李英迪 吳祖芳 翁佩芳

(寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800)

果酒是由水果、花卉和草藥等原料釀造而成的酒精飲料。由于酵母菌在果酒發(fā)酵中發(fā)揮不同的作用，現(xiàn)代釀酒工業(yè)已采用多菌種發(fā)酵研究果酒發(fā)酵進程[1]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)普遍應(yīng)用于果酒發(fā)酵和酒精生產(chǎn)，而非釀酒酵母(Non-Saccharomyces cerevisiae)通常通過產(chǎn)生影響葡萄酒香氣和結(jié)構(gòu)的代謝副產(chǎn)物來增加葡萄酒的感官特性[1-2]。近年來，非釀酒酵母在果酒發(fā)酵中的影響已引起學者的廣泛關(guān)注[3-5]。釀酒酵母和非釀酒酵母的混合發(fā)酵能夠提高葡萄酒的品質(zhì)[6-7]。其中，東方伊薩酵母(Issatchenkio orientalis)是一種非傳統(tǒng)的釀酒酵母，最初從熱帶水果和食物中分離出來。I. orientalis具有多種耐受特性(如乙酸、乙醇、鈉鹽、高溫)，而且可以在高脅迫條件下生產(chǎn)低成本生物乙醇[8-10]。前人研究報道了I. orientalis在生物乙醇和琥珀酸生產(chǎn)中對多種脅迫條件的耐受性[11]，但在乙酸脅迫下分子水平上的研究較少，其潛在的耐受機制尚不清楚。

前期果酒發(fā)酵研究獲得了一株風味優(yōu)良的非釀酒酵母I.orientalis(簡寫Io 166)，并從轉(zhuǎn)錄組水平上對Io 166 響應(yīng)乙醇壓力的分子機制進行研究[12]。但鮮見Io 166 對脅迫(如低乙酸和鹽耐受性)相關(guān)的蛋白質(zhì)研究?；诖?lián)質(zhì)譜標簽(tandem mass tags，TMT)的定量蛋白質(zhì)組學已廣泛使用，并被證明是量化蛋白質(zhì)表達水平的可靠方法[13]。本試驗采用TMT技術(shù)研究乙酸脅迫條件下Io 166 的耐受機制，討論一系列功能類別和代謝途徑中差異表達的蛋白質(zhì)，以期了解其在蛋白質(zhì)水平上的耐受機制，在發(fā)酵過程中指導傳統(tǒng)的釀酒酵母，提高耐受乙酸脅迫的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東方伊薩酵母Io 166，由寧波大學食品生物技術(shù)實驗室保存。

胰酶，美國Promega 公司；乙腈，美國Fisher Chemical 公司；三氟乙酸，上海Sigma-Aldrich 公司；甲酸，美國Fluka 公司；碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、三氯乙酸、三乙基碳酸氫銨，美國Sigma 公司；蛋白酶抑制劑，上海Calbiochem 公司；BCA 試劑盒，上海碧云天公司；TMT 試劑盒購于美國Thermo 公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

300 Extend C18 色譜柱，美國Agilent 公司；Easy nLC 1000 液相、NanoDrop 2000C、Acclaim PepMap 100反相預柱、Acclaim PepMap RSLC 反相分析柱、Q ExactiveTMPlus 質(zhì)譜儀，美國Thermo Scientific 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及生長曲線的測定 取實驗室甘油保藏的Io 166 菌種，在酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%瓊脂、2%蛋白胨和2%葡萄糖，pH 值5.5)上劃線分離，于培養(yǎng)箱中30℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑一環(huán)單菌落接種到50 mL YPD 液體培養(yǎng)基(去掉2%瓊脂，pH 值5.5)中，30℃條件下150 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h 后保存于4℃冰箱。取1 mL 已活化的Io 166 種子液接種到100 mL 新鮮的YPD 培養(yǎng)基中，30℃條件下150 r·min-1搖床培養(yǎng)8 h 至生長指數(shù)期中期，然后加入乙酸并使其最終濃度為110 mmol·L-1，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。以未添加乙酸為對照組(CK)，每處理進行3 次生物學重復。每隔2 h 測定培養(yǎng)液的OD600，繪制處理組和對照組Io 166 的生長曲線。

1.3.2 蛋白質(zhì)的提取 稱取適量樣品至液氮預冷的研缽中研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)移到5 mL 離心管中。將4倍體積的裂解緩沖液(8 mol·L-1尿素、1%TritonX-100，10 mmol·L-1二硫蘇糖醇和1%蛋白酶抑制劑，pH值8.0)加入各試驗組樣品中，使用高強度超聲處理器在冰上超聲處理3 次，然后4℃條件下20 000×g離心10 min 以除去剩余的碎片，再用20%冷的三氯乙酸在4℃下沉淀2 h，最后于4℃條件下12 000×g離心3 min，棄去上清液，即得發(fā)酵粗蛋白質(zhì)。提取的粗蛋白質(zhì)用預冷的丙酮洗滌3 次后重新溶解于8 mol·L-1尿素中，并根據(jù)BCA 試劑盒的說明測定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 胰酶酶解 參照王煉煉[14]、李正秀[15]的方法。添加二硫蘇糖醇使蛋白質(zhì)溶液濃度達到5 mmol·L-1，然后于56℃水浴30 min，室溫下用碘乙酰胺避光烷基化15 min，使蛋白質(zhì)溶液最終濃度達到11 mmol·L-1。然后加入100 mmol·L-1四乙基溴化銨稀釋蛋白質(zhì)樣品至尿素濃度小于2 mol·L-1。最后以50∶1的蛋白質(zhì)與胰蛋白酶質(zhì)量比加入胰蛋白酶，酶解過夜后再以1∶100 的胰蛋白酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比，繼續(xù)酶解4 h。

1.3.4 TMT 標記 參照綦丹丹[16]的方法。胰蛋白酶酶解后，將肽段用Strata X C18 SPE 柱(Phenomenex)脫鹽并冷凍真空干燥。將冷凍干燥后的肽在0.5 mol·L-1四乙基溴化銨中重構(gòu)，并按照TMT 試劑盒說明書進行標記(表1)。將TMT 試劑解凍并溶解在乙腈中，然后在室溫下與肽混合溫育2 h，最后脫鹽并冷凍真空干燥。

表1 樣品標記信息Table1 Sample marker information

1.3.5 高效液相色譜法(high performace liquid chromatography，HPLC)分級分離 反相HPLC 高pH值(9.0)條件下將肽段分級，使用300 Extend C18(5 μm×4.6 mm，250 mm)色譜柱。具體操作如下:首先將肽段用8%～32%乙腈(pH 值9.0)梯度在1 h 內(nèi)分級成60 個級分，然后將肽段合成18 個級分并冷凍真空干燥，備用。

1.3.6 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 參照徐王磊[17]的方法。將肽段溶解在HPLC A 相流動相[0.1%∶2%(v/v) 的甲酸和乙腈水溶液]中，分離采用超高效液相EASY-nLC 1000 系統(tǒng)操作。B 相流動相為甲酸和乙腈水溶液(1∶9，v/v)。HPLC 洗脫梯度參數(shù)見表2。肽段經(jīng)超高效液相色譜系統(tǒng)分離、NSI 離子源電離后，進入Q ExactiveTMPlus 質(zhì)譜分析。

表2 高效液相色譜洗脫梯度參數(shù)Table2 HPLC elution gradient parameters

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異表達蛋白的生物信息學分析使用Maxquant 搜索引擎(v.1.5.2.8)處理得到的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(NCBI accession number: GCA＿000764455.1)，增添反庫用來算出任意匹配導致的錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)，同時在數(shù)據(jù)庫中增加常見的污染庫，目的是為了排除污染蛋白對檢測結(jié)果造成的差異。相關(guān)檢索參數(shù)見表3。使用Blast 2 GO 程序和Pathway Tools(E-value≤10-5)對Io 166 蛋白分別進行GO(Gene Ontology)功能注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes)代謝途徑注釋。以差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥1.2 且P≤0.05 作為標準來篩選差異表達蛋白。用STRING 10.5進行蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析差異表達蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。

表3 檢索參數(shù)Table3 Search parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸處理對酵母菌生長的影響

正常培養(yǎng)到8 h 時添加110 mmol·L-1乙酸為處理組，以未加乙酸為對照組，比較在YPD 培養(yǎng)基中的細胞生長。由圖1可知，乙酸加入初期，Io 166 生長受到抑制，但隨著培養(yǎng)時間的延長，Io 166 細胞逐漸適應(yīng)了乙酸脅迫，生長逐漸恢復，說明Io 166 對乙酸脅迫產(chǎn)生了一定的抵抗。

圖1 不同培養(yǎng)條件下Io 166 的生長曲線Fig.1 Growth curves of Io 166 under different culture conditions

2.2 質(zhì)譜質(zhì)控檢測結(jié)果

檢驗所有定性肽段的質(zhì)量偏移(mass error)(圖2-A)，結(jié)果顯示，質(zhì)量偏移以0 作為中軸，且聚集在低于10×10-6的范圍內(nèi)，表明質(zhì)量誤差符合要求。此外，肽段長度大多分布在8 ～20 個氨基酸殘基之間(圖2-B)，符合胰酶消化肽段的規(guī)律，由此說明樣品制備符合要求。對分級脫鹽合并后的組分進行質(zhì)譜分析搜庫，以PSM FDR≤0.01 和Protein FDR≤0.01 為標準進行數(shù)據(jù)篩選，共得到25 407 個肽段，標記效率為98.44%。

2.3 基于定量信息的蛋白質(zhì)聚類分析

圖2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)控檢測結(jié)果Fig.2 Quality control test results of mass spectrometry data

蛋白質(zhì)依據(jù)其定量信息(ratio 值)均分為4 個蛋白組(圖3):Q1(0 ～25%)、Q2(25%～50%)、Q3(50%～75%)和Q4(75%～100%)。根據(jù)這種分類方法，進行下游的聚類分析，包括基于GO 富集的聚類分析，基于蛋白結(jié)構(gòu)域及KEGG 通路的聚類分析。

圖3 蛋白質(zhì)定量信息的分布情況Fig.3 Distribution of protein quantitative information

2.4 乙酸脅迫下Io 166 差異表達蛋白的生物信息學分析

前期研究表明，F(xiàn)C 是基于1.2 ～1.5 倍的變化閾值[18-19]，本試驗使用1.2 倍定義蛋白質(zhì)豐度的顯著變化。根據(jù)標準(FC≥1.2，P≤0.05)，461 個蛋白質(zhì)顯示差異表達，包括327 個上調(diào)蛋白質(zhì)和134 個下調(diào)蛋白質(zhì)。GO 注釋(圖4)和KEGG 分析(圖5)結(jié)果表明，差異表達蛋白主要分布在代謝過程、對刺激的反應(yīng)、細胞器和催化活性中。

圖4顯示了GO 在生物進程、細胞組分和分子功能中的分布，以及每個類別中分布的差異蛋白比例。其中，生物進程中代謝進程34%、細胞進程27%、單一生物進程24%；細胞組分中細胞37%、細胞器23%、細胞膜19%、大分子復合物18%；分子功能中催化活性44%、結(jié)合41%。GO 分類表明，乙酸脅迫明顯影響了代謝進程和催化活性。

圖4 Io 166 差異表達蛋白GO 分類注釋Fig.4 GO classification annotation of differentially expressed proteins in Io 166

差異表達蛋白KEGG 注釋用于直系同源分配，KOBAS 軟件檢測KEGG 通路中差異蛋白的統(tǒng)計富集。KEGG 代謝通路(圖5)顯示了代謝/生物合成途徑中差異蛋白的分布。次生代謝物生物合成、抗生素生物合成、氨基酸生物合成和碳代謝是差異表達蛋白KEGG 主要途徑。其中，氨基酸的生物合成及某些氨基酸的代謝對耐受乙酸起關(guān)鍵作用。過氧化物酶(Ko03781)、糖酵解(Ko00129)和檸檬酸循環(huán)(Ko00164)中的差異表達蛋白存在顯著變化。

2.5 響應(yīng)乙酸脅迫的差異表達蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

由圖6可知，部分關(guān)鍵的差異表達蛋白構(gòu)成一個結(jié)構(gòu)復雜的互作網(wǎng)絡(luò)，通常具有相似功能的蛋白之間進行調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)節(jié)點之間的彩色線表示各種類型的相互作用，與其他蛋白質(zhì)相互作用的蛋白在交互網(wǎng)絡(luò)中很重要。熱激蛋白HSP70 及其伴侶蛋白MDJ1、SSA3、FES1、JAC1、SSC1、SSQ1，HSP40 及其伴侶蛋白YDJ1、APJ1，以 及HSPA1、HSP78、HSP12、HSP60、HSP10、HSP104 顯著上調(diào)，均在響應(yīng)乙酸脅迫中起到關(guān)鍵作用。一些重要的差異蛋白表達信息與谷胱甘肽、抗氧化、硫氧還蛋白、色氨酸、熱激蛋白等相關(guān)，如表4所示。

3 討論

乙酸脅迫后的一個顯著現(xiàn)象是含硫氨基酸生物合成途徑的變化，觀察到谷胱甘肽(GSH)如GSTY 的合成顯著增加，并且誘導了幾種具有抗氧化特性的蛋白質(zhì)的合成。作為細胞內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)代謝的物質(zhì)，GSH 參與三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)及糖代謝，并激活多種酶，從而促進糖類、脂肪和蛋白質(zhì)代謝。此外，GSH 在預防細胞氧化應(yīng)激方面發(fā)揮主要作用，可與蛋白質(zhì)的反應(yīng)性巰基(蛋白質(zhì)谷胱甘肽化)結(jié)合，保護其免受氧化損傷[20]。Rikhvanov 等[21]、Meng 等[22]、Kitichantaropas 等[23]指出硫氨基酸途徑不會被誘導，而是在大多數(shù)應(yīng)激條件下(包括氧化應(yīng)激，滲透壓和熱休克反應(yīng))被抑制。而本研究中GSH 表達與含硫氨基酸(蛋氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)生物合成途徑的酶調(diào)節(jié)顯著增加，表明在乙酸誘導下其存在共同作用機制。硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶作為兩種Yap1p 依賴性蛋白在乙酸脅迫條件下表達量顯著增加，Yap1p 已被證明是酵母適應(yīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[24-26]，在乙酸耐受性中起重要作用。此外，幾種抗氧化劑如PXP9、HYR1、CCP1 也顯著上調(diào)。綜上推斷，GSH(SPE3、HYR1、GSTY2)和硫氧還蛋白(GRX8、AIM32、APD1)對于細胞耐受乙酸起到關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果表明，氨基酸作為主要代謝產(chǎn)物參與許多細胞生物合成和代謝過程；NADH 氧化、精氨酸生物合成和氨基酸代謝途徑顯著變化，與乙酸耐受相關(guān)的代謝物，如脯氨酸、天冬氨酸，在細胞內(nèi)積累保護細胞膜免受乙酸脅迫，這與Greetham 等[27]的研究結(jié)果一致。在釀酒酵母中，Nugroho 等[28]發(fā)現(xiàn)脯氨酸是一種應(yīng)激保護劑，能夠使細胞免受冷凍、干燥、低pH 值和氧化應(yīng)激損害；Liang 等[29]通過敲除有關(guān)脯氨酸生物合成的基因，發(fā)現(xiàn)突變型菌株較野生型菌株對脅迫更敏感，補充脯氨酸或相關(guān)基因可以恢復耐受性，說明脯氨酸在脅迫條件下對細胞有保護作用。本試驗中脯氨酸表達量并未發(fā)生顯著上調(diào)，這可能是由于細胞內(nèi)脯氨酸量需要控制在一定水平內(nèi)以耐受乙酸脅迫并避免副作用，如抑制細胞生長[26]。據(jù)報道，乙酰輔酶A的增加可以使TCA 循環(huán)活化并影響天冬氨酸和谷氨酸的積累[30-31]。本研究中與乙酰輔酶A 相關(guān)的蛋白顯著上調(diào)，同時TCA 循環(huán)活躍，天冬氨酸和谷氨酸代謝增強。此外，Ohta 等[32]研究表明色氨酸是與乙醇抗性相關(guān)的代謝物，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)色氨酸(如PXP9、KGD1)顯著上調(diào)，說明色氨酸耐受乙酸與耐受乙醇的機制一致。

本試驗中，HSP40、HSP78、HSP60、HSP104 和HSP70 及其伴侶蛋白在乙酸脅迫下顯著上調(diào)。Pukszta 等[33]和Uzarska 等[34]指出HSP70 與伴侶蛋白SSQ1 結(jié)構(gòu)類似但功能不同；Sichting 等[35]和Gowda等[36]分別指出HSP70 與伴侶蛋白SSC1、FES1 之間的相互作用，并且蛋白質(zhì)的正確折疊或某些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性需要兩個及以上的分子伴侶參與發(fā)揮作用。因此，需要誘導多種伴侶蛋白以響應(yīng)乙酸脅迫。由于乙酸擾亂蛋白質(zhì)構(gòu)象并導致變性蛋白質(zhì)的積累，因此多聚蛋白質(zhì)介導的蛋白質(zhì)修復功能對酵母耐受乙酸至關(guān)重要。此外，Von 等[37]研究表明HSP78 是線粒體基質(zhì)伴侶蛋白，可形成寡聚體并在線粒體耐熱性方面與HSP70 協(xié)同作用。HSP78 可防止錯誤折疊蛋白質(zhì)的組合和蛋白質(zhì)聚集體的再溶解。Doyle 等[38]指出HSP104 熱休克蛋白，作為解聚酶起作用，與HSP40 和HSP70 結(jié)合，重新折疊并重新激活變性或成簇蛋白。Song 等[39]指出線粒體基質(zhì)中的HSP60 是必不可少的，對于許多線粒體酶復合物的正確形成是必要的。對于某些線粒體靶向蛋白質(zhì)，HSP60 在進入線粒體基質(zhì)后與多肽相互作用并催化這些多肽重折疊。本研究中由乙酸脅迫誘導的許多HSP 基因存在于細胞質(zhì)和線粒體中，上調(diào)的HSP 相關(guān)基因影響多個位置的細胞功能，包括促進轉(zhuǎn)錄因子的核功能，改善代謝過程中ATP 能量的產(chǎn)生，維持涉及生物合成的酶功能和分解代謝。

圖6 乙酸脅迫下Io 166 蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The interaction network of proteins under acetic acid stress in Io 166

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，乙酸脅迫初期對Io 166 生長具有一定的抑制作用，但隨著培養(yǎng)時間的延長，抑制作用減弱，表明Io 166 對乙酸產(chǎn)生了一定的耐受性。蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，乙酸脅迫下，Io 166 細胞中GSH 的合成增加，具有抗氧化特性的幾種蛋白質(zhì)上調(diào)，氨基酸作為主要代謝產(chǎn)物，其生物合成和代謝過程差異表達；HSP 在蛋白質(zhì)折疊和重折疊中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果從蛋白質(zhì)組學角度解釋了Io 166 耐受乙酸的原因，不僅對理解其分子機制具有重要意義，而且對提高果酒釀造微生物耐受乙酸發(fā)酵具有潛在的應(yīng)用價值。