穩(wěn)定性，在溫度高于50℃時，肌球蛋白出現(xiàn)第2個結構域的解折疊行為；顯著提高肌球蛋白初始狀態(tài)的Ca2+-ATP酶活性；隨著Ca2+濃度的增加，聚集速率加快，形成大體積無序聚集體；隨著溫度升高、氯化鈣濃度增加，凝膠強度增加。