閔凱凱，何向陽(yáng)，吳倩怡，張冠友，胡 鋒，李輝信，焦加國(guó)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤酶主要來(lái)源于高等植物根系、土壤動(dòng)物以及土壤微生物的分泌作用，是一類具有高度催化作用的蛋白質(zhì)。研究表明，水解酶通過(guò)作用于有機(jī)化合物中的糖苷鍵、脂鍵、肽鍵、酸酐鍵等來(lái)降解淀粉、纖維素、半纖維素、多肽物質(zhì)、幾丁質(zhì)、磷酸酯類等物質(zhì)，將大分子有機(jī)化合物分解為能容易被土壤微生物利用和植物吸收的小分子化合物[1]。鑒于土壤水解酶可以催化降解土壤有機(jī)質(zhì)，在參與土壤碳、氮、磷轉(zhuǎn)化的過(guò)程中起重要作用，因此被用作指示土壤質(zhì)量的指標(biāo)，已被國(guó)內(nèi)外眾多科研工作者應(yīng)用于研究不同類型的生態(tài)系統(tǒng)[2]。土壤酶活性受到土壤中物理、化學(xué)和生物因素的影響，是多種因素交互作用的結(jié)果[3]。此外由于土壤酶的專一性和高度敏感性，使土壤酶活性表現(xiàn)出一定的空間和時(shí)間差異性，同時(shí)酶活性的大小能夠表征其所控制的酶促反應(yīng)的方向和強(qiáng)度，所以通過(guò)研究酶活性一方面能比較不同區(qū)域的土壤環(huán)境特征，評(píng)價(jià)不同區(qū)域的土壤質(zhì)量水平，另一方面能夠反映土壤碳、氮和磷等物質(zhì)轉(zhuǎn)化的情況，進(jìn)而評(píng)估土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的周轉(zhuǎn)，揭示酶活性在調(diào)節(jié)土壤營(yíng)養(yǎng)供給方面的重要作用。

土壤微生物作為土壤水解酶的主要生產(chǎn)者，其在合成分泌酶的過(guò)程中以成本效益為基本原則[3]，即根據(jù)外界養(yǎng)分物質(zhì)或底物數(shù)量的變化減少某些土壤酶分泌，同時(shí)增加另一些土壤酶的分泌，即微生物根據(jù)外界環(huán)境變化和對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不同，進(jìn)而調(diào)控不同類型土壤酶的活性變化，用最小的消耗獲取最大的利益。施用肥料帶入到土壤中的大量速效養(yǎng)分是調(diào)控酶活性的重要影響因子，可引發(fā)土壤微生物的負(fù)反饋調(diào)節(jié)來(lái)影響微生物分泌不同酶的能力，從而控制酶活性[10]。有機(jī)肥中的物質(zhì)組成復(fù)雜，在改善土壤質(zhì)量方面有著突出的作用，能刺激微生物生長(zhǎng)并引發(fā)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，同時(shí)微生物分泌土壤酶催化土壤中各種物質(zhì)的合成與降解過(guò)程，直接或間接影響著生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與功能的發(fā)揮[11]。

為研究土壤水解酶對(duì)不同施肥響應(yīng)的差異以及進(jìn)一步驗(yàn)證養(yǎng)分對(duì)酶活性的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，本研究采用室內(nèi)培養(yǎng)方法，通過(guò)分別施加有機(jī)、無(wú)機(jī)肥，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)碳氮磷水解酶活性，利用冗余分析(redundancy analysis，RDA)以及非度量多維度尺度分析(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)[12]進(jìn)一步揭示土壤水解酶活性與速效養(yǎng)分的反饋關(guān)系以及土壤水解酶活性響應(yīng)差異的影響因素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤采自江西省紅壤生態(tài)研究所典型農(nóng)田旱地紅壤(R)；牛糞商品有機(jī)肥(C)為牛糞與稻殼按質(zhì)量比 3.5︰1(碳氮比為 25)堆制而成；化肥(NPK)為尿素、磷酸二氫鈣、氯化鉀。土壤與有機(jī)肥的基本性狀見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)材料的基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of tested materials

1.2 試驗(yàn)處理

本試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)：①紅壤+牛糞有機(jī)肥(R+C)；②紅壤+化肥(R+NPK)；③紅壤不添加肥料(對(duì)照，R)。

1.3 材料預(yù)處理與培養(yǎng)采樣

將土壤樣品與商品有機(jī)肥過(guò)20 目網(wǎng)篩，按照C 3 g/kg (干土)的標(biāo)準(zhǔn)添加牛糞有機(jī)肥，化肥的添加量按照所添加有機(jī)肥中的氮磷鉀含量等量加入。調(diào)整土壤含水率至田間持水量的60%(按照干基計(jì)算含水率)。將混合后的土壤分裝于培養(yǎng)瓶中，放置在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周加水保持含水率不變。分別在5、30 和90 d 進(jìn)行破壞性采樣。

采樣時(shí)將土壤混合均勻后，一部分土壤樣品存放于4 ℃ 冰箱用于土壤酶活性、土壤基礎(chǔ)呼吸、可溶性有機(jī)碳和速效氮(銨態(tài)氮和硝態(tài)氮)等指標(biāo)測(cè)定，另一部分土壤樣品風(fēng)干后過(guò)篩用于土壤pH、有效磷的測(cè)定。

1.4 分析方法

土壤基本性狀采用常規(guī)方法測(cè)定[13]。土壤pH：1︰2.5(土︰水，m︰V)，pH 計(jì)(HANNA，HI2221)測(cè)定；有效磷：HCl-NH4F 提取，鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤速效氮使用2 mol/L KCl 提取，連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定(SEAL-AA3，德國(guó))。

新疆晨曦椒業(yè)有限公司采購(gòu)部經(jīng)理石峰國(guó)向與會(huì)的農(nóng)戶介紹了公司在收購(gòu)辣椒時(shí)所關(guān)注的要點(diǎn)，以及如何提高辣椒的品質(zhì)和價(jià)值。他指出，焉耆是晨曦生物重要的辣椒色素產(chǎn)區(qū)，這離不開(kāi)政府和各方力量的支持。好的品種+好的管理+好的肥藥+機(jī)械化規(guī)?；N植，辣椒就能達(dá)到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)和高收益。同時(shí)也希望，在新疆辣椒（色素）全產(chǎn)業(yè)鏈聯(lián)盟的各個(gè)環(huán)節(jié)的幫助下，共同將新疆的辣椒產(chǎn)業(yè)做大做強(qiáng)。

可溶性有機(jī)碳，使用純水提取，總有機(jī)碳分析儀(Elementar Vario EL III，德國(guó))測(cè)定。土壤呼吸采用培養(yǎng)法，氣相色譜法測(cè)定。

土壤水解酶活性測(cè)定采用微孔板熒光法[14-15]。利用熒光物質(zhì)4-羥甲基-7-香豆素(MUB)共軛物質(zhì)作為測(cè)定底物，接種土壤懸液至96 孔微孔板中，測(cè)定具有代表性酶活性，包括4 種參與碳轉(zhuǎn)化的酶(α-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-葡萄糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶)，2 種參與氮轉(zhuǎn)化的酶(亮氨酸氨基肽酶、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)和1 種參與磷轉(zhuǎn)化的酶(磷酸酶)，用每小時(shí)每克樣品的基質(zhì)轉(zhuǎn)化率表示樣品酶活性(nmol/(g·h))。

總酶活性(total enzyme activities，TEA)[16]，該指標(biāo)的構(gòu)建消除不同酶活性的類別、量綱及大小的影響來(lái)指示土壤總體酶活性水平，計(jì)算公式如下：

式中：Ei為單一酶活性的測(cè)定值。i代表不同類型酶，本研究共測(cè)定7 種酶(n= 7，即i=1,…,n)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用重復(fù)測(cè)量方差分析評(píng)價(jià)不同施肥方式、培養(yǎng)時(shí)間及兩者交互的影響，并用Tukey HSD 方法進(jìn)行多重比較。為評(píng)估酶活性對(duì)不同環(huán)境的響應(yīng)情況，將酶活性的原始數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)(log10)轉(zhuǎn)化后，計(jì)算每種酶的相對(duì)比例，用于非度量多維尺度分析。冗余分析用于檢驗(yàn)處理、酶活性和理化性質(zhì)三者之間的關(guān)系，以及不同處理之間的差異性。數(shù)據(jù)分析及繪圖均使用R software (version 3.5.0)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示(表2)，土壤添加有機(jī)肥(R+C)或化肥(R+NPK)后對(duì)土壤pH、土壤呼吸、可溶性有機(jī)碳、速效氮、有效磷有極顯著的影響(P＜0.001)。此外，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)土壤呼吸、可溶性有機(jī)碳、速效氮、有效磷有顯著影響。處理與時(shí)間的交互對(duì)土壤呼吸、速效氮也有顯著影響。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間下，添加有機(jī)肥或化肥對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)影響的重復(fù)測(cè)量方差分析Table 2 Repeat ANOVAs on effects of adding organic amendment or chemical fertilizer on soil properties under different incubation times

與對(duì)照相比，有機(jī)肥能顯著提高土壤pH，而化肥則顯著降低土壤pH(P＜0.05)；3 個(gè)處理在不同采樣時(shí)間的pH 并沒(méi)有發(fā)生顯著變化(表3)。在5 d 時(shí)，有機(jī)肥能顯著提高土壤呼吸速率，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種促進(jìn)作用逐漸減弱，到30 d 時(shí)各處理間無(wú)顯著性差異。有機(jī)肥處理在每個(gè)采樣時(shí)間的可溶性有機(jī)碳含量均顯著高于其他處理；隨著時(shí)間增加，可溶性有機(jī)碳含量逐漸降低，在90 d 時(shí)相對(duì)于5 d，有機(jī)肥、化肥和對(duì)照處理的可溶性有機(jī)碳含量分別下降8.68%、28.18%、38.87%。化肥處理在每個(gè)采樣時(shí)間均保持最高的速效氮含量，在90 d 時(shí)相對(duì)于5 d，有機(jī)肥、化肥和對(duì)照處理的速效氮含量分別升高162.53%、35.26%、122.84%。有機(jī)肥、化肥處理與對(duì)照處理相比，在3 個(gè)采樣時(shí)間均能顯著提高有效磷含量，且隨培養(yǎng)時(shí)間增加，有效磷含量有升高的趨勢(shì)，在90 d 時(shí)相對(duì)于5 d，有機(jī)肥、化肥處理和對(duì)照處理有效磷含量分別升高23.47%、42.84%、35.01%(表3)。

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間下，添加有機(jī)肥或化肥對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響Table 3 Effects of adding organic amendment or chemical fertilizer on soil properties under different incubation times

2.2 不同施肥處理對(duì)土壤酶活性影響

土壤水解酶活性的重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果(表4)顯示：施肥處理對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶活性沒(méi)有顯著影響，但培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其有顯著影響；此外，處理與時(shí)間的交互對(duì)木聚糖酶活性有顯著影響。處理、時(shí)間以及處理與時(shí)間的交互對(duì)α-1,4-葡萄糖苷酶活性均有顯著影響，以上4 種土壤酶主要與土壤碳轉(zhuǎn)化有關(guān)。處理、處理與時(shí)間的交互對(duì)亮氨酸氨基肽酶活性有顯著影響，處理、時(shí)間分別對(duì)β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性有顯著影響，這兩種土壤酶與土壤氮轉(zhuǎn)化有關(guān)。磷酸酶活性與土壤磷轉(zhuǎn)化有關(guān)，處理與時(shí)間分別顯著影響其活性。處理、時(shí)間及處理與時(shí)間的交互對(duì)總酶活性均有顯著影響。

表4 土壤酶活性的重復(fù)測(cè)量方差分析Table 4 Repeat ANOVAs results (F values and Probability level) of soil hydrolase activities

從圖1 結(jié)果可以看出，參與碳轉(zhuǎn)化的水解酶中，β-1,4-葡萄糖苷酶活性最高、其次為纖維素酶，木聚糖酶和α-1,4-葡萄糖苷酶活性較低。β-1,4-葡萄糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶這3 種水解酶活性對(duì)施肥響應(yīng)不敏感，前2 次采樣時(shí)期處理間均無(wú)顯著性差異，只是90 d 時(shí)添加有機(jī)肥處理的這3 種酶活性與對(duì)照相比顯著降低，與無(wú)機(jī)肥處理相比無(wú)顯著差異；且無(wú)機(jī)肥處理與對(duì)照間也無(wú)顯著性差異。然而，α-1,4-葡萄糖苷酶活性對(duì)不同施肥處理具有相反的響應(yīng)特征；前2 個(gè)時(shí)期，施加有機(jī)肥顯著增加了α-1,4-葡萄糖苷酶活性，而后又顯著低于對(duì)照處理；但化肥處理在5 d 時(shí)與對(duì)照沒(méi)有明顯差異，而后的2 個(gè)時(shí)期則顯著低于對(duì)照處理。這表明α-1,4-葡萄糖苷酶活性對(duì)施肥的敏感性較強(qiáng)，且對(duì)施加有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥的響應(yīng)不同。

氮轉(zhuǎn)化的水解酶中，亮氨酸氨基肽酶顯著高于β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性。從總的趨勢(shì)看，施用有機(jī)肥提高了2 種氮轉(zhuǎn)化酶的活性，但僅在30 d和90 d 時(shí)對(duì)β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性增加顯著；而施用無(wú)機(jī)肥則降低了2 種氮轉(zhuǎn)化酶的活性，在30 d 和90 d 時(shí)對(duì)亮氨酸氨基肽酶活性降低達(dá)顯著水平，且顯著低于有機(jī)肥處理。說(shuō)明亮氨酸氨基肽酶對(duì)化肥較為敏感，且活性受到抑制；而β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶對(duì)有機(jī)肥較為敏感，且活性得到促進(jìn)。

參與磷轉(zhuǎn)化的水解酶活性也表現(xiàn)出對(duì)不同施肥具有不同的響應(yīng)特征。與對(duì)照相比，施用有機(jī)肥在整個(gè)培養(yǎng)階段都降低了磷酸酶的活性，并顯著低于無(wú)機(jī)肥處理；而無(wú)機(jī)肥處理總體上并未影響磷酸酶的活性(只有中期30 d 時(shí)，顯著低于對(duì)照)。

用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的幾何平均數(shù)來(lái)表示總酶活性。圖1 結(jié)果顯示，施加化肥處理總酶活性在中后期2 次采樣中都顯著低于對(duì)照，而有機(jī)肥處理總酶活性與對(duì)照基本持平，表明有機(jī)肥在保持土壤酶活和功能穩(wěn)定性方面有重要作用。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間下，添加有機(jī)肥或化肥對(duì)土壤酶活性的影響Fig. 1 Effects of organic amendment or chemical fertilizer on soil hydrolase activities

為明確7 類土壤水解酶對(duì)不同施肥處理的響應(yīng)是否有差異，使用經(jīng)過(guò)計(jì)算相對(duì)比例后的酶數(shù)據(jù)進(jìn)行NMDS 分析(圖2)。結(jié)果顯示：NMDS 排序的stress值為0.036 5，小于0.1, 表明排序效果良好；相似性檢驗(yàn)(ADONIS)的結(jié)果說(shuō)明處理和時(shí)間均顯著影響土壤水解酶活性(處理：R2=0.533 2***，時(shí)間：R2=0.344 7***)。

相似性檢驗(yàn)(ANOISM)能夠比較不同肥料處理之間的差異大小(R2＞0，表明處理之間存在差異)，在5、30 和90 d 時(shí)，R2值在0.72 ～ 0.99 間浮動(dòng)，P值為0.008 ～ 0.014。說(shuō)明3 個(gè)培養(yǎng)時(shí)間下各施肥處理的水解酶差異顯著。同時(shí)結(jié)合圖2 中不同處理點(diǎn)位置的相對(duì)遠(yuǎn)近，處理之間距離越遠(yuǎn)，酶活性變化的差異越大，且不同處理在圖中的位置不同也說(shuō)明各處理中不同酶的活性變化是不同的。

此外，不同土壤酶在圖中的位置是根據(jù)加權(quán)平均值計(jì)算得來(lái)，其位置離中心點(diǎn)(0, 0)越遠(yuǎn)且靠近坐標(biāo)軸，說(shuō)明該酶對(duì)坐標(biāo)軸的貢獻(xiàn)越大，也說(shuō)明施肥對(duì)其活性的影響越大，例如α-1,4-葡萄糖苷酶(AG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)和木聚糖酶(XYL)偏離中心點(diǎn)較遠(yuǎn)，同時(shí)各施肥處理在圖中的位置與土壤酶的位置越接近說(shuō)明該酶在相應(yīng)處理中的值越大。進(jìn)一步表明不同施肥處理之間的酶活性差異主要來(lái)源于AG 和LAP 的貢獻(xiàn)，這與圖1 中的結(jié)果完全一致(相較于對(duì)照處理，有機(jī)肥處理的AG 和LAP 酶活性明顯增加，而化肥處理的明顯下降)。在圖1 中，與對(duì)照相比，有機(jī)肥處理的磷酸酶活性顯著降低，而化肥處理的無(wú)變化，這與圖2 的結(jié)果一致。以上結(jié)果說(shuō)明土壤水解酶對(duì)不同施肥處理的響應(yīng)程度并不一致，這其中α-1,4-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶響應(yīng)最明顯，其次為磷酸酶與木聚糖酶。

2.3 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果(表5)顯示，土壤總酶活性僅與土壤pH、土壤呼吸有正相關(guān)關(guān)系。在參與碳轉(zhuǎn)化的4 種酶中，α-1,4-葡萄糖苷酶與土壤pH、土壤呼吸具有顯著正相關(guān)關(guān)系，而與速效氮含量有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；β-葡萄糖苷酶與pH 有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與速效氮為顯著正相關(guān)關(guān)系；纖維素酶與土壤pH、可溶性有機(jī)碳有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；木聚糖酶僅與土壤呼吸有顯著正相關(guān)關(guān)系；對(duì)于兩種參與氮轉(zhuǎn)化的酶來(lái)說(shuō)，亮氨酸氨基肽酶僅與土壤呼吸有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶與可溶性有機(jī)碳、有效磷有顯著正相關(guān)關(guān)系；參與磷轉(zhuǎn)化的磷酸酶與速效氮呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而與其他土壤理化指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖2 土壤酶活性的非度量多維尺度分析(NMDS)Fig. 2 NMDS plot of soil hydrolase activities

表5 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between soil hydrolase activities and soil properties

采用冗余分析方法，進(jìn)一步揭示不同土壤水解酶活性的相對(duì)變化情況與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系(圖3)。結(jié)果顯示，前兩個(gè)限制軸(PC1 和PC2)能解釋水解酶活性總變異的52.52%。其中第一軸可解釋水解酶活性變異的32.26%，以土壤pH、可溶性有機(jī)碳、土壤呼吸和速效氮以及α-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-葡萄糖苷酶和磷酸酶對(duì)第一軸的貢獻(xiàn)最大。第二軸可解釋水解酶活性變異的20.26%，且以亮氨酸氨基肽酶、木聚糖酶為主要貢獻(xiàn)因子。不同肥料對(duì)土壤酶活性及理化性質(zhì)的影響較大，3 個(gè)處理分別位于3 個(gè)象限中。有機(jī)肥明顯提高土壤可溶性有機(jī)碳含量、土壤呼吸強(qiáng)度以及土壤pH；化肥明顯提高土壤速效氮含量，降低土壤pH，同時(shí)α-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶活性在有機(jī)肥處理中提高，在化肥處理中活性降低(圖1，表3)

3 討論

在本研究中并不是所有土壤水解酶都對(duì)肥料有強(qiáng)烈的響應(yīng)(表3)。只有參與碳轉(zhuǎn)化的α-1,4-葡萄糖苷酶，參與氮轉(zhuǎn)化的亮氨酸氨基肽酶、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶以及參與磷轉(zhuǎn)化的磷酸酶和總酶活性對(duì)不同的施肥處理有著顯著的響應(yīng)(表3，圖1)。以往的研究表明[2-4]：土壤酶活性與土壤速效養(yǎng)分含量存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，即當(dāng)土壤中速效養(yǎng)分含量升高時(shí)，相應(yīng)的酶活性就降低。

圖 3 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的冗余排序圖Fig. 3 Redundancy analysis ordination showing relation between soil hydrolase activities and soil physicochemical properties

在本研究中，有機(jī)肥處理的α-1,4-葡萄糖苷酶活性在30 d 之前增加，這與榮勤雷等[17]研究結(jié)果一致，即有機(jī)肥或有機(jī)肥與化肥配施能提高土壤α-1,4-葡萄糖苷酶活性，因而并不符合負(fù)反饋調(diào)節(jié)的假設(shè)。這可能是因?yàn)橛袡C(jī)肥提高了土壤環(huán)境的pH(R2=0.55**)，接近酶促反應(yīng)的最適pH，同時(shí)可能帶入一定數(shù)量的底物，從而促進(jìn)了α-1,4-葡萄糖苷酶活性的提高。但在90 d 時(shí)有機(jī)肥處理的α-1,4-葡萄糖苷酶活性顯著低于對(duì)照處理，可能是由于微生物利用α-1,4-葡萄糖苷酶水解的產(chǎn)物用于自身的生長(zhǎng)代謝(添加有機(jī)肥的處理土壤呼吸明顯提高)，底物被大量消耗，沒(méi)有充足的底物刺激α-1,4-葡萄糖苷酶，致使其活性下降。此外，化肥的添加明顯抑制α-1,4-葡萄糖苷酶活性，這與前人研究結(jié)果不一致[18]，可能與試驗(yàn)條件不一致有關(guān)，在本試驗(yàn)中該酶活性受土壤pH 的影響較其他碳轉(zhuǎn)化酶大?；侍砑痈淖兞送寥拉h(huán)境的pH，偏離了α-1,4-葡萄糖苷酶的最適pH，因此酶活性降低，同時(shí)土壤pH 降低使微生物數(shù)量減少，對(duì)碳源的需求相應(yīng)減少[19-20]。此外在5 d 和30 d 時(shí)，β-1,4-葡萄糖苷酶、纖維素酶和木聚糖酶活性對(duì)施肥無(wú)響應(yīng)，而在90 d 時(shí)有一定的下降趨勢(shì)，說(shuō)明這3 種酶在本試驗(yàn)條件下對(duì)肥料添加的響應(yīng)不敏感，表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。相關(guān)性分析結(jié)果也顯示，β-1,4-葡萄糖苷酶、纖維素酶活性和木聚糖酶活性分別與速效氮、可溶性有機(jī)碳和土壤呼吸速率有顯著的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明碳氮轉(zhuǎn)化酶復(fù)雜的耦聯(lián)關(guān)系

本研究中，對(duì)于碳轉(zhuǎn)化酶來(lái)說(shuō)，負(fù)反饋調(diào)節(jié)的假設(shè)并不能完全解釋土壤酶活性變化。值得注意的是，4 種參與碳轉(zhuǎn)化的酶活性范圍并不一致：β-1,4-葡萄糖苷酶活性最大(約200 ～ 400 nmol/(g·h))，其次是纖維素酶活性(約100 ～ 200 nmol/(g·h))，最后是α-1,4-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活性(約25 ～ 125 nmol/(g·h))，一定程度說(shuō)明β-1,4-葡萄糖苷酶仍然是參與土壤碳轉(zhuǎn)化的主要酶，即使它對(duì)不同肥料添加未有明顯的響應(yīng)，一般情況下，β-1,4-葡萄糖苷酶由于被土壤膠體保護(hù)，所以其活性相對(duì)穩(wěn)定[21]。

亮氨酸氨基肽酶、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶對(duì)不同肥料的響應(yīng)明顯不同(圖1)。亮氨酸氨基肽酶可水解蛋白質(zhì)，能夠從多肽的 N 端水解亮氨酸和其他疏水氨基酸[22]。有機(jī)肥處理一定程度上提高了亮氨酸氨基肽酶和β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性，但與對(duì)照相比并沒(méi)有全部達(dá)到顯著差異，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)肥能增加酶所作用的底物從而間接提高酶活性[23]，但底物在有機(jī)肥中的數(shù)量可能較低，提高其活性的作用不明顯；相反化肥處理的亮氨酸氨基肽酶活性顯著降低，可能是由于速效氮含量的顯著增加(表3)抑制了該酶活性，表現(xiàn)出一定的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶用來(lái)指示土壤中幾丁質(zhì)物質(zhì)的降解情況[24]，幾丁質(zhì)是土壤中重要的有機(jī)氮過(guò)渡庫(kù)[25]，研究表明不同生態(tài)系統(tǒng)β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性有千倍之差[5]，表現(xiàn)出對(duì)不同生態(tài)系統(tǒng)的特異性[26]。本研究中化肥與有機(jī)肥的添加，一定程度提高了β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性(5 d、30 d)，其活性變化范圍遠(yuǎn)低于亮氨酸氨基肽酶，說(shuō)明在土壤中亮氨酸氨基肽酶在氮轉(zhuǎn)化過(guò)程中起主導(dǎo)作用。此外，有機(jī)肥處理的有效磷含量顯著提高，對(duì)應(yīng)磷酸酶活性顯著下降，表現(xiàn)出一定的負(fù)反饋調(diào)節(jié)現(xiàn)象，添加化肥的處理也有相同的現(xiàn)象，有效磷作為磷酸酶的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子在大多數(shù)研究中都較為普遍[4]。

從酶活性結(jié)果得知(圖1)，與對(duì)照相比，有機(jī)肥處理在3 個(gè)采樣時(shí)間的總酶活性并沒(méi)有顯著變化，同時(shí)添加化肥的處理在5 d 時(shí)總酶活性也沒(méi)有明顯差異。而NMDS 分析結(jié)果顯示(圖2)，在5 d 時(shí)，化肥、對(duì)照處理與有機(jī)肥處理大致分成兩簇出現(xiàn)，并且隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，三者的差異逐漸變大。一定程度上說(shuō)明化肥相對(duì)于有機(jī)肥在影響土壤酶活性上存在一定的滯后現(xiàn)象，同時(shí)也表明雖然總酶活性無(wú)明顯變化，但在有機(jī)肥處理中，不同酶活性的相對(duì)分配隨培養(yǎng)時(shí)間增加有了明顯的響應(yīng)差異。這一方面可能是由于酶作用的底物數(shù)量不斷發(fā)生變化[27]，酶活性與底物濃度一般符合米氏動(dòng)力學(xué)方程，底物濃度的不同影響酶活性的大?。涣硪环矫嬗捎诿傅暮铣珊馁M(fèi)大量能量和物質(zhì)，自然選擇使土壤微生物遵循用最少的營(yíng)養(yǎng)獲得最大效益的“成本效益原則”[3]，以及遵守一定的化學(xué)計(jì)量平衡[28]。土壤微生物按照這些原則，根據(jù)環(huán)境中已有的資源重新分配不同酶的活性，同時(shí)不改變總酶活性，來(lái)滿足微生物自身生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求。而化肥處理在5 d 時(shí)總酶活性與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，隨后顯著降低，化肥強(qiáng)烈改變土壤pH(表3)，使土壤環(huán)境不利于酶的催化反應(yīng)過(guò)程，導(dǎo)致總酶活性的不斷降低。

研究表明土壤酶活性受到溫度、pH 和重金屬等因素的影響[2-6]。本研究中土壤pH 與α-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-葡萄糖苷酶、纖維素酶、磷酸酶都有顯著相關(guān)性。磷酸酶與土壤性質(zhì)均有顯著的相關(guān)關(guān)系。冗余分析中，5 個(gè)環(huán)境因子能夠解釋酶活性總變異的52.52%，模型擬合度R2=0.337 4***，達(dá)到極顯著水平，其中土壤pH 的貢獻(xiàn)最大，土壤pH 與可溶性有機(jī)碳對(duì)土壤酶活性影響最大。說(shuō)明土壤pH 與可溶性有機(jī)碳是影響土壤酶活性的關(guān)鍵因子，這與前人的研究結(jié)果一致[29]。同時(shí)，土壤酶活性對(duì)土壤環(huán)境的變化響應(yīng)敏感，使其能較好地指示土壤肥力或土壤健康變化。

4 小結(jié)

在室內(nèi)培養(yǎng)沒(méi)有植物和土壤動(dòng)物等干擾的條件下，有機(jī)肥并沒(méi)有提高土壤總酶活性，而化肥則明顯降低土壤總酶活性，這一定程度表明有機(jī)肥在保持土壤功能穩(wěn)定和健康方面有重要作用。由于土壤養(yǎng)分狀況不同以及土壤微生物的反饋，參與土壤碳氮磷水解酶活性對(duì)施肥的響應(yīng)產(chǎn)生分異，α-1,4-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶響應(yīng)最明顯，其次為磷酸酶與木聚糖酶。