鄭曼曼，王 超，沈仁芳

(1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室(中國科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

在中國，酸性土壤(pH＜5.5)總面積約2.18 億km2，主要分布在南方熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。酸性土壤中，磷缺乏是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一，在酸性紅壤區(qū)尤為明顯[2]。盡管土壤中存在大量的磷，但是植物能夠吸收利用的有效磷比例卻很低[3]，主要歸因于酸性土壤中磷極易與Fe3+和Al3+結(jié)合形成難溶態(tài)磷酸鹽，以及被固定到有機物中[4]。提高土壤磷庫中難溶性磷素的活化利用是節(jié)約磷肥資源和提高酸性土壤生產(chǎn)潛力的重要途徑。解磷微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，是土壤難溶性磷活化和形態(tài)轉(zhuǎn)化的主要驅(qū)動者[5-6]。發(fā)揮解磷微生物功能是緩解土壤缺磷的一個有效途徑[3]。通過分泌磷酸酶，降解植酸鹽、磷脂等含磷有機化合物，釋放可溶性磷酸鹽是土壤解磷微生物的一個重要功能[7]。磷酸酶活性是反映土壤有機磷礦化潛力的一個重要指標(biāo)，根據(jù)其最適pH 分為酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)[8]。ACP 和ALP 是非特異性磷酸水解酶，能夠水解許多正磷酸單酯(植酸除外)以獲取正磷酸鹽[9]。目前已經(jīng)克隆出了編碼ACP 的基因phoC[10]和編碼ALP 的基因phoD[11]。這些解磷微生物功能基因的克隆為檢測環(huán)境中解磷菌種類、豐度、分布狀況和群落結(jié)構(gòu)組成提供了有效手段。

一些農(nóng)藝措施，比如碳酸鈣廣泛應(yīng)用于酸性土壤改良[12]。施用碳酸鈣能夠顯著降低土壤酸度[13]，增加作物產(chǎn)量[14]。Wang 等[13]研究表明，酸性土壤中添加碳酸鈣能夠顯著增加細菌16S rRNA 基因豐度，主要原因是碳酸鈣降低了土壤酸毒害和鋁毒害水平。Acosta-Martínez 和Tabatabai[15]指出碳酸鈣施用可增加微生物數(shù)量和多樣性及土壤酶活性。在土壤-植物系統(tǒng)中，碳酸鈣還通過改善植物生長和根際環(huán)境，間接影響根際微生物。植物根際環(huán)境變化可影響微生物功能、豐度和群落組成[16]。然而，碳酸鈣添加對酸性土壤中解磷微生物，特別是對作物根際解磷微生物的影響還關(guān)注較少。

鑒于解磷微生物在土壤磷轉(zhuǎn)化和有效性方面的重要作用，本研究通過設(shè)置碳酸鈣添加試驗，分析酸性土壤中玉米根際和非根際磷酸酶活性及phoC和phoD基因豐度，并探究它們與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，以期闡明碳酸鈣和根際作用對酸性紅壤磷酸酶活性和解磷微生物豐度的影響。

1 材料方法

1.1 試驗材料和設(shè)計

盆栽試驗所用酸性紅壤采自江西省鷹潭市農(nóng)田，土壤基本理化性質(zhì)為pH 4.38，有機質(zhì) 16.79 g/kg，全氮 0.58 g/kg，全磷 0.39 g/kg，全鉀 10.62 g/kg，有效磷 6.37 mg/kg。試驗時每盆裝土1.50 kg，并施用0.20 g/kg磷酸二氫鉀和0.50 g/kg硫酸銨作為基肥。試驗設(shè)置了不添加碳酸鈣(CK)、每千克土添加0.3 g碳酸鈣(Ca-0.3)和0.5 g 碳酸鈣(Ca-0.5)3 個碳酸鈣水平處理，同時設(shè)置了各處理未種植物的對照(作為非根際土壤)。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。試驗在人工氣候生長室進行，光照 14 h(30℃)，光照強度為400 μmol/(m2·s)，黑暗10 h(25℃)，相對濕度為65%。玉米品種鄭單958 為試驗材料，種植植物處理每盆播種10 粒玉米種子，土壤含水量保持在20%(w/w)。玉米地上部長到1 cm 時間苗，每盆定植3 棵幼苗。自間苗之日起，進行為期3 周的培養(yǎng)。

1.2 植物樣品采集和元素測定

收獲時測量玉米株高，玉米樣品分別收集根系和地上部，用蒸餾水沖洗后于105℃殺青，隨后70℃烘干至恒重，稱重。地上部樣品粉碎，經(jīng)H2SO4-H2O2消煮后用凱氏定氮儀(Hanon K9860)測定氮含量；經(jīng)HNO3消煮后，用ICP-AES(IRIS-Advantage，Thermo Elemental，MA，USA)檢測磷、鉀和鈣元素含量。

1.3 土壤樣品采集和土壤理化性質(zhì)測定

采用抖根法收集根際土壤，未種植玉米的土壤為非根際土。土壤樣品采集后分3 份保存：用于提取DNA 的土壤樣品放置于 -20℃ 冰箱；用于測定土壤磷酸酶活性的土壤放置于4℃冰箱；其余土壤經(jīng)風(fēng)干、研磨后用于測定土壤理化性質(zhì)。土壤pH 按照土水質(zhì)量比1∶2.5 振蕩后，用pH 計測定；土壤全碳(TC)和全氮(TN)采用CNS 元素分析儀測定；土壤銨態(tài)氮(NH-N)和硝態(tài)氮(NO-N)采用氯化鉀浸提-流動分析儀法測定；土壤中全磷(TP)、全鉀(TK)、有效磷(AP)、速效鉀(AK)、交換性鈣(ECa)測定方法詳見《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[17]。土壤酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)活性測定參照Tabatabai[18]描述的方法。

1.4 土壤DNA 提取和基因豐度測定

采用DNA 試劑盒(FastDNA SPIN Kit for soil)提取土壤DNA。解磷微生物功能基因phoC和phoD擴增的通用引物分別為phoc-A-F1(5′-CGGCTCCT ATCCGTCCGG-3′)/phoc-A-R1(5′-CAACATCGCTTT GCCAGTG-3′)[10]和ALPS-F730(5′-CAGTGGGACGA CCACGAGGT-3′)/ALPS-R1101(5′-GAGGCCGATCG GCATGTCG-3′)[11]。基因豐度采用LightCycler 480 實時PCR 系統(tǒng)(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)測定。實時熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)體系為10 μl，包含1 μl DNA 溶液、0.4 μl 正向引物、0.4 μl反向引物、5 μl SYBR Premix ExTaq(Takara Bio，Inc.，Janpan)和3.2 μl 滅菌水。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。為了獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，目的基因phoC和phoD片段分別連接到pMD19-T 載體(Takara，Dalian，China)上，并用Escherichia coliDH5α 完成轉(zhuǎn)化。經(jīng)篩選、測序驗證后，采用質(zhì)粒提取試劑盒(Takara，Dalian，China)提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒用ddH2O 進行10 倍梯度稀釋，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線?；騪hoC和phoD的PCR 擴增效率分別為98.2%(R2= 0.99)和105.5%(R2= 0.98)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2007，統(tǒng)計分析使用軟件 SPSS20.0。根際與非根際之間顯著性差異采用T 檢驗；不同處理之間顯著性差異采用Duncan 檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson 分析。作圖使用軟件SigmaPlot 10.0。

2 結(jié)果

2.1 碳酸鈣對玉米生長和土壤理化性質(zhì)的影響

Ca-0.3 和Ca-0.5 處理下玉米株高和生物量均顯著高于CK，并顯著增加了地上部氮、磷、鉀和鈣的吸收量(表1)。碳酸鈣添加顯著提高非根際土壤pH和NO-N、AP、ECa 含量，但降低NH-N 含量(表2)。碳酸鈣添加顯著提高根際土壤NO-N、AP、ECa含量，但顯著降低NH-N 和AK 含量。根際土壤中TC 和NO-N 含量顯著高于非根際土壤，但土壤pH和NH-N、AK、ECa 含量顯著低于非根際土壤。

表1 碳酸鈣處理下玉米生長性狀及地上部元素含量Table 1 Maize growth characteristics and N, P, K, Ca contents in maize shoots under CaCO3 treatments

表2 碳酸鈣處理下根際和非根際土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of non-rhizosphere and rhizosphere soils under CaCO3 treatments

2.2 酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性

在CK、Ca-0.3 和Ca-0.5 處理樣品中非根際土壤ACP 活性(單位：pNP，mg/(kg·h))分別為63.79 ± 4.42、63.05 ± 4.87 和57.09 ± 3.69，明顯低于根際土壤(分別為81.46 ± 3.50、80.73 ± 7.58 和71.01 ± 9.09)，且在CK 和Ca-0.3 處理中差異達顯著水平(P＜0.01 或P＜0.05)(圖1A)。然而，非根際或根際土壤ACP 活性在不同碳酸鈣處理間均無顯著差異(圖1A)。非根際土壤ALP 活性隨碳酸鈣用量的增加而增加，且Ca-0.5 處理顯著高于前兩個碳酸鈣處理(圖1B)，但在根際土壤中各碳酸鈣處理間無顯著影響。各碳酸鈣處理根際土壤ALP 活性均顯著高于非根際土壤(P＜0.01 或P＜0.05)(圖1B)。

圖1 碳酸鈣處理下根際和非根際土壤ACP(A)和ALP(B)活性Fig. 1 Activities of ACP (A) and ALP (B) of non-rhizosphere and rhizosphere soils under CaCO3 treatments

2.3 解磷微生物功能基因phoC 和phoD 拷貝數(shù)

碳酸鈣添加未顯著影響根際和非根際土壤phoC基因拷貝數(shù)(圖 2A)。雖然根際作用增加了phoC基因拷貝數(shù)，但是統(tǒng)計上差異未達到顯著水平。圖2B 顯示，phoD基因拷貝數(shù)隨碳酸鈣用量的增加而增加，Ca-0.5 處理顯著高于CK。3 個碳酸鈣處理根際土壤phoD基因拷貝數(shù)均顯著高于非根際土壤(P＜0.01)。線性回歸分析表明，ACP 活性與phoC基因拷貝數(shù)在非根際(P＜0.01)和根際(P＜0.05)土壤中均呈顯著正相關(guān)(圖3A)。ALP 活性與phoD基因拷貝數(shù)相關(guān)性在根際土壤中達到顯著水平(P＜0.05)(圖3B)。

圖2 碳酸鈣處理下非根際和根際土壤phoC(A)和phoD(B)基因拷貝數(shù)Fig. 2 phoC (A) and phoD (B) gene copy numbers of non-rhizosphere and rhizosphere soils under CaCO3 treatments

圖3 土壤磷酸酶活性與phoC(A)和phoD(B)基因拷貝數(shù)相關(guān)性Fig. 3 Correlations between soil phosphate activities and phoC (A) and phoD (B) genes copy numbers

2.4 土壤磷酸酶活性和基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

非根際土壤中，ACP 活性與TK 呈顯著負相關(guān)，而phoC基因拷貝數(shù)與NH-N、TP 含量呈顯著正相關(guān)；ALP 活性與土壤pH、ECa 含量呈顯著正相關(guān)，與NH-N 含量呈顯著負相關(guān)，而phoD基因拷貝數(shù)與NO-N、ECa 含量呈顯著正相關(guān)(表3)。根際土壤中，phoC基因拷貝數(shù)與NO-N 含量呈顯著負相關(guān)，phoD基因拷貝數(shù)與pH 及AP、ECa 含量均呈顯著正相關(guān)，而與NH-N 含量呈顯著負相關(guān)(表3)。

表3 土壤中磷酸酶活性、phoC 和phoD 基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)的Pearson 相關(guān)分析Table 3 Pearson correlations between phosphate activities, phoC, phoD gene copy numbers and soil physicochemical properties

3 討論

土壤酶參與養(yǎng)分循環(huán)，并反映土壤微生物活動[8]。解磷微生物能夠通過分泌磷酸酶參與土壤有機磷礦化，提高土壤磷素有效性。Acosta-Martínez 和Tabatabai[15]研究表明碳酸鈣施用顯著增加土壤pH 和ALP 活性，但是降低ACP 活性。類似地，本研究中碳酸鈣添加顯著提高土壤ALP 活性和phoD基因拷貝數(shù)，表現(xiàn)出降低ACP 活性和phoC基因拷貝數(shù)的趨勢(圖1 和圖2)，這可能與碳酸鈣對土壤pH 的提高作用有關(guān)。兩種磷酸酶產(chǎn)生主要取決于外界環(huán)境pH，ACP 在酸性土壤中較多，而中性或堿性土壤中ALP 較為常見[19]。非根際土壤ACP 和ALP 活性分別與pH 呈負相關(guān)和正相關(guān)(表3)，充分證明這個結(jié)果。與Dick 等[8]研究一致，酸性土壤ACP 活性顯著高于ALP(圖1)，表明酸性土壤中ACP 在礦化有機磷方面起主導(dǎo)作用。

土壤酶活性對土壤管理引起的土壤理化性質(zhì)變化很敏感，并且不同類型酶的敏感程度存在明顯差異[20]。本研究中，碳酸鈣添加顯著影響非根際土壤ALP 及非根際和根際土壤phoD基因拷貝數(shù)(圖1B 和2B)，但對ACP 活性和phoC基因拷貝數(shù)影響不顯著(圖1A 和2A)。Acosta-Martínez 和Tabatabai[15]發(fā)現(xiàn)土壤ALP 活性相較于ACP 更易受碳酸鈣的影響。磷酸酶活性和基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)間相關(guān)分析也表明，ALP 活性與phoD基因拷貝數(shù)更易受土壤理化因子的影響(表3)，因此，ACP 和ALP 對碳酸鈣的響應(yīng)差異也支持了先前研究。磷酸酶是一類誘導(dǎo)酶，磷缺乏能夠誘導(dǎo)植物根系和微生物分泌磷酸酶和促進磷酸酶活性增加，而磷酸酶的形態(tài)又與土壤pH 密切相關(guān)[8-9]。ALP 對碳酸鈣響應(yīng)強于ACP，證明碳酸鈣能夠促進土壤微生物生長，尤其是phoD基因相關(guān)的微生物種類。這可能歸因于ALP 并不來自于植物，僅由微生物分泌[9]。此外，楊艷菊等[21]報道土壤中鈣離子含量顯著影響解磷微生物的生長。本研究發(fā)現(xiàn)非根際ALP 活性和phoD基因拷貝數(shù)與ECa 含量呈顯著正相關(guān)，這也部分解釋了ALP 活性與phoD基因拷貝數(shù)對碳酸鈣響應(yīng)強于ACP 活性和phoC基因拷貝數(shù)。此外，Zaheer 等[22]研究表明，鈣離子能夠激發(fā)ALP 活性，添加鈣離子(0.5 ～ 2.0 mmol/L)能夠使ALP 活性提升約2.5 倍。鈣離子的存在在很大程度上保護ALP 免受其他金屬離子的抑制作用，說明磷酸酶對鈣離子有較高的親和力。

根際是植物能量和物質(zhì)代謝最活躍的區(qū)域。植物根系釋放的各種分泌物可以選擇性地刺激微生物種群生長，因此，根際土壤形成了獨特的微生物群落[23-24]。在各種環(huán)境條件下，已經(jīng)廣泛報道了根際土壤微生物豐度和活性遠高于非根際土壤[13,25]，其中解磷微生物的分布表現(xiàn)出強烈的根際效應(yīng)[26]。植物生長引起根系分泌物增加和養(yǎng)分吸收增強能夠刺激根際微生物的解磷功能[10,27]。在本研究所有處理中根際土壤phoC、phoD基因拷貝數(shù)和磷酸酶活性均高于非根際土壤，尤其是phoD基因拷貝數(shù)和ALP 活性(圖1 和圖2)，表明根際土壤具有較高的解磷微生物活性，并對磷酸酶活性有促進作用。這強烈地暗示根際區(qū)域可能存在更高水平的生物解磷作用。

4 結(jié)論

綜上所述，ACP 在酸性土壤有機磷礦化方面強于ALP，其活性不易受碳酸鈣處理的影響。雖然碳酸鈣和根際效應(yīng)均影響解磷微生物功能和豐度，但是根際效應(yīng)更為強烈，主要表現(xiàn)在增加了磷酸酶活性和phoD基因豐度。因此，調(diào)控作物生長對促進酸性土壤解磷微生物功能具有重要指導(dǎo)意義。