王曉娜,劉曉菲,2*,孫穎,李斐斐,史文嫻

(1.山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，山東 濟南 250355； 2.山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟南 250014; 3.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，山東 濟南 250014)

乳腺癌的發(fā)病機制十分復雜，是最常見的女性惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，乳腺癌現(xiàn)居全球女性惡性腫瘤首位[1]。近年來，其發(fā)病率不斷升高且趨于年輕化[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學與傳統(tǒng)醫(yī)學的結合，中藥在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中有一定的預防和治療作用[3]。其中，Ki67是一種與細胞增殖相關的核抗原，能夠確切反映腫瘤細胞的增殖活性,與乳腺癌的發(fā)展及預后密切相關[4]。P53是目前所知的一種重要的抑癌基因，但其突變會成為癌基因。本研究主要通過免疫細胞化學法和半定量RT-PCR法檢測陽和化巖湯及拆方對Ki67、P53表達的影響，為臨床應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 實驗細胞及材料

1.1 實驗細胞

乳腺癌癌前病變MCF-10AT細胞由上海龍華醫(yī)院陳紅風主任惠贈。

1.2 實驗藥物與試劑

DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，Gibco公司產(chǎn)品;胰蛋白酶粉(Trypsin)、DMSO、MTT，Amresco公司產(chǎn)品;RNA酶，Sigma公司；P53、Ki67一抗，北京博奧森公司產(chǎn)品；即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，均為武漢博士德生物工程有限公司;引物由上海生工生物工程公司合成;其余常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

實驗分組細胞對照組:不加任何處理因素。

中藥制備：陽和化巖湯組由鹿角霜12 g，淫羊藿9 g，白花蛇舌草12 g，山慈菇12 g，三棱9 g，莪術12 g，半夏9 g，浙貝9 g組成。制劑：加入10倍量的水在中藥中，提取揮發(fā)油6 h，將收集的揮發(fā)油另器保存?zhèn)溆茫粚⑺幰簽V過濃縮至1∶1.5(藥材：藥液)，加入乙醇使含醇量達到60%，靜置24 h后取上清液，沉淀部分離心，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮為相對密度1.18(60 ℃)備用。另將揮發(fā)油與吐溫-80混勻，加入上述藥物提取液中，混勻，再加入蔗糖，山梨酸，調節(jié)pH值并用水調整濃度至0.84 g/mL。采用上述水提醇沉法制備各拆方組，溫陽組(鹿角霜12 g，淫羊藿9 g)0.21 g/mL、解毒組(白花蛇舌草12 g，山慈菇15 g)0.27 g/mL、活血組(三棱9 g，莪術12 g)0.21 g/mL、化痰組(半夏9 g，浙貝9 g)0.18 g/mL。他莫昔芬(TAM)制備：將其溶于生理鹽水，濃度為0.03 mg/mL。

1.3 實驗儀器

BB16uv/BB5060uv CO2培養(yǎng)箱，Heraeus公司產(chǎn)品；Axiovert 40倒置相差顯微鏡,德國蔡司公司產(chǎn)品；Elx50型洗板機、ELx808全自動酶標儀，美國Biotek公司產(chǎn)品；FACSCalibur流式細胞儀，美國BD公司產(chǎn)品；LAS-4000型化學發(fā)光及熒光影像分析儀，日本富士公司產(chǎn)品；sgavplus型超純水系統(tǒng)，法國Super-Q plus產(chǎn)品；ClassⅡ2085型超凈工作臺，美國Thermo Forma公司產(chǎn)品；DT5-3型低速自動平衡離心機，北京時代北利離心機有限公司產(chǎn)品；Veriti 96孔型梯度PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品；HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 免疫細胞化學法

2.1.1 細胞分組及造模方法

將MCF-10AT細胞消化吹打制成1×105/mL細胞懸液，在6孔板中進行爬片，分為陽和化巖湯組、及拆方溫陽組、化痰組、活血組、解毒組、三苯氧胺組、空白對照組共7組，研究7組P53、Ki67蛋白表達差異。分別加入30%陽和化巖湯、溫陽組、化痰組、活血組、解毒組及他莫昔芬組藥物，濃度分別為0.84、0.21、0.18、0.21、0.27 g/mL、0.03 mg/mL；對照組加等量生理鹽水。7組共培養(yǎng)72 h 后按SABC 試劑盒說明書進行染色，計算出灰度值陽性表達率(%)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2.1.2 結果判定方法

Ki67陽性細胞在細胞核表達棕黃色顆粒，P53陽性細胞在細胞核表達棕黃色顆粒。高倍鏡下選擇陽性細胞較多的區(qū)域采集3～5個光鏡視野，輸入到HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)內，在相同的背底和倍體條件下選擇相應的參數(shù)，進行計算機完全定量分析。以陽性細胞所占比例的平均值定義為陽性細胞百分比，并將其作為陽性率評定依據(jù)，陽性細胞著色強度用灰度值表示，著色強度越高，灰度值越低，反之，著色強度越低，則灰度值越高。

2.2 半定量RT-PCR法

采用Trizol一步法提取細胞總RNA。取少量總RNA于紫外分光光度計下測定波長260 nm和280 nm的吸光度比值，利用寡聚體DNA260計算RNA濃度，并稀釋至1 g/L。以反轉錄后獲得的cDNA為模板，PCR擴增目的基因。

擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，52.5 ℃持續(xù)1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后1 個循環(huán)后72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存產(chǎn)物。取6 μL 擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，采用Kodak 1D型凝膠自動成像分析系統(tǒng)分析凝膠電泳結果，計算目的基因mRNA的相對含量，實驗重復3次。

表1 引物序列

2.3 統(tǒng)計方法

3 結果

3.1 免疫細胞化學法檢測蛋白表達灰度值

3.1.1 免疫染色結果

空白對照組細胞質和細胞核中P53蛋白表達，呈陽性(+)；實驗組細胞P53蛋白弱表達于細胞質，見圖1?？瞻讓φ战M細胞核中Ki67蛋白強表達，呈陽性(+)；實驗組細胞Ki67蛋白弱表達于細胞核，見圖1～2。

圖1 免疫組化法檢測P53蛋白表達情況(×400)

3.1.2 免疫細胞化學法檢測P53蛋白表達陽性率

P53蛋白表達見表2，陽和化巖湯組及三苯氧胺組與空白對照組比較，P<0.05，具有統(tǒng)計學差異；溫陽組、活血組、化痰組及解毒組與陽和化巖湯組相比，P<0.05，具有統(tǒng)計學差異。

表2 P53蛋白表達陽性率、Ki67蛋白表達灰度值

圖2 免疫細胞化學法檢測Ki67蛋白表達情況(×400)

3.1.3 免疫細胞化學法檢測Ki67蛋白表達灰度值

Ki67蛋白表達灰度值見表2，陽和化巖湯組及三苯氧胺組與空白對照組比較，P<0.05，具有統(tǒng)計學差異；溫陽組、活血組、化痰組及解毒組與陽和化巖湯組相比P<0.05，具有統(tǒng)計學差異。

3.2 RT-PCR檢測P53、Ki67 mRNA表達

RT-PCR檢測P53 mRNA相對表達見表3、圖3，陽和化巖湯組及三苯氧胺組與空白對照組比較(P<0.05)，具有統(tǒng)計學差異；溫陽組、活血組、化痰組及解毒組與陽和化巖湯組相比(P<0.05)，具有統(tǒng)計學差異。

表3 RT-PCR檢測P53 mRNA、Ki67 mRNA相對表達量

注:1.陽和化巖湯組;2.溫陽組;3.活血組;4.化痰組;5.解毒組;6.三苯氧胺組;7.空白對照組

RT-PCR檢測Ki67 mRNA結果見表3、圖4，陽和化巖湯組及三苯氧胺組與空白對照組比較P<0.05，具有統(tǒng)計學差異；溫陽組、活血組、化痰組及解毒組與陽和化巖湯組相比P<0.05，具有統(tǒng)計學差異。

注:1.陽和化巖湯組;2.溫陽組;3.活血組;4.化痰組;5.解毒組;6.三苯氧胺組;7.空白對照組

4 討論

根據(jù)乳腺癌癌前病變的證候特點及臨床表現(xiàn)，該病屬傳統(tǒng)醫(yī)學“乳癖”范疇[5]。其病因多與情志、飲食及勞倦等因素有關，導致肝氣郁結，痰瘀互結或沖任失調，阻于乳絡而發(fā)，出現(xiàn)雙側乳房疼痛、腫塊，并與月經(jīng)周期有關。裴曉華認為本病“毒瘀互結”，可進展為乳腺癌[6]。因此，本病可從溫腎助陽、化痰散結等方面進行辨證治療。

目前，乳腺癌癌前病變的預防及治療主要采用溫陽法[7]。本實驗采用的陽和化巖湯由清代高思敬《外科醫(yī)鏡》中的陽和化巖湯加減而成。方中鹿角霜、淫羊藿溫補腎陽，半夏、浙貝化痰散結，三棱、莪術行氣活血，山慈菇、白花蛇舌草清熱解毒，全方溫腎助陽與化痰散結并用，佐以行氣活血、清熱解毒，攻補兼施?，F(xiàn)代藥理學研究表明，鹿角霜對大鼠乳腺增生有一定的治療作用[8]。淫羊藿苷具有抑制乳腺癌細胞MCF7、MDA-MB-23l等作用[9]。半夏總生物堿對乳腺癌細胞增殖有一定抑制作用[10]。浙貝母總生物堿能夠抑制耐藥腫瘤細胞P-糖蛋白(P-gp)的外排活性,從而降低腫瘤細胞的耐藥性[11]。三棱黃酮(RSF)能夠有效抑制乳腺癌MCF-7的細胞增殖[12]。李文靜[13]等實驗結果表明，莪術油能夠抗大鼠乳腺增生，與改善大鼠紊亂的激素水平有關，殷玉琨[14]等前期實驗證實，莪術油對抑制大鼠乳腺癌癌前病變進一步發(fā)展有一定治療作用。葉蘭[15]等實驗研究證明，三棱與莪術抑制血管內皮細胞增殖，可能與VEGF蛋白表達顯著下降有關。宋舟等實驗研究表明，白花蛇舌草可降低血清中VEGF的含量[16-17]，山慈菇中的秋水仙堿、姜黃素能夠抑制乳腺癌細胞生長增殖以及誘導凋亡，干擾乳腺癌細胞的侵襲及遷移及抗血管生成等作用[18]?，F(xiàn)代研究藥理學研究表明，溫陽化痰法能夠減緩乳腺癌細胞增殖及促進細胞凋亡來抑制癌變進程[3]。

研究表明，細胞核內蛋白Ki67抗原與乳腺癌的增殖與預后相關。Ki67是在細胞周期的活躍階段表達的一種增殖標記[19]，在G1期和S期早期水平較低，在有絲分裂時達到峰值水平，在后期和末期，表達水平急劇下降，它在靜息階段G0期間不表達[20]。相關研究證實，Ki67在健康乳腺組織中低水平表達(<3%)[21]，Ki67的表達在從良性乳腺疾病到導管原位癌再到浸潤性乳腺癌的整個過程中逐漸增加[22]。同時，Ki67與惡性腫瘤呈正相關，蛋白表達越高，癌細胞增殖活性越高，預后越差[23]。

P53是公認的抑癌基因，位于人染色體17p13。它分為野生型與突變型，野生型P53可以參與DNA的修復，抑制癌細胞增殖并促進其凋亡，與細胞周期、血管形成等多個方面有關，但不易被檢測到。研究表明，乳腺癌中P53發(fā)生突變的機率約為25%～30%[24]。突變型P53比野生型P53更穩(wěn)定[25]，突變的p53蛋白可以在攜帶突變基因的癌細胞中積累，許多腫瘤細胞核顯示出p53的強染色，而周圍正常組織中的細胞顯示出弱的或缺失的p53免疫反應性[26]。突變型P53能夠誘導細胞癌變，加快癌細胞增殖，由于突變型半衰期延長，更易被檢測到[27]。

本實驗通過免疫細胞化學法和半定量RT-PCR法檢測陽和化巖湯及拆方對Ki67、P53表達的影響，結果顯示，陽和化巖湯及拆方均能降低Ki67、突變型P53的表達。現(xiàn)代藥理研究表明，陽和化巖湯中的單味中藥對乳腺癌都有一定的抑制或治療作用，本實驗證明，三苯氧胺與陽和化巖湯可減緩腫瘤細胞增殖活性，達到延緩乳腺癌進一步發(fā)展的目的，其機制可能與降低Ki67、突變型P53的表達有關。拆方組對抑制或治療乳腺癌有一定療效，但溫陽化痰、活血解毒的陽和化巖湯療效更有優(yōu)勢，為臨床治療乳腺癌提供了更好的思路與方向。