喬永剛 陳 亮 王勇飛 崔芬芬 曹亞萍 賀嘉欣 賈孟君 宋 蕓

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)，是一類(lèi)具有特殊結(jié)構(gòu)，能夠與真核基因順式作用元件特異性互作，調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，又稱(chēng)反式作用因子[1-2]。典型的轉(zhuǎn)錄因子都具有核定位信號(hào)區(qū)、DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、寡聚化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)等[3-4]。DNA 單鋅指結(jié)合蛋白(DNA-binding one zinc finger，Dof)，是一類(lèi)植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，一般含有200 ～400 個(gè)氨基酸殘基，其N(xiāo)-末端有一個(gè)具有52 個(gè)堿基、高度保守的C2-C2單鋅指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中高度保守的4 個(gè)Cys 殘基能夠與1 個(gè)Zn 共價(jià)結(jié)合，從而保證Dof 蛋白的活性；其C-末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的氨基酸具有高度的多樣性，能夠通過(guò)與多種蛋白質(zhì)相互結(jié)合，從而激活或抑制下游基因的表達(dá)，因此，Dof 蛋白的功能會(huì)因C-端氨基酸的差異而表現(xiàn)不同的功能[5-7]。

1993年，Yanagisawa[8]從玉米中鑒定出第一個(gè)Dof轉(zhuǎn)錄因子命名為ZmDof1 蛋白，ZmDof1 蛋白能夠與C4植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，調(diào)控植物的光合作用。此外，Yang 等[9]發(fā)現(xiàn)ZmDof1 蛋白還可以負(fù)調(diào)控花粉特異性表達(dá)基因Zm401 的表達(dá)來(lái)控制花粉的發(fā)育；Kurai 等[10]將ZmDof1 基因轉(zhuǎn)化至擬南芥中，發(fā)現(xiàn)PEPC和PPDK基因被激活表達(dá)，且植株的氮含量增多；Qi 等[11]研究表明，ZmDof3 基因在玉米胚乳發(fā)育過(guò)程中可以調(diào)控淀粉和糊粉粒的形成，從而影響玉米的淀粉含量。擬南芥中的Dof 轉(zhuǎn)錄因子(OBP1)具有調(diào)控細(xì)胞分裂過(guò)程的作用，它可以縮短擬南芥植物的細(xì)胞周期[12]。OBP1還可以與AtDof2.3 共同作用調(diào)控CYCD3 蛋白基因的表達(dá)，當(dāng)該基因過(guò)量表達(dá)時(shí)，可以縮短細(xì)胞周期，減少細(xì)胞的個(gè)數(shù)，從而引起植株矮化。在擬南芥中過(guò)表達(dá)GmDof4 和GmDof11 基因時(shí)，擬南芥種子中的脂質(zhì)含量升高，而種子的貯藏蛋白基因CRA1 下調(diào)表達(dá)[13]。同時(shí)，在大豆中過(guò)表達(dá)GmDof11 基因，提高了大豆種子的含油量，降低了蛋白質(zhì)的含量，然而對(duì)脂肪酸的組成幾乎沒(méi)有影響[14]。Shaw 等[15]研究表明31 個(gè)小麥Dof基因中有17 個(gè)基因能夠響應(yīng)干旱脅迫，但只有TaDof14 和TaDof15 兩個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，表明大部分的Dof基因可能負(fù)調(diào)控植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性；TaDof5、TaDof17 和TaDof19 在熱脅迫中隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下調(diào)表達(dá)；鹽脅迫下，只有TaDof1 在莖中上調(diào)表達(dá)，其余基本沒(méi)有明顯的變化，TaDof1 可能與抗鹽適應(yīng)性有關(guān)。李輝等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CsDof1 和CsDof2參與了茶樹(shù)的低溫響應(yīng)；Jung 等[17]和Ma[18]等發(fā)現(xiàn)白菜在受到低溫和高溫環(huán)境脅迫時(shí)，BraDof基因的表達(dá)量會(huì)迅速升高。此外，關(guān)于Dof基因參與各種生理過(guò)程的研究也有很多報(bào)道，例如植物的滲透調(diào)節(jié)[19]、植物生物與非生物脅迫響應(yīng)[20]、葉片極性的調(diào)控[21]以及種質(zhì)遺傳多樣性研究[22]等。

金銀花(Lonicera japonicaThunb.)屬忍冬科植物，其干燥花蕾是重要的傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解毒的功效。Dof基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用，但是目前鮮見(jiàn)關(guān)于金銀花Dof基因家族相關(guān)研究的報(bào)道。本研究從金銀花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中分離得到Dof基因，并對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、同源比對(duì)、Motif、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式進(jìn)行了深入分析，以期為進(jìn)一步研究金銀花Dof 轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 金銀花Dof 基因家族的篩選及序列分析

金銀花的數(shù)據(jù)來(lái)源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院藥用植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于4℃低溫脅迫下0、3、12 和48 h 葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。擬南芥和水稻的Dof 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列來(lái)源于PlantTFDB 轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)。利用BioEdit 在金銀花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索金銀花中潛在的Dof基因，篩選的E 值為e-5。利用SMART 和Pfam驗(yàn)證Dof基因的保守結(jié)構(gòu)域，CDD 篩選并剔除不完整的金銀花Dof基因。利用在線(xiàn)Expasy 生物信息學(xué)工具對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析。

1.2 金銀花Dof 家族蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

對(duì)篩選出的Dof 家族蛋白序列，利用CELLO v.2.5(http:/ /cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。

1.3 金銀花Dof 家族蛋白同源比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域(Motif)分析

利用DNAMAN 8.0 對(duì)金銀花、擬南芥和水稻的Dof 蛋白序列金銀同源比對(duì)，并用MEME(http:/ /meme-suite.org/tools/meme)在線(xiàn)工具對(duì)Dof 家族蛋白進(jìn)行Motif 預(yù)測(cè)，TBtools 對(duì)Dof 蛋白潛在的保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行繪制。

1.4 金銀花Dof 家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA7 軟件中的Muscle 對(duì)篩選出的完整的Dof 家族蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，基于鄰近法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，每個(gè)計(jì)算點(diǎn)計(jì)算1 000 次，將得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)通過(guò)iTOL 進(jìn)行美化處理得到矢量圖。

1.5 金銀花Dof 基因在低溫下的表達(dá)特征分析

以篩選的ACT2/7 和c49672.graph＿c0 為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(PCR 程序及引物信息見(jiàn)表1和表2)。采用2-△△ct法計(jì)算基因的表達(dá)量，利用R 語(yǔ)言繪制基因表達(dá)熱圖。

表1 RT-qPCR 反應(yīng)程序Table1 RT-qPCR protocol

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花Dof 基因家族蛋白理化性質(zhì)分析

以擬南芥和水稻Dof 蛋白為探針序列，通過(guò)本地BLAST 共篩選出25 個(gè)Dof基因，經(jīng)SMART、Pfam 及CDD 驗(yàn)證和鑒定后共得到11 條具有完整Dof基因結(jié)構(gòu)的序列。利用Expasy 對(duì)篩選出11 個(gè)具有完整C2-C2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行理化性質(zhì)進(jìn)行分析。由表3可知，11 條具有完整Dof基因編碼的蛋白大小有所差異，氨基酸個(gè)數(shù)為157～492；理論等電點(diǎn)為5.45～9.48，表明不同的Dof 蛋白在不同的微環(huán)境中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能；脂肪系數(shù)為42.36～68.29，不穩(wěn)定指數(shù)均高于40，平均親疏水性(grand average of hydropathy，GRAVY)均小于0，表明所有的Dof 蛋白均屬于不穩(wěn)定親水性蛋白。

表2 候選內(nèi)參基因引物信息Table2 Information of candidate reference gene

表3 金銀花Dof 基因家族Table3 Dof gene family of Lonicera japonica Thunb.

2.2 金銀花Dof 蛋白家族基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用CELLO v.2.5 對(duì)金銀花Dof 蛋白家族基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。由表4可知，所有的Dof 蛋白都定位在細(xì)胞核，說(shuō)明其作為轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游基因的表達(dá)[23]。而LjDof2 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中有定位到，LjDof7 蛋白在細(xì)胞膜外也有定位，說(shuō)明不同金銀花Dof家族成員在低溫環(huán)境下，不同細(xì)胞器發(fā)揮的功能有所差異。

表4 金銀花Dof 蛋白亞細(xì)胞定位Table4 Protein subcellular localization of Lonicera japonia Thunb. Dof protein

2.3 金銀花Dof 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)DNAMAN 對(duì)篩選的金銀花Dof 蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，提取其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，由圖1可知，Dof蛋白結(jié)構(gòu)域非常保守，都具有C2-C2鋅指結(jié)構(gòu)，說(shuō)明Dof基因在進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性。

圖1 金銀花Dof 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Conservative domain analysis of Lonicera japonia Thunb. Dof protein

2.4 金銀花Dof 蛋白Motif 分析

通過(guò)MEME 對(duì)擬南芥、水稻和金銀花的Dof 蛋白進(jìn)行Motif 分析，選用了8 個(gè)Motif，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。所有的Dof 蛋白都具有Motif1，即Motif1 為所有Dof 蛋白的核心序列。此外，不同的Dof 蛋白具有不同數(shù)目和類(lèi)型的Motif，可能不同的Dof 蛋白在生物體內(nèi)發(fā)揮的功能也有所不同。

2.5 Dof 家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA7 軟件對(duì)篩選的金銀花11 個(gè)Dof 轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥、水稻的Dof 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行序列同源比對(duì)，并參照Moreno-Risuerno 等[23]的方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。結(jié)果表明，金銀花中沒(méi)有A 和B 類(lèi)的Dof 轉(zhuǎn)錄因子，LjDof1 和LjDof3 屬于C 類(lèi)，LjDof8 和LjDof9 屬于D 類(lèi)，LjDof6、LjDof7 和LjDof11 屬于E 類(lèi)，且這7 個(gè)Dof 轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥的同源性較高；LjDof4和LjDof10 屬于F 類(lèi)，LjDof2 和LjDof5 屬于G 類(lèi)，它們與水稻的同源性較高。

2.6 金銀花Dof 基因家族在低溫脅迫下的表達(dá)分析

圖3 Dof 蛋白中的保守基序Fig.3 Conserved motif in Dof protein

利用金銀花低溫脅迫不同時(shí)間下的RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，找到候選的11 個(gè)Dof基因在不同時(shí)期的基因表達(dá)量的FPKM值，對(duì)其取對(duì)數(shù)值進(jìn)行均一化處理并利用R 語(yǔ)言繪制相應(yīng)的熱圖(圖5)。結(jié)果顯示，11 個(gè)Dof基因在低溫下的表達(dá)模式分為三類(lèi):第一類(lèi)LjDof2 和LjDof7 在整個(gè)低溫過(guò)程中先下調(diào)后上調(diào)表達(dá)；第二類(lèi)為L(zhǎng)jDof1、LjDof5、LjDof4 和LjDof11 呈現(xiàn)先持續(xù)上調(diào)后下調(diào)表達(dá)；LjDof3、LjDof6、LjDof8、LjDof9 和LjDof10 與第二類(lèi)表達(dá)模式相同，但在后期其表達(dá)量低于0 h。

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果得到的Dof基因的表達(dá)模式，第一類(lèi)Dof 轉(zhuǎn)錄因子在低溫12 h 后表達(dá)量急劇升高；第二類(lèi)Dof 轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫3 h 和12 h 高量表達(dá)，低溫脅迫12 h 后表達(dá)下調(diào)，但是其在低溫脅迫48 h 的表達(dá)量仍高于0 h；而第三類(lèi)Dof 轉(zhuǎn)錄因子與第二類(lèi)表達(dá)模式相似，但是其在低溫脅迫48 h 的表達(dá)量低于0 h，利用RT-qPCR 對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖6。定量結(jié)果幾乎與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相對(duì)應(yīng)，從而驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。但是也存在差異，LjDof7 的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果呈現(xiàn)相反的表達(dá)情況，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與實(shí)際的基因表達(dá)情況也可能存在差異。通過(guò)RT-qPCR 驗(yàn)證結(jié)合其表達(dá)模式，推測(cè)LjDof2、LjDof4、LjDof5、LjDof7 和LjDof11 可能參與了金銀花對(duì)低溫的響應(yīng)。

圖4 Dof 蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Dof protein family

3 討論

研究表明，Dof基因參與植物的光合作用、滲透調(diào)節(jié)、葉片的極性以及脅迫響應(yīng)等[24]。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多物種的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，Dof 轉(zhuǎn)錄因子在許多模式植物中得到了鑒定和分離，不同物種的Dof基因數(shù)目差異較大，大豆[25]、大白菜[17]、玉米[26]、擬南芥[27]、水稻[27]和火炬松[23]分別鑒定得到Dof基因78、76、54、36、30 和8 個(gè)，但是，關(guān)于金銀花Dof 轉(zhuǎn)錄因子家族的功能研究鮮見(jiàn)報(bào)道，基于二代測(cè)序技術(shù)，研究金銀花Dof 轉(zhuǎn)錄因子家族成為一種可能。

本研究基于金銀花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共篩選了11 個(gè)Dof候選基因，對(duì)其結(jié)構(gòu)域和Motif 分析發(fā)現(xiàn)，其均包含完整的C2-C2單鋅指結(jié)構(gòu)，這與蔡曉鋒等[28]和張雪等[24]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明Dof 轉(zhuǎn)錄因子家族在物種進(jìn)化過(guò)程中較為保守。系統(tǒng)及進(jìn)化發(fā)育分析結(jié)果顯示，金銀花中的Dof 轉(zhuǎn)錄因子家族擬南芥和水稻有所差異，沒(méi)有A 和B 類(lèi)的Dof 轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)篩選的11 個(gè)LjDof基因在低溫脅迫不同時(shí)期下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)11 個(gè)LjDof基因在低溫下的表達(dá)模式分為三類(lèi):第一類(lèi)Dof 轉(zhuǎn)錄因子可能在金銀花對(duì)低溫的適應(yīng)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，這類(lèi)Dof基因的表達(dá)模式 與GmDof2、GmDof4、GmDof5、GmDof6、GmDof16、GmDof18 和GmDof19 在高溫脅迫下的表達(dá)情況一致[29]；第二類(lèi)Dof 轉(zhuǎn)錄因子可能在低溫初期植物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，這類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子與GmDof1、GmDof2、GmDof3 和GmDof10 在應(yīng)對(duì)低溫的表達(dá)情況一致[29]；而第三類(lèi)Dof 轉(zhuǎn)錄因子與第二類(lèi)表達(dá)模式相似，但是其在低溫脅迫后期對(duì)低溫的響應(yīng)減弱，可能在后期表達(dá)受到抑制。而RT-qPCR 結(jié)果顯示，這些基因在植物中的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)模式基本一致。綜合轉(zhuǎn)錄組和定量結(jié)果，推測(cè)LjDof2、LjDof4、LjDof5、LjDof7 和LjDof11 基因可能在植物對(duì)低溫的持續(xù)適應(yīng)過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。

圖5 低溫脅迫下金銀花Dof 基因的表達(dá)模式Fig.5 Expression model of Dof gene in Lonicera japonica Thunb. under low temperature stress

圖6 低溫脅迫下金銀花Dof 基因的表達(dá)水平Fig.6 Expression level of Dof gene in Lonicera japonica Thunb. under low temperature stress

4 結(jié)論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共篩選了11 個(gè)具有完整C2-C2單鋅指結(jié)構(gòu)的Dof基因序列。系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析結(jié)果顯示，金銀花中的Dof基因分為5 類(lèi)，但是未包含擬南芥所有類(lèi)型的Dof基因，表明金銀花Dof 轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化過(guò)程中存在基因的缺失現(xiàn)象。對(duì)篩選的11 個(gè)Dof基因在低溫脅迫不同時(shí)期下的表達(dá)模式及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析，發(fā)現(xiàn)LjDof2、LjDof4、LjDof5、LjDof7 和LjDof11 可能在金銀花對(duì)低溫的適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究為進(jìn)一步研究金銀花Dof 轉(zhuǎn)錄因子的功能提供了理論基礎(chǔ)，后續(xù)可以通過(guò)分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因等相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該基因?qū)χ参镌诘蜏孛{迫下的調(diào)控，輔助探究金銀花對(duì)低溫的適應(yīng)機(jī)制。