耿延會，邊盈盈，裴文鋒，劉國元，吳嫚，臧新山，李丹，李興麗，Zhang Jinfa，于霽雯*

（1.棉花生物學(xué)國家重點試驗室/ 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點試驗室，河南安陽455000；2.新墨西哥州立大學(xué)，新墨西哥州 拉斯克魯塞斯88003，美國）

植物幾乎所有的能源來自陽光，光合作用是植物葉片獲取光能最重要的途徑，葉片中的葉綠體是光合作用最主要的細胞器，葉綠素是植物吸收、傳遞、轉(zhuǎn)化光能的重要色素[1]。在一定程度上，增加葉綠素含量可以增強葉綠體對光能的吸收與轉(zhuǎn)化，增強光合速率，從而提高產(chǎn)量[2]。 植株生長后期葉綠素含量較高的品種， 葉片功能期較長，不易早衰[3]。棉花葉片葉綠素含量可能與抗逆性和纖維品質(zhì)有關(guān)[4-6]，并受棉花半配子基因調(diào)控[7]。 另外，研究表明葉綠素含量受光照強度、溫度、水分、生育期、植株部位、水肥條件、鹽脅迫等因素的影響[8-12]，因此葉綠素含量可以作為植株生理狀況的1 項重要指標(biāo)。

葉綠體發(fā)育受到抑制， 葉綠素含量降低，葉片會表現(xiàn)出黃化、白化等現(xiàn)象[13]，芽黃突變體v1苗期葉片呈黃色， 葉綠素含量比野生型低3～5倍[14]，后期發(fā)育過程中葉綠素含量逐漸增加使芽黃突變體v1葉色與野生型棉株沒有明顯差異[15]。為探究棉花葉綠素形成的遺傳機制，前人利用不同棉花群體對葉綠素含量進行QTL 定位。 秦鴻德等[3]報道了棉花葉綠素含量和光合速率相關(guān)QTL， 定位到3 個與葉綠素含量相關(guān)的QTLs；Song 等[14]檢測到24 個與葉綠素相關(guān)的QTLs；張建等[16]定位到6 個與葉綠素含量相關(guān)的QTLs；鄭巨云等[17]定位到1 個關(guān)于葉綠素含量的QTL；戎福喜等[18]定位到1 個關(guān)于葉綠素含量相關(guān)的QTL；Abdelraheem 等[5]共定位到18 個與葉綠素含量相關(guān)的QTLs。 統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，前人鑒定到32 個與葉綠素含量相關(guān)的QTLs[5]。 然而，以上研究大多基于F2等初級分離群體， 且使用的SSR 標(biāo)記數(shù)量有限，構(gòu)建的遺傳圖譜密度較低，不能覆蓋棉花全基因組。 此外，前人研究中對葉綠素含量測定主要集中在棉花的營養(yǎng)生長期， 如苗期；而對棉花從營養(yǎng)生長過渡到生殖生長的開花期、以及生殖生長的結(jié)鈴期葉綠素含量的研究較少。 目前對植物葉綠素含量測定方法可歸納為化學(xué)法和物理法。 其中化學(xué)法主要是利用乙醇或丙酮有機溶劑萃取葉綠素，并通過分光光度計進行葉綠素含量測定；但該法操作繁瑣，不利于進行大規(guī)模的樣本測定，且提取過程中很難避免葉綠素的分解損失。 物理法可通過葉綠素測定儀例如日本研發(fā)的SPAD-502 來檢測葉綠素含量的相對值；該方法適合在室外對植物葉綠素含量指標(biāo)進行隨身攜帶快速測定。 此外，大量研究表明該儀器測定的SPAD （Soil and plant analyzer development，土壤與作物分析儀開發(fā)）讀值與葉綠素含量之間具有良好的相關(guān)性，目前已廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、菘藍、西瓜等植物的葉綠素含量的快速測定和QTL 定位[17,19-22]。

本研究利用葉色淺綠的陸地棉中36 和葉色深綠的海島棉海7124 構(gòu)建高世代棉花陸?；亟蛔越幌等后w （Interspecific backcross inbred line,BIL），分別對BC1F7群體的195 個家系初花期和結(jié)鈴期的葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值進行統(tǒng)計分析；利用本課題已構(gòu)建的該群體高密度遺傳圖譜數(shù)據(jù)分別對初花期和結(jié)鈴期的葉綠素含量性狀進行QTL 定位， 以期鑒定出與葉綠素含量相關(guān)的QTL， 為葉綠素含量相關(guān)QTL 的精細定位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以廣適應(yīng)性葉色較淺的陸地棉材料中36 為輪回親本與抗黃萎病、黃花、黃色花藥、花基紅心、 葉色較深的海島棉海7124 材料雜交得到BC1F1， 并連續(xù)自交7 代后， 最終得到包含195 個家系的BC1F7回交自交系群體。 該群體及其親本分別于2017 年種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所南試驗場試驗田 （N36.06°，E114.49°），采用完全隨機區(qū)組試驗設(shè)計，2 個重復(fù)（分別位于地勢較低、 水肥較好的偏東位置和地勢較高、水肥相對較差的偏西位置）。 兩親本及其195 個家系種植行長4 m，行間距約80 cm，株距約25 cm，采取常規(guī)田間管理。

1.2 葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值測定

在初花期（時期1）和結(jié)鈴期（時期2）分別對親本及BC1F7群體的195 個家系進行葉綠素含量指標(biāo)SPAD （Soil and plant analyzer development，土壤與作物分析儀開發(fā)）值測定。 在晴天上午7∶00―9∶00 利用葉綠素測定儀（SPAD-502 Plus，Konica minolta,Japan）對每行中間部分隨機挑選的3 株生長健康的棉花主莖倒4 葉進行SPAD 值測定。由于SPAD 值與葉綠素含量（質(zhì)量分數(shù)）顯著相關(guān)符合公式：y＝1.01513x－1，x 和y分別代表SPAD 值和葉綠素質(zhì)量分數(shù)[23]，因此本試驗以SPAD 值作為葉綠素含量指標(biāo)進行試驗分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析和QTL 定位

1.3.1 表型數(shù)據(jù)分析。 利用SAS 9.3 軟件對初花期和結(jié)鈴期的葉片SPAD 值表型數(shù)據(jù)進行最大值、最小值、平均值、峰度、偏度、正態(tài)分布檢驗等描述性統(tǒng)計分析； 用proc anova 進行方差分析；用SAS 9.3 軟件的簡單線性相關(guān)模型對2 個時期的葉綠素含量性狀進行相關(guān)性分析。 用Origin 2018 軟件進行繪圖。

1.3.2 QTL 定位。本研究采用以下2 種分析模型對葉綠素SPAD 值性狀進行QTL 定位：1） 利用IciMapping 4.1 軟件的BIP 模型的完備區(qū)間作圖法（Inclusive composite interval mapping，ICIM）分別對初花期、結(jié)鈴期的葉綠素含量性狀進行QTL定位，本方法以LOD＝2.0 為閾值；2）為研究棉花營養(yǎng)生長過渡到生殖生長的初花期與棉花生殖生長的結(jié)鈴期葉片葉綠素含量性狀QTL 的加性與環(huán)境互作效應(yīng)， 本研究對利用IciMapping 4.1軟件的MET 模型進行分析，該方法以LOD＝3.0為閾值。 QTL 的命名規(guī)則：q＋性狀的英文縮寫-染色體號-數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 BILs 群體及其親本葉綠素含量指標(biāo)SPAD值的描述性統(tǒng)計分析

對BILs 群體及其親本的主莖倒4 葉的葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值進行了基本統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)在初花期親本中36 和海7124 的葉片SPAD 值分別為47.15 和46.90，BILs 群 體 的 SPAD 值 為35.43～53.52（圖1），變異系數(shù)為6.75%（表1）；結(jié)鈴期親本中36 和海7124 的SPAD 值分別為52.95 和51.60， 群體的SPAD 值為42.28～62.20（圖1），變異系數(shù)為7.18%（表1）。 該群體在2 個時期的葉綠素含量相關(guān)的SPAD 值均表現(xiàn)出超親分離現(xiàn)象；2 個時期的葉片SPAD 值的變異系數(shù)均高于6%， 說明葉綠素含量相關(guān)的SPAD 值在該群體中的變異較為豐富。 此外，通過對2 個時期SPAD 值的峰度進行分析，發(fā)現(xiàn)初花期和結(jié)鈴期的峰度分別為0.09 和0.07， 說明該群體SPAD 值在2 個時期均符合正態(tài)分布（表1）。 以上SPAD 值的統(tǒng)計分析為進一步對2 個時期葉綠素含量相關(guān)性狀的QTL 定位奠定基礎(chǔ)。

圖1 BIL 群體SPAD 值頻率分布圖Fig. 1 Frequency distribution of SPAD value for BIL population

表1 親本和BIL 群體的SPAD 值表型測定Table 1 Phenotypic determination of SPAD value in parents and BIL population

分別對初花期、結(jié)鈴期2 個時期以及不同時期2 個重復(fù)間的SPAD 值進行方差分析，發(fā)現(xiàn)不同時期和不同重復(fù)的葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值都存在極顯著差異（表2 和圖2）。 不同時期的葉片SPAD 值差異極顯著表明每個家系在初花期（從營養(yǎng)生長過渡到生殖生長）與結(jié)鈴期（棉花生殖生長）的葉綠素含量變化一致性較弱；2 個重復(fù)間存在極顯著差異表明該性狀受土壤水肥等因素影響較大。 進一步分析發(fā)現(xiàn)初花期和結(jié)鈴期的遺傳力分別為66.84%和69.66%（表1）， 說明葉綠素含量性狀相關(guān)SPAD 值在2 個時期主要受基因型控制，但也易受環(huán)境因素的影響。

表2 BIL 群體中SPAD 值的方差分析Table 2 Analysis of variance for SPAD value in BIL population

圖2 BIL 群體兩重復(fù)間SPAD 值差異分析Fig. 2 Differential analysis of SPAD value of BIL population between two replicates at two stages

2.2 初花期和結(jié)鈴期葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值之間的相關(guān)性分析

為研究棉花初花期和結(jié)鈴期的葉綠素含量的關(guān)系， 對初花期和結(jié)鈴期的葉綠素含量SPAD值進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，初花期葉綠素含量與結(jié)鈴期葉綠素含量SPAD 值呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.057，但未達到顯著水平。 這表明該陸?；亟蛔越幌等后w初花期葉綠素含量與生殖生長階段結(jié)鈴期的葉綠素含量的一致性相對較弱，以及對不同時期葉綠素含量進行調(diào)查和QTL 定位的必要性。

2.3 BIL 群體葉綠素含量性狀 （SPAD 值）的QTL 定位

2.3.1 葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值的QTL 分析。由于初花期和盛花期的葉綠素含量指標(biāo)SPAD值以及重復(fù)間存在顯著差異（圖2），因此本研究把2 個時期和2 個重復(fù)的數(shù)據(jù)作為4 個獨立環(huán)境的性狀分別進行定位分析。 根據(jù)構(gòu)建的高密度遺傳圖譜[24]，利用IciMapping 4.1 軟件的BIP 單環(huán)境算法，共檢測到位于A04、A10、A11、D08 和D10 染色體的7 個與葉綠素含量相關(guān)的QTLs（表3），其中在初花期檢測到4 個QTLs，在結(jié)鈴期檢測到3 個QTLs，LOD 值為2.15～2.77，解釋表型變異率為4.86%～5.98%， 加性效應(yīng)為－1.16%～1.15%，其中正效應(yīng)來自海7124 能夠增加葉綠素含量， 負效應(yīng)來自中36 能夠減少葉綠素含量。 通過比較不同時期葉綠素含量相關(guān)QTL 發(fā)現(xiàn)， 初花期葉綠素含量顯著相關(guān)的q-SPAD-A11-1 （位于A11 染色體的86.97 Mb～87.97 Mb） 與結(jié)鈴期葉綠素含量顯著相關(guān)的q-SPAD-A11-2 （位于A11 染色體的83.50 Mb～90.29 Mb）具有較大重疊。 該結(jié)果表明A11 染色體具有1 個穩(wěn)定的調(diào)控葉綠素含量性狀的QTL，反應(yīng)了本研究分析結(jié)果的可靠性。

2.3.2 兩個時期葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值的聯(lián)合QTL 分析。 對初花期和結(jié)鈴期的葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值分析發(fā)現(xiàn)，2 個時期葉綠素性狀的遺傳力分別為66.84%和69.66%（表1）， 即該性狀受環(huán)境因素的影響率超過30%。 為揭示棉花葉綠素含量主效QTL 與環(huán)境的互作效應(yīng)， 本研究將初花期和結(jié)鈴期的葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值用IciMapping 4.1 軟件的MET 模型進行基因型與環(huán)境互作分析。 共檢測到5 個QTLs（q-mSPAD-A11-1、q-mSPAD-D08-1、q-mSPADD10-1、q-mSPAD-D10-2 和q-mSPAD-D10-3） 分布在A11、D08 和D10 染色體（表4），對表型的解釋率為2.34%～2.69%； 其中q-mSPAD-D08-1的加性效應(yīng)值為正效應(yīng)， 其余4 個QTLs 加性效應(yīng)值為負效應(yīng)， 說明輪回親本中36 對該群體的葉綠素含量影響較大。 5 個QTLs 的加性效應(yīng)與環(huán)境互作的LOD 值均小于0.04， 該結(jié)果表明本研究得到與葉綠素相關(guān)的主效QTL 受環(huán)境影響較小。 對BIP 模型獲得的7 個葉綠素含量性狀相關(guān)QTLs（表3）和MET 模型的5 個葉綠素含量性狀相關(guān)QTLs 進行分析（表4），發(fā)現(xiàn)BIP 模型中q-SPAD-A11-2 、q-SPAD-D08-2 和q-SPADD10-1 分別與MET 模型中的q-mSPAD-A11-1、q-mSPAD-D08-1 和q-mSPAD-D10-1 一致。 通過對2 種模型的QTLs 進行整合， 本研究共得到9個與葉綠素含量性狀相關(guān)的QTLs。

表3 葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值單時期的QTL 定位Table 3 Mapping quantitative trait loci of SPAD value of chlorophyll content index in a single state

表4 用MET 模型對2 個時期SPAD 值進行QTL 定位Table 4 QTL mapping i of SPAD value in two stages with MET model

3 討論

葉綠素是植物體重要的光合色素，在植物光能利用中起核心作用。 前人研究表明，植物葉綠素的生物合成過程包含約15 個步驟， 任何1 個步驟的改變都會對葉綠素含量造成影響[25]。 葉綠素復(fù)雜的代謝過程需要大量的基因參與其中，葉綠素含量性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀。 通過對初花期和結(jié)鈴期葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值的表型數(shù)據(jù)分析， 發(fā)現(xiàn)該性狀在2 個時期的遺傳力分別為66.84%和69.66%， 與棉花的纖維長度性狀遺傳力89.57%、 比強度遺傳力82.43%相比較小[26-27]。說明與纖維品質(zhì)等其它數(shù)量性狀相比，葉綠素含量更易受環(huán)境因素的影響。 因此需要收集更多環(huán)境的葉綠素含量表型值才能確保對該性狀定位的準(zhǔn)確性[28]。

本研究利用陸?；亟蛔越幌等后w構(gòu)建的高密度遺傳圖譜對棉花發(fā)育過程中的初花期和結(jié)鈴期葉綠素含量性狀分別進行QTL 定位。 對比前人的研究結(jié)果， 本研究檢測到的q-SPAD-D10-1、q-mSPAD-D10-1 和q-mSPAD-D10-2 與胡鳳萍[29]的芽黃v1，及Song 等[14]、鄭巨云等[17]和Abdelraheem 等[4]的葉綠素含量定位結(jié)果一致，均定位在D10 染色體 （圖3）；q-SPAD-A04-1 與Abdelra heem 等[4]的葉綠素含量相關(guān)QTL 均定位到A04染色體；q-SPAD-A10-1 和q-SPAD-D08-1 與秦鴻德等[3]葉綠素含量相關(guān)QTL 的染色體定位一致（圖3）； 本研究中q-SPAD-D08-2 （48.71 Mb～53.65 Mb）與秦鴻德等[3]對葉綠素含量性狀定位所 得 的qSPAD-2 （ 位 于 標(biāo) 記NAU3499 和NAU1505 之間）重疊（圖3）。 以上結(jié)果表明了本研究定位結(jié)果的可靠性。 此外，本研究在A11 染色體鑒定到與葉綠素含量性狀穩(wěn)定相關(guān)的新位點（q-SPAD-A11-1 和q-SPAD-A11-2）。 該結(jié)果為進一步對葉綠素含量性狀的遺傳解析奠定新的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

圖3 葉綠素含量指標(biāo)SPAD 值的QTL 定位Fig. 3 The QTL mapping of SPAD value of chlorophyll content index

本試驗利用高世代陸?；亟蛔越幌等后w的高密度遺傳圖譜，對初花期和結(jié)鈴期的葉綠素含量進行QTL 定位， 最終獲得9 個葉綠素含量相關(guān)的QTLs， 其中初花期葉綠素含量相關(guān)的q-SPAD-A11-1（86.97 Mb-87.97 Mb）與結(jié)鈴期葉綠素含量相關(guān)的q-SPAD-A11-2（83.50 Mb-90.29 Mb）具有較大的重疊區(qū)間，為進一步的精細定位奠定基礎(chǔ)。