李社增，牛露欣，李博超，陳秀葉，馬平*，馬峙英

（1.河北農業(yè)大學/ 教育部華北作物種質資源重點實驗室，河北 保定071000；2. 河北省農林科學院植物保護研究所/ 河北省農業(yè)有害生物綜合防治工程技術研究中心/ 農業(yè)農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定071000；3. 南加州大學生物醫(yī)學工程系，美國 洛杉磯90089）

采用氣相色譜- 質譜（Gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）[1-2]或液相色譜- 質譜（Liquid chromatography-mass spectrometer，LCMS）[3-4]成功分析擬南芥、番茄等植物代謝組后，色譜與質譜相結合分析技術被證明是非靶標代謝組分析中最高效和最靈敏的方法。 在非靶標代謝組研究中，由于質譜數(shù)據龐大而復雜，數(shù)據處理和分析以及隨后的代謝物注釋／鑒定是最耗時費力的工作。 造成代謝組數(shù)據龐大復雜的主要原因是分析物的多種加合物形成以及鹽團簇形成，導致質譜數(shù)據存在大量的額外信號[5]。

在液相色譜電噴霧質譜（Liquid chromatogra phy-electrospray ionization-mass spectrometry，LC-ESI-MS）分析過程中，分析物形成加合物的現(xiàn)象普遍存在，是對物質定性、定量的基礎[6-8]。 尤其對于糖和各種炸藥等一些不能直接用電噴霧質譜分析的化合物，加合物形成的發(fā)現(xiàn)顯得尤為重要。 例如：Ghosh 等[9]在電噴霧負離子模式下通過甲酸加合物實現(xiàn)了?；崽谴x物的測定，Mathis 等[10]采用負離子加合物建立了高能炸藥的定性和定量的方法。 加合物中除了常見的質子化分子外， 鈉、 鉀和銨加合物也經常出現(xiàn)，Huang等[11]報道在電噴霧質譜分析中的正（負）離子模式中能夠觀察到常見的正、負離子加合物分別為32 個和15 個。 而與分析物一起形成加合物的各種離子，一般來源于液相色譜的流動相及其添加劑、溶劑雜質、玻璃器皿等[12-14]，特別是流動相中加入添加劑對加合物形成具有較大的影響。Kruve 等[15]研究了ESI 正離子模式下7 種流動相添加劑對17 個化學物質加合物形成的可能性，明確流動相添加劑改變加合物形成有很強的作用；Erngren 等[16]的研究證明流動相中鈉離子或鉀離子濃度對加合物的定量影響極大，甚至形成多聚加合物；Leitner 等[17]研究6 種不同的乙腈／醋酸銨混合物在中性條件下對模型肽 （緩激肽）高效液相色譜 （High performance liquid chromatography，HPLC）-ESI-MS 分析的性能， 明確流動相改變對色譜分離和加合物的形成影響很大，在供試的條件下，可以形成鈉化肽加合物而不是常見的質子加合物。 因此，對于特定的化合物，明確特定液相色譜和電噴霧離子條件下加合物形成數(shù)據，對該物質的定量和定性分析是非常必要的。

在采用LC-ESI-MS 的代謝組分析中，明確代謝產物的種類尤為重要。由于LC-ESI-MS 系統(tǒng)的多樣性以及液相色譜較低的保留時間再現(xiàn)性，導致單一優(yōu)化分析方法和液相色譜-質譜分析中的色譜圖和質譜圖在不同實驗室間進行比較均受到嚴重限制，同時還缺少將質譜數(shù)據自動轉換為（推定的）植物代謝物的高效工具。 這些問題導致對大量質譜信號數(shù)據的分析只能在現(xiàn)有的化學數(shù) 據 庫 （如SciFinder、Pub-Chem、Massbank 或Dictionary of Natural Products）中進行手動搜索[18]，篩選效率受到極大限制，同時這些數(shù)據庫的信息來自一般的化學物質， 其來源未與植物關聯(lián)，導致植物代謝組鑒定時推定的物質種類存在多種可能性和不準確的靶標。 因此，如何實現(xiàn)代謝產物準確鑒定是代謝組分析中的主要難題。 在線XCMS 軟件在一定程度上解決了不同型號液相色譜-質譜系統(tǒng)采集的數(shù)據處理， 實現(xiàn)特征離子檢測、保留時間校正、峰對齊注釋、統(tǒng)計分析和數(shù)據可視化的自動化，為完整的非靶標代謝組分析提供了一整套解決方案[19-20]。 然而，作者所在實驗室在前期研究中，發(fā)現(xiàn)通過在線XCMS 軟件進行代謝產物鑒定，推定的化合物與報道的棉花代謝產物存在較大差異，所以該軟件在針對具體植物的代謝產物進行鑒定時存在重大不足。

本研究著重針對在線質譜分析技術不能準確鑒定棉花次生代謝產物的科學問題， 根據LC-ESI-MS 分析中正（負）離子模式下形成加合物的一般規(guī)律， 利用MATLAB 軟件編寫計算程序建立棉花代謝產物快速鑒定方法；同時，利用超高效液相色譜電噴霧質譜（Ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry，UPLC-ESI-MS）方法對棉花代謝產物標準品進行質譜分析，采用在線XCMS 軟件進行無靶標質譜數(shù)據提取并利用本研究建立的鑒定方法進行鑒定，明確特定液相色譜和電噴霧離子模式條件下這些棉花代謝產物的加合物種類、主導加合物及適宜的離子檢測模式。 因此，本研究結果將為棉花次生代謝組學研究提供技術和理論數(shù)據支撐。

1 材料與方法

1.1 棉花次生代謝產物標準品檢測液制備

對18 個棉花代謝產物的標準品（表1）開展UPLC-ESI-MS 分析研究。 稱取1.0 mg 單個標準品加入10.0 mL 適用溶劑進行溶解，制備標準品100.0 mg·L－1母液。取單個標準品母液0.1 mL，用甲醇作稀劑釋定容至10 mL， 混勻后制備成質量濃度為1.0 mg·L－1的溶液，作為單個標準品檢測液；分別取18 個標準品的母液各0.1 mL 于容量瓶中進行混合， 用甲醇作稀釋劑定容至10 mL，混勻后制備成單個標準品質量濃度為1.0 mg·L－1的標準品混合檢測液，用于液相色譜- 質譜分析的質量控制檢測。 這2 種檢測液分別分裝于進樣瓶中并儲存在4 ℃冰箱中備用。

表1 棉花代謝產物標準品的信息Table 1 Information on cotton metabolite standards tested in presented study

表1 （續(xù)）Table 1 (Continued)

1.2 液相色譜-質譜檢測

本研究采用超高效液相色譜電噴霧飛行時間質譜儀（UPLC 型號為Nexera LC-30AD，日本島津制作所制造； 質譜儀為Triple TOFTM5600＋，美國AB SCIEX 公司生產）對棉花代謝產物標準品及其混合檢測液進行分析。

色譜條件： 色譜柱為Shim-pack GIST C18（直徑2.1 mm，長100 mm，填料粒徑2 μm），流動相A 相為0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液，流動相B 相為0.1%（體積分數(shù)） 甲酸乙腈溶液， 流速0.35 mL·min－1，柱溫40 ℃，自動進樣器溫度4 ℃，進樣量4 μL。 每個樣品3 次重復。 洗脫條件：0～1.0 min，5%（體積分數(shù)，下同）B；1.0～6.0 min，5%～20%B；6.0～9.0 min，20%～50%B；9.0～13.0 min，50%～95%B；13.0 ～15.0 min，95% B；15.0 ～15.2 min，95%～5%B；15.2～17.5 min，5%B。

正離子模式（Positive ion mode，ESI＋）質譜檢測：噴霧氣壓（GAS1）344.7 kPa（50 psi），輔助加熱氣壓（GAS2）413.7 kPa（60 psi），輔助加熱氣溫度500 ℃，氣簾氣壓（CUR）241.3 kPa（35 psi），離子化電壓（IS）5 500 V，采集模式為信息依賴型采集（IDA）模式，TOF-MS 質荷比（m/z）掃描范圍50～1 500， 累積時間250 ms，TOF-MS/MS 二級m/z 掃描范圍50～1 000，累積時間50 ms，去簇電壓（DP）100 V，碰撞能量（CE）35 eV，擴展碰撞能量（CES）15 eV。

負離子模式（Negative ion mode，ESI－）質譜檢測：輔助加熱氣壓379.2 kPa（55 psi），氣簾氣壓172.4 kPa（25 psi），離子化電壓4 500 V，其他參數(shù)設置與正離子模式質譜檢測一致。

采用甲酸鈉相對分子質量作為鎖定值，對質譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性及準確性進行校正，每6 個樣品自動校正1 次。

1.3 質譜數(shù)據預處理和分析

采用在線XCMS 軟件對UPLC-ESI-TOF/MS數(shù)據進行可視化和手工處理（https://xcmsonline.scripps.edu）[20]，進行特征離子峰提取、保留時間（Retention time，RT）校正和峰對齊，獲得m/z、保留時間和峰強度（Peak intensity）等數(shù)據，進一步將包含RT、m/z 和峰強度等數(shù)據導出為xlsx 文件，在MS Excel 2010 軟件中手動搜索和編輯，包括雜質峰的消除和數(shù)據去噪。 將最終結果轉化為數(shù)據矩陣（RT×m/z×峰強度），分別構建ESI＋變量數(shù)據集和ESI－變量數(shù)據集，并用于進一步的數(shù)據分析。

1.4 棉花謝產物的鑒定計算程序

根據LC-ESI-MS 分析技術中正（負）離子模式下形成加合物的一般規(guī)律， 利用MATLAB 軟件（R2018b,The MathWorks,Inc.）編寫計算程序，根據每個離子的質荷比計算出對應的所有可能的準確相對分子質量（計算相對分子質量），進一步計算其與各標準品準確相對分子質量間的誤差，根據鎖定相對分子質量檢測誤差設定誤差閾值，以介于此閾值正負值間的推定物質作為供試化合物的鑒定結果。

1.5 UPLC-ESI-MS 檢測中棉花代謝產物鑒定及加合物推定

根據方法1.4 中對棉花次生代謝產物標準品的質譜數(shù)據鑒定結果，調查供試標準品對應的質譜離子形態(tài)， 即為UPLC-ESI-MS 檢測中棉花代謝產物標準品的加合物。

1.6 UPLC-ESI-MS 檢測中離子模式對棉花代謝產物信號影響

篩選正離子模式和負離子模式下各標準品的信號最強的主導加合物，計算2 個離子模式下峰強度的比值。

2 結果與分析

2.1 標準品的UPLC-ESI-TOF/MS 檢測數(shù)據

圖1 正離子模式（A）和負離子模式（B）下棉花代謝物標準品混合液UPLC-ESI-MS 總離子色譜圖Fig. 1 UPLC-ESI-MS TICs of cotton metabolite mixture in positive (A) and negative (B) ion mode

18 個標準品混合檢測液的UPLC-ESI-MS 總離子色譜圖見圖1。圖1 顯示代謝產物脫落酸，在2 個模式中保留時間和峰強度均有所不同，在正離子模式下，其主要加合物[M＋H]＋（m/z 265.142 9）保留時間為9.96 min，峰強度為1.76×105（圖1A），負離子模式下主要加合物[M-H]－（m/z 263.129 4）保留時間為10.01 min，峰強度為5.62×105（圖1B）。 采用在線XCMS 軟件，分別對正離子模式和負離子模式下采集的各個標準品的原始質譜數(shù)據進行處理和無靶標離子提取，數(shù)據導出到xlsx 文件中，為每個標準品均構建了ESI＋數(shù)據集和ESI－數(shù)據集。 導出的數(shù)據中包含了各離子的保留時間、m/z 和峰強度。 每個標準品提取到的離子數(shù)量、m/z 范圍、保留時間不同，詳細情況列于表2。

2.2 化合物鑒定的推定方法

在LC-ESI-MS 分析中分析物最終形成常見的正、 負離子模式加合物分別為32 個和15 個，根據這些加合物構成規(guī)律，設計了根據加合物的質荷比計算準確相對分子質量的公式，列于表3。本研究利用MATLAB 軟件編制2 個計算程序POSid 和NEGid（暫不公開），分別對正離子模式和負離子模式下檢測到的質譜數(shù)據進行計算，給出判定結果。 這個計算過程主要包括3 個步驟：（1） 獲得計算的準確相對分子質量（Calculated molecular weight，CM）： 根 據 各 檢 測 到 離 子 的m/z， 計算出每個離子對應的所有可能的準確相對分子質量， 計算公式見表3；（2） 獲得誤差（ΔM）： 計算各離子的計算準確分子量與各標準品準確相對分子質量（MM，表1）間的誤差，計算公式：ΔM＝（CM－MM）/MM；（3）根據相對分子質量鎖定值的檢測誤差設定誤差閾值，以誤差介于此閾值正負值的推定物質作為供試物質的鑒定結果。

表2 棉花代謝產物標準品的UPLC-ESI-MS 檢測數(shù)據概況Table 2 A survey of UPLC-ESI-MS data of cotton metabolite standards

2.3 棉花代謝產物鑒定及加合物形成

利用2.2 中鑒定方法， 根據檢測到各標準品離子的m/z，計算了UPLC-ESI-MS 檢測到的各離子對應的所有可能的準確相對分子質量及其與各標準品的準確相對分子質量間的誤差；本次檢測鎖定相對分子質量試驗誤差為21×10－6，確定20×10－6為誤差閾值進行了化合物推定。

對正（負）離子模式下檢測到的離子，該鑒定方法能分別推定出14 個標準品， 但均未推定到α- 石竹烯、角鯊烯和三十烷酸3 種物質，另外正離子模式未推定到3-吲哚甲醛，負離子模式未推定到青榆烯C。 在推定的化合物中，質譜觀察到1～6 種不同的加合物，峰強度5 600 以上，正離子模式的誤差－2.9～3.1，負離子模式誤差－13.5～16.8（表4 和表5）。

正離子模式下， 檢測到的14 個標準品中共觀察到6 種加合物[M＋H]＋、[M＋Na]＋、[M＋NH4]+、[2M＋NH4]＋、[2M＋Na]＋和[2M＋H]＋。 所有標準品都能觀察到加合物[M＋H]＋，白麻苷、綠原酸、蜜二糖、脫落酸、紫云英苷和蔗糖6 個標準品觀察到[M＋Na]＋，赤霉素A3、綠原酸、脫落酸、蔗糖和蜜二糖5 個標準品觀察到[M＋NH4]＋，青榆烯C 和脫落酸均能觀察到[2M＋Na]＋和[2M＋NH4]＋，僅在脫落酸觀察到[2M＋H]＋。

表3 LC-ESI-MS 檢測中供試物質的常見加合物Table 3 Common adducts of the tested compound in LC-ESI-MS detection

表4 正離子模式下棉花代謝產物標準品鑒定Table 4 Putative identification of cotton metabolite standards in positive ion mode

表5 負離子模式下棉花代謝產物標準品鑒定Table 5 Putative identification of cotton metabolite standards in negative ion mode

在負離子模式下， 檢測到的14 個標準品觀察到[M－H]－、[2M－H]－、[M＋Cl]－、[M＋FA－H]－、[3M－H]－、[M＋Na－2H]－、[M－H2O－H]－、[M＋TFA－H]－8 種加合物。所有標準品都能觀察到加合物[M－H]－，赤霉素A3、檉柳黃素、赤霉素A4、白麻苷、綠原酸、脫落酸和紫云英苷7 個標準品能觀察到[2M－H]－，赤霉素A3、赤霉素A4、白麻苷、脫落酸4 個標準品能觀察到[M＋Cl]－，赤霉素A3、赤霉素A4、蔗糖、蜜二糖4 個標準品能觀察到[M＋FA－H]－，赤霉素A3和赤霉素A4均能觀察到[3M－H]－，僅在綠原酸中能觀察到[M＋Na－2H]－，棉酚中能觀察到[M－H2O－H]－，白麻苷中能觀察到[M＋TFA－H]－。

2.4 離子模式對峰強度的影響

基于流動相甲酸乙腈的梯度，特定標準品在UPLC-ESI-MS 的正離子模式或負離子模式下有不同的優(yōu)勢。 本研究在2 種模式下依次分析了棉花代謝產物標準品，以峰強度表示加合物絕對信號強度，其中離子信號最強的為主導加合物。對2個離子模式下各標準品主導加合物的信號進行比較分析，結果表明蜜二糖正離子模式（加合物[M＋NH4]＋）信號強于負離子模式（[M＋FA－H]－）5.4 倍， 棉酚在2 種模式下加合物 （[M＋H]＋、[M－H]－）信號相當，其他12 種化合物均是負離子模式信號強于正離子模式， 信號強度增加0.5～216 倍。 這一結果表明，負離子模式可能是棉花次生代謝產物UPLC-ESI-MS 分析的最佳檢測模式。

圖2 棉花代謝產物標準品正離子模式和負離子模式下最強信號離子的峰強度比值對數(shù)Fig. 2 Peak intensity ratios, in logarithmic scale, of the strongest signal ion (peak intensity) obtained in positive and negative ion modes for some cotton metabolite standards

3 討論

3.1 代謝組分析中化合物鑒定的推定方法

本研究在對棉花次生代謝產物標準品進行非靶標代謝組質譜分析時，每個標準品的質譜數(shù)據包含1 000 多個離子數(shù)據（表1），在此數(shù)據中發(fā)現(xiàn)和鑒定出相應的物質存在很大難度。 因此，實現(xiàn)代謝產物高通量準確鑒定一直是重要的課題。 Moco 等[21]采 用HPLC-ESI-MS 分 析 番 茄（Solanum lycopersicum）代謝組，并利用番茄次生代謝產物加合物m/z 得到計算的準確相對分子質量及其與標準品準確相對分子質量間誤差，建立了番茄次生代謝物質的鑒定平臺MoTo DB，實現(xiàn)了數(shù)據共享。 但這一數(shù)據庫僅限于單個離子數(shù)據的搜索，效率較低。 Benton 等[22]利用在線XCMS 軟件處理質譜數(shù)據， 實現(xiàn)質譜數(shù)據在METLIN 數(shù)據庫中自動搜索，實現(xiàn)代謝產物高通量鑒定。 然而該方案使用的METLIN 數(shù)據庫，偏重于化學分析，雖然含有海量的物質種類，但大多數(shù)化合物缺乏與植物代謝產物的緊密關聯(lián)，在進行植物代謝產物鑒定方面存在較大的局限性。因此，針對具體植物的代謝產物鑒定，仍需建立相應植物代謝產物數(shù)據庫及其鑒定計算方法。 本研究利用MATLAB 軟件編寫的2 個用于棉花次生代謝產物鑒定的計算程序POSid 和NEGtid，在計算原理上與上述2 種方法相同， 能夠從大量質譜數(shù)據中高效、準確發(fā)現(xiàn)靶標物質，完成無靶標棉花次生代謝產物的鑒定工作， 實現(xiàn)了棉花次生代謝產物快速鑒定。 另外， 該方法通過UPLC-ESI-MS 分析→XCMS 質譜數(shù)據處理→質譜數(shù)據→POSid 和NEGtid 計算和比較分析等主要步驟完成， 整個實施過程均能分割獨立完成，方便研究人員自主應用。 因此，該方法的建立，為進一步進行棉花次生代謝組分析中代謝產物的準確鑒定提供了高效和便捷的方法支持。 迄今為止，已經明確從棉花根、莖、葉、花和種子提取物中分離和檢測到的代謝產物111 種，包括萜類化合物61 種、 酚類化合物6 種、 黃酮類化合物26種、生物堿6 種、脂肪族天然產物6 種、碳水化合物5 種和簡單芳香族天然產物1 種[23-24]。 本研究僅涉及18 個棉花代謝產物， 繼續(xù)完善棉花代謝產物數(shù)據庫信息以及進一步開展棉花次生代謝組研究是棉花生物學基礎研究的重點工作之一。

3.2 棉花代謝產物加合物形成

在LC-ESI-MS 分析中，加合物形成是對分析物進行定性和定量的基礎。 明確每個物質在特定LC 和ESI 條件下形成的加合物， 特別是主導加合物， 對該物質的LC-ESI-MS 分析鑒定尤為重要。 Ghosh 等[9]在ESI 模式下通過甲酸加合物實現(xiàn)了酰基蔗糖代謝物的測定，Mathis 等[10]采用負離子加合物建立了高能炸藥的定性和定量的方法，Antonowicz 等[25]從4 種未修飾的核苷中分離出7 種候選核苷加合物， 建立了1 種僅需6 min的超高效液相色譜法， 用于小鼠組織樣品中羰基、氯和氧加合物的定量分析。 所有這些研究表明，在LC-ESI-MS 分析中，加合物形成對待鑒定的分析物定性和定量分析具有重要作用。 本研究對棉花次生代謝產物標準品在UPLC-ESI-MS 分析中加合物形成的加合物種類進行了分析，明確了特定液相色譜和電噴霧離子條件下被鑒定化合物的加合物形成的種類和主導加合物，可為棉花代謝產物的定性和定量分析提供理論數(shù)據。

3.3 UPLC-ESI-MS 檢測時檢測模式選擇

LC 的流動相成分決定了分析物的加合物種類不同，進一步導致ESI 正或負離子模式下檢測到的信號強度會有較大的差異[26]。Moco 等[21]在采用HPLC-ESI-TOF/MS 分析番茄代謝物時， 發(fā)現(xiàn)基于乙腈與甲酸酸化梯度的特定液相色譜流動相，特定化合物在電噴霧正或負離子模式下存在不同加合物信號強度（峰強度）差異，具有ESI 模式的選擇性。 本研究證明供試棉花代謝產物標準品在基于乙腈與甲酸酸化梯度特定液相色譜流動相條件下主導加合物（擁有最大峰強度）信號強度也存在同樣規(guī)律，具有電噴霧離子模式選擇性。如：蜜二糖正離子模式（加合物[M＋NH4]＋）信號強于負離子模式（[M＋FA－H]－）2.7 倍，適合正離子模式檢測； 棉酚在2 種模式下加合物（[M＋H]－、[M＋H]－） 信號相當，2 種ESI 模式均可檢測； 其他12 種標準品均是負離子模式信號強度高出正離子模式0.5～216 倍，適合采用負離子模式檢測。

4 結論

選用18 個棉花代謝產物標準品為供試化合物，建立的基于計算準確分子量的棉花次生代謝產物鑒定MATLAB 程序， 可實現(xiàn)無靶標質譜數(shù)據的快速鑒定。 在本研究規(guī)定的UPLC 和ESI 條件下，2 種ESI 模式下14 個化合物得到鑒定，正離子模式下出現(xiàn)6 種加合物，負離子模式下出現(xiàn)8 種加合物，單個化合物的質譜可觀察到1～6 種不同的加合物，其中1 個為主導加合物。 主導加合物具有ESI 檢測模式的偏好性，決定了該化合物適宜的電噴霧離子模式。 這些結果為進一步開展棉花次生代謝組分析研究提供了技術和理論數(shù)據支撐。