張翔

【摘 要】為探討灰樹花、白樺茸、香菇、云芝真菌多糖的抗氧化性及復(fù)合抗氧化效果，采用水楊酸法及用L16（45） 正交實(shí)驗(yàn)，以羥自由基清除率為評(píng)判依據(jù)，對(duì)多糖進(jìn)行充分優(yōu)化組合，測(cè)定并比較單味多糖和復(fù)合多糖對(duì)羥自由基的清除率。結(jié)果顯示：四種多糖對(duì)羥自由基的清除作用大小為：白樺茸>香菇>灰樹花>云芝;四種真菌粗多糖清除羥自由基組方的L16（45）正交實(shí)驗(yàn)顯示，其復(fù)合多糖的最佳組方為：4. 46mg/mL灰樹花多糖、 4.22mg/mL白樺茸多糖、4.05mg/mL云芝多糖、 2.49mg/mL香菇糖組合?？梢娫谙嗤瑵舛认聫?fù)合多糖對(duì)羥自由基的清除率高于單味多糖清除率之和?；覙浠?、白樺茸、香菇、云芝粗多糖及復(fù)合多糖在體外對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的抑制作用，且相同濃度下復(fù)合多糖的抑制率大于單味多糖。此研究為灰樹花、白樺茸、香菇、云芝真菌粗多糖的應(yīng)用及羥自由基清除劑的研究提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】真菌多糖;抗氧化性;水楊酸法

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1002-8714（2020）09-0002-01

自由基是一類具有高度活性的物質(zhì)，能引起細(xì)胞和細(xì)胞器膜的脂類過氧化損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜功能喪失，是產(chǎn)生疾病的主要原因之一[1]。因此，廣泛地開發(fā)和尋找外源性的自由基清除劑具有重要意義。分子生物學(xué)的發(fā)展使人們逐漸認(rèn)識(shí)到糖及其復(fù)合物分子具有極其重要的生物功能。多糖是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外又一類重要的生物大分子，在控制細(xì)胞的分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、延緩衰老和維持代謝等方面發(fā)揮著重要的作用[2]。

近年來的研究顯示，一種真菌多糖通常對(duì)某一種生理效應(yīng)有明顯作用或效果單一，對(duì)食藥用真菌多糖的研究逐漸向多種多糖復(fù)合生理效應(yīng)的研究方向發(fā)展[3]。過往實(shí)驗(yàn)證明，一些食藥用真菌多糖復(fù)合作用時(shí)，效果比單味多糖更佳，且它們之間的藥理作用呈現(xiàn)協(xié)同性[4]。為此本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，擬以20%～40%含量的灰樹花、云芝、香菇、白樺茸真菌多糖為原料，進(jìn)行抗氧化性及復(fù)合研究。

1 材料與方法

1.1儀器

UV1601紫外可見分光光度計(jì)、101-2BS 電熱鼓風(fēng)干燥箱、AL104型電子分析天平、KQ-5200DE超聲波清洗器、CU420型電熱恒溫水箱、JB-90型清理電動(dòng)攪拌機(jī)。

1.2試劑

乙醇、水楊酸、鹽酸、硫酸亞鐵、30%雙氧水、香菇粗多糖、云芝粗多糖、白樺茸粗多糖、灰樹花粗多糖及其他常規(guī)試劑。其中，多糖的含量分別為香菇33.20%、云芝40.45%、白樺茸42.16%、灰樹花30.36%。

1.3方法和步驟

1.3.1紫外分光光度法測(cè)定真菌多糖羥自由基清除率

1.3.1.1實(shí)驗(yàn)原理

建立Fenton反應(yīng)體系模型，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH（H2O2+Fe2+→OH·+OH-+Fe3+），但由于·OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，就能有效地捕捉·OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。

該物質(zhì)在510nm下有最大吸收，若在此反應(yīng)體系中加入具有清除·OH功能的被測(cè)物，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在相同體積的反應(yīng)體系（0.2mmol/LH2O21mL，6mmol/LFe2+1mL，6mmol/L1mL水楊酸-乙醇溶液）中加入一系列1mL不同濃度的待測(cè)樣品。最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)30min，以超純水：乙醇=3：1的混合溶液為參比，在510nm處測(cè)量各濃度下的吸光度?？紤]待測(cè)溶液本底的吸光值不同，以6mmol/LFe2+1mL，6mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL，待測(cè)溶液1mL和雙蒸水1mL作為待測(cè)溶液的本底吸收值。其清除率計(jì)算公式為：

清除率（I%）=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100%

式中：A0：空白對(duì)照液的吸光度;

Ax：加人待測(cè)溶液后的吸光度;

Ax0：待測(cè)溶液的本底吸收。

1.3.1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1.2.1溶液的配制

①10mg/mL真菌粗多糖溶液：于分析天平上準(zhǔn)確稱量粗多糖成品1.0000g，溶解并定容至100mL容量瓶，搖勻并于超聲波清洗機(jī)中超聲30min;

②7.5、5.0、2.5、1.0mg/mL真菌粗多糖溶液：用吸量管吸取配制好的10mg/mL的粗多糖溶液，用蒸餾水進(jìn)行稀釋，并定容至50mL容量瓶中，搖勻;

36mmol/LFeSO4溶液：于分析天平準(zhǔn)確稱取硫酸亞鐵固體粉末0.4170g，溶解、轉(zhuǎn)移并定容至250mL容量瓶中，搖勻后避光保存;

40.2mmol/LH2O2溶液：用吸量管吸取30%H2O2溶液0.2mL于250mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度并搖勻，避光保存;

56mmol/L水楊酸—乙醇溶液：于分析天平準(zhǔn)確稱取水楊酸0.2097g，用乙醇全部溶解、轉(zhuǎn)移并定容至250mL容量瓶，搖勻。

1.3.1.2.2加樣方法

1.3.2四種多糖復(fù)合后清除羥自由基測(cè)定的原理和方法

本文用水楊酸分光光度法測(cè)定灰樹花、云芝、桑黃、白樺茸粗多糖對(duì)羥自由基的清除率，并以此為依據(jù)，對(duì)其進(jìn)行復(fù)合研究.

1.3.3.1測(cè)定原理和方法同1.3.1.

1.3.3.2灰樹花、香菇、白樺茸、云芝復(fù)合多糖研究的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L16（45）正交實(shí)驗(yàn)測(cè)定灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖對(duì)羥自由基的清除率，進(jìn)行多糖組合用劑量的復(fù)合的組方實(shí)驗(yàn)，四種粗多糖的正交實(shí)驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)如表2。

2 結(jié)果及結(jié)論

2.1灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖對(duì)羥自由基清除率

按1.3.1方法測(cè)定灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖和VC羥自由基的清除率如表3所示，可見該四種多糖具有較強(qiáng)的清除羥自由基的活性，是良好的羥自由基清除劑和抗氧化劑。究其抗氧化作用的機(jī)制，可能是通過提升SOD、CAT、T-AOC水平和降低MDA含量等有關(guān)[5]。

2.1.1灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖的清除羥自由基作用的比較

按1.3.1方法測(cè)定灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖對(duì)羥自由基的清除率，顯示四種多糖的清除羥自由基能力大小為：白樺茸>香菇>灰樹花>云芝，白樺茸、香菇、灰樹花、云芝多糖的最大清除率分別為：82.3%、74.5%、55.9%、52.7%。同樣條件下測(cè)定VC的最大清除率為99.8%。

2.1.2灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖的清除羥自由基作用與VC比較

按1.3.1方法測(cè)定灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖和VC對(duì)羥自由基的清除率，當(dāng)清除率同為50%時(shí)，需要的濃度分別為VC0.359mg/mL，香菇5.074mg/mL，云芝9.500mg/mL，灰樹花8.829mg/mL，白樺茸3.965mg/mL。換算成質(zhì)量，1gVC清除羥自由基的功效需要香菇14.1g或云芝26.5g或灰樹花24.6g或白樺茸11.0g。

2.2多糖復(fù)合研究

2.2.1四種多糖復(fù)合組方正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將四種復(fù)合多糖組方研究的因素水平設(shè)計(jì)進(jìn)行L16（45）正交實(shí)驗(yàn)方案，用1.3.1方法測(cè)定復(fù)合多糖對(duì)羥自由基的清除率，其正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示.

2.2.2四種多糖復(fù)合組方正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析

對(duì)四種多糖復(fù)合多糖的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，其結(jié)果如表5所示。

可得出如下結(jié)論：不同因素水平的影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋篈4>A2>A1>A3，B4>B1>B3>B2，C1>C4>C2>C3，D4>D1>D2>D4;影響因素大小順序?yàn)锽>C>A>D（R），從而初步認(rèn)為最優(yōu)配方組合為A4B4C1D4，即這四種復(fù)合多糖按其多糖含量計(jì)算其最佳組方為：4.46mg/mL灰樹花多糖、4.22mg/mL白樺茸多糖、4.05mg/mL云芝多糖、2.49mg/mL香菇多糖組合;折合30.36%灰樹花、42.16%白樺茸、40.45%云芝、33.20%香菇粗多糖的組方為：10mg/mL灰樹花、10mg/mL白樺茸、1mg/mL香菇、7.5mg/mL云芝粗多糖組合。

2.2.3復(fù)合多糖與四種單味多糖對(duì)羥自由基的清除率比較

在復(fù)合多糖的正交實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)四種多糖的實(shí)測(cè)濃度為：1mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL時(shí)，其對(duì)羥自由基的抑制率分別為：19.1%、28.6%、47.9%、65.9%、72.8%，與同濃度的四種單一多糖對(duì)羥自由基的平均清除率的比較：在1mg/mL時(shí)，四種多糖清除率之和為13.5%，復(fù)合多糖則為19.1%;2.5mg/mL時(shí)，四種多糖清除率之和為23.3%，復(fù)合多糖則為28.6%;5.0mg/mL時(shí)，四種多糖清除率之和為41.2%，復(fù)合多糖為47.9%;7.5mg/mL時(shí)，四種多糖清除率之和為57.5%，復(fù)合多糖為65.9%;10mg/mL時(shí)，四種多糖清除率之和為66.4%，復(fù)合多糖為72.8%。由此可見，等量復(fù)合多糖比四種多糖對(duì)羥自由基清除率之和高，復(fù)合后的生物活性不是一種簡(jiǎn)單的相加關(guān)系，這種作用可能是多糖經(jīng)復(fù)合后產(chǎn)生的協(xié)同和互補(bǔ)作用所致。由此認(rèn)為，選擇具有協(xié)同和互補(bǔ)作用的多糖進(jìn)行優(yōu)勢(shì)組合，可有效的發(fā)揮和提高各種多糖的生物學(xué)活性，并且可在一定范圍內(nèi)減少用量，降低成本，提高功效。

參考文獻(xiàn)

[1] 以蒙醫(yī)學(xué)理論試論氧自由基與線粒體[J].伊拉古等.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志.20120（26）.

[2] 黃芪多糖預(yù)防奶牛乳房炎的研究進(jìn)展[J].沃野千里等.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào).2020（32）.

[3] 復(fù)合多糖抑制紫外線誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞的光老化[J].楊凱業(yè)等.中國(guó)組織工程研究.2019（23）.

[4] 五種真菌的復(fù)合多糖體外抗氧化作用研究[J].于沖等.黑龍江科學(xué).2018（9）.

[5] 中藥多糖抗氧化作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].孟祥云等.中華中醫(yī)藥雜志.2018（33）.