楊舒涵，王錦霞，郭萌萌，馬龍彪，劉大麗

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學現(xiàn)代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；2.中國農業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點實驗室/中國農業(yè)科學院甜菜研究所，哈爾濱 150080；3.黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱 150080）

0 引言

重金屬（As、Cr、Pb、Cd等）毒害導致活性氧物質（ROS）的形成和積累，并干擾細胞的氧化還原平衡，進而嚴重地影響植物的生長發(fā)育[1]。作為固生生物的植物在長期的適應過程中，也相應地進化出了一套調控防御系統(tǒng)，并激活逆境應答機制來應對有害環(huán)境的毒害[2]。植物體內擁有高效的酶促和非酶促抗氧化防御體系，以作用于一系列不可控的氧化反應，保護植物細胞最大程度地免受毒害。在植物的抗氧化機制中，用于清除ROS 的酶類[3-4]，如過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等，以及解毒酶（Glu‐tathione S-transferases，GSTs），在直接或間接地保護細胞免受逆境傷害中發(fā)揮著重要作用。

Glutathione S-transferases（GSTs，EC 2.5.1.18）作為多功能蛋白之一，由一類高度多樣性的古老的基因家族編碼，并廣泛參與到植物生長發(fā)育、細胞內代謝、逆境耐受、外源毒素和內生化合物的解毒過程中。它通過與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）共價結合形成多種多樣的三肽疏水親電底物[5]，從而絡合活性氧物質，調控細胞氧化還原狀態(tài)，生物合成、結合和轉運次生代謝產(chǎn)物及激素等[6-7]。通過對包括擬南芥、楊樹和水稻在內的植物基因組研究發(fā)現(xiàn)，植物中的GSTs擁有一個超過55個成員的龐大的基因家族[8-10]。根據(jù)氨基酸一致性、基因結構和底物特異性，GSTs被分為八大類：Tau、Phi、Lambda、Theta、Zeta、Dehydroascorbate reductase（DHAR）、Elongation factor 1 gamma（EF1Bγ）以及Tetrachlorohydroquinone dehalogenase（TCHQD）[8]。其中，Tau和phi是液泡植物中最豐富的兩種類型的GSTs，并擁有廣泛的底物特異性[11]。由于它們屬于酶活性蛋白，大量的研究集中在結合基因組學結構，基因表達以及酶促分析等闡述重復基因的保留和功能分化的功能機制方面[12]。

除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)，植物GSTs參與眾多細胞過程，作用于過氧化氫的解毒、花青苷的轉運、除草劑解毒、生長素代謝平衡、酪氨酸代謝以及程序性細胞凋亡的調控等由于生物及非生物逆境帶來的響應[13]，從而保護植物免遭包括重金屬逆境在內的各種非生物逆境的傷害[14-15]。研究表明，擬南芥AtGSTF2 基因與防御相關化合物的結合和轉運調控有關[16]，過量表達AtGSTF2 基因可以提高植物對苯酚逆境的耐受性[17]。重金屬As 逆境會導致由于GST 和GPX 基因的誘導表達而帶來的GSH 含量的增加，從而大量合成植物螯合素以解毒活性氧物質[18]。除此之外，研究表明，擬南芥Phi 家族的GSTs 可以被Cu 和Al 誘導表達[19]；Trichoderma virens GST（TvGST）可以提高真菌對Cd的耐受性[20]。

雖然GSTs 被證實與重金屬逆境耐受相關，然而對于在重金屬尤其是鎘逆境下GSTs 精確的生理作用和分子機制還不清楚。甜菜是新興的能源作物，在重金屬污染土壤的生物修復中表現(xiàn)出了極大的潛力[21]，因此，了解其重金屬耐受作用機理十分重要。結合前期的相關研究[21-23]，我們在對能源甜菜重金屬鎘逆境的轉錄組表達譜的研究中，發(fā)現(xiàn)BvGST基因的差異表達十分顯著，并通過qRT-PCR 進一步確定了該基因與Cd的耐受應答相關。本研究克隆了BvGST 基因，并利用單細胞酵母重組構建及表達該基因，通過比較分析該基因的表達真核酵母細胞中的作用，從而為進一步了解BvGST 在能源甜菜體內的功能及其在重金屬離子代謝平衡中的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 目的基因的克隆

根據(jù)甜菜Beta vulgaris glutathione S-transferase（BvGST，LOC104898671）基因的堿基序列以及酵母表達載體pYES2 的多克隆位點設計引物：[Forward primer (5′-3′)：CGGGA TCC(BamHI) ATG GGA ATC AAG ATT CAT GGA AT；Reverse primer(5′-3′)：CCGCTC GAG(XhoI)TTA AGC TTG CTT CAA CAG AGC CAC]。以Trizol法提取的能源甜菜總RNA反轉錄的cDNA（First strand cDNA synthesis kit，TOYOBO）為模板，利用KOD-Plus-Neo 高保真酶（TOYOBO）擴增獲得目的基因全長。將PCR 產(chǎn)物于25 ℃連接到克隆載體pEASY-T1（Trans‐Gen）上，并轉化到Trans1-T1 感受態(tài)細胞中。提取KanaR陽性克隆質粒DNA，并利用BamHI和XhoI對重組質粒進行限制性內切酶酶切鑒定。所獲得的陽性重組質粒進一步送往上海生工測序，確定其堿基序列的正確性和完整性。

1.2 酵母表達載體的構建

利用BamHI 和XhoI分別雙酶切pEASY-T1-BvGST和pYES2質粒。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳以及膠回收，利用T4 ligase（NEB）將回收載體和目的片段按照1∶7 的摩爾比于16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉化到Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細胞中，提取AmpR克隆質粒DNA，利用BamH I 和Xho I鑒定pYES2-BvGST的正確性。重組酵母表達載體轉化到酵母InVSc1中備用。

1.3 酵母RNA的提取

將含有pYES2-BvGST的酵母菌培養(yǎng)于YPGDR 培養(yǎng)基中，從OD600=0.5初始誘導培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h和24 h，收集菌液。加入等體積的Tris 飽和酚以及Lysis buffer（10 mmol/L Tris-HCl pH7.4，10 mmol/L EDTA，0.5%SDS）充分重懸細胞，65 ℃孵育45 min。經(jīng)過酚、氯仿反復抽提上層清液，并利用3 mol/L NaAc（pH5.2）以及無水乙醇沉淀獲得酵母RNA。利用紫外分光光度計NavoVue plus在OD260和OD280下檢測RNA質量。

1.4 半定量RT-PCR

以定量后的酵母RNA 反轉錄的cDNA 為模板，進行PCR 擴增。其中，內參Saccharomyces cerevisiae ACT1基因（ACT1，YFL039C）的擴增引物為：Forward primer (5′-3′)：TCATGGTCGGTATGGGTCAA；Reverse primer(5′-3′)：TCAGCAGTGGTGGAGAAAGA。Tm=58 ℃；擴增片段長度為487 bp。取20μL PCR 產(chǎn)物，于1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.5 鎘脅迫下酵母菌生長曲線的測定

將轉入pYES2 或pYES2-BvGST 的InVSc1 菌株培養(yǎng)于SC-U（6.7 g/L yeast nitrogen base、200 mg/L-Uracil DO supplement和2%glucose）培養(yǎng)基直到OD600=0.5。收集菌液并培養(yǎng)于含有0.5 mmol/L CdCl2的YPGDR（1%yeast extract、2%peptone、1.94% galactose、0.06%glucose 和1%raffinose）液體培養(yǎng)基中，30 ℃，每隔一定時間間隔，于OD600測一次菌液濃度，制作生長曲線。實驗分別進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 能源甜菜BvGST基因的克隆

根據(jù)能源甜菜Beta vulgaris glutathione S-transferase（BvGST，LOC104898671）基因的堿基序列，在該基因起始密碼子和終止密碼子兩端設計分別帶有BamHI和XhoI酶切位點的特異引物，以能源甜菜總RNA反轉錄的cDNA 為模板擴增該目的基因。如圖1-A 所示，經(jīng)過RT-PCR 及瓊脂糖凝膠檢測，利用高保真Taq 酶擴增BvGST基因，在642 bp 左右的位置獲得了目的條帶。此PCR產(chǎn)物與目的基因在Genbank里的序列大小一致，無雜帶，可以直接用于下一步的載體構建。

將BvGST基因的PCR擴增產(chǎn)物連接到克隆載體pEASY-T1上。如圖1-B所示，經(jīng)過E.coli轉化、Kana抗性篩選陽性克隆、質粒提取以及BamHI、XhoI 限制性內切酶酶切鑒定，實驗分別在3.928 kb 和642 bp 左右的位置上，獲得了相對應于載體pEASY-T1 和目的基因片段BvGST 的條帶。將陽性重組質粒測序，通過Blast堿基序列比對，最終確定了pEASY-T1-BvGST克隆的目的基因的正確性。

圖1 能源甜菜BvGST基因的克隆Fig.1 Cloning of energy beet BvGST gene

2.2 酵母pYES2-BvGST表達載體的構建

提取酵母pYES2質粒，利用限制性內切酶BamHI和XhoI將pYES2質粒和pEASY-T1-BvGST質粒進行酶切，得到帶有特異性連接的粘性末端的載體和目的片段（圖2-A）。膠回收目的條帶，通過T4 連接酶過夜連接以及大腸桿菌轉化，所獲得的的Amp 抗性克隆的質粒DNA 經(jīng)過BamHI 以及XhoI 的雙酶切鑒定，分別在5.9 kb和642 bp 左右的位置獲得了相應的目的條帶，從而獲得正確的酵母重組質粒pYES2-BvGST（圖2-B）。將陽性克隆轉入酵母InVSc1中以進行下一步的檢測及功能分析。

圖2 pYES2-BvGST重組質粒的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid of pYES2-BvGST

2.3 BvGST基因在酵母體內的表達

為了進一步檢測重組質粒pYES2-BvGST在酵母InVSc1中的表達情況，實驗將重組菌培養(yǎng)于誘導型培養(yǎng)基YPGDR 中，適量誘導表達目的基因BvGST，以酵母ACT1 基因作為內參基因。Semi-quantitative PCR 研究表明，經(jīng)過半乳糖的誘導，隨著培養(yǎng)時間的增加，與酵母ACT1基因的表達幾乎沒有變化相比，BvGST 基因的表達量卻在逐漸增加（圖3），從而實驗進一步證實了甜菜BvGST 基因在重組酵母菌體內可以被誘導并正確地表達。

圖3 BvGST基因在酵母中的誘導表達Fig.3 Induction and expression of BvGST gene in yeast cells

2.4 鎘脅迫下甜菜BvGST基因在酵母體內的功能分析

為了分析在重金屬鎘逆境下，BvGST 基因在酵母菌體內的功能，實驗以轉化pYES2 空載體的酵母為對照，通過半乳糖以及葡萄糖的誘導抑制組合，分析目的基因的表達是否可以提高酵母對Cd的耐受性。如圖4所示，在正常生長條件下，即沒有重金屬逆境脅迫的條件下，無論是YPD 抑制表達培養(yǎng)基還是在YPGDR 誘導培養(yǎng)基中生長的兩組酵母的生長速率幾乎持平，說明BvGST 基因的表達對酵母菌的生長沒有明顯的影響。與之相反的是，在Cd逆境脅迫下，無論是對照還是含有目的基因的重組菌，在兩種培養(yǎng)基中的生長均受到了抑制，生長緩慢并在一定階段伴隨著下降的趨勢；但在YPGDR 培養(yǎng)基中，適量表達BvGST基因的酵母的生長趨勢要明顯優(yōu)于對照pYES2酵母菌。這些數(shù)據(jù)表明，能源甜菜BvGST在酵母內的表達在鎘逆境脅迫下的生長和耐受性的提高中發(fā)揮著重要作用。

圖4 鎘脅迫下重組酵母菌的生長曲線Fig.4 Growth curve of recombinant yeast under cadmium stress

3 討論

在重金屬逆境脅迫以及相關的生物修復研究中，鎘被認為是一類高毒性的離子，它可以通過植物根部吸收并通過輸導組織被運送到其它部位的細胞、組織及器官中，引發(fā)次級逆境-氧化逆境的發(fā)生，進而直接或間接對植物產(chǎn)生毒害作用。而在谷胱甘肽作為二硫還原劑，介導調控由于重金屬逆境所引起的基因表達中，谷胱甘肽轉移酶Glutathione S-transferases（GSTs）扮演著重要的角色[24]。除此之外，植物GSTs 在對生長素的細胞應答以及植物次生產(chǎn)物的代謝過程發(fā)揮著重要作用?？梢姡私釨vGST 基因的作用機制和分子功能，對于解讀能源甜菜在Cd逆境下的基因應答調控機理十分重要。

前期的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬逆境會對能源甜菜的生長造成一定程度的影響[21]。通過轉錄組學的分析發(fā)現(xiàn)，在眾多基因的脅迫應答過程中，能源甜菜BvGST基因的差異表達極其顯著。因此，本研究利用RT-PCR 技術克隆了該基因，并將其重組表達于酵母這一真核單細胞生物體內以研究其作用機制。通過半乳糖以及葡萄糖組合的適量誘導表達目的基因，發(fā)現(xiàn)該基因在重金屬鎘逆境脅迫下，可以在一定程度上提高酵母菌的生長狀態(tài)和對Cd離子的耐受性。

在以往的報道中發(fā)現(xiàn)，水稻OsGSTU30和OsGSTU41基因的大量表達在不影響酵母在正常生長條件下的生長狀態(tài)的情況下，可以通過較高的GST 活性提高菌體對重金屬Cr（VI）的抗性[25]。因此，研究結果說明了BvGST 是能源甜菜體內重要的解毒酶之一，通過其在酵母體內與Cd 逆境脅迫中的生長調控機制的研究，確定其在重金屬逆境功能機制中發(fā)揮著重要作用。同時，該基因的克隆也為下一步深入細致地研究其在重金屬逆境脅迫下的組織表達特性和缺失突變體的獲得奠定基礎。

4 結論

本研究通過克隆和酵母菌體外重組表達目的基因BvGST，發(fā)現(xiàn)該基因可以在一定程度上提高宿主菌在重金屬Cd逆境下的生存狀態(tài)和生長趨勢。能源甜菜BvGST基因與鎘逆境脅迫之間存在著一定的應答關系，該基因可能通過直接或間接的作用降低Cd對細胞的毒害，從而提高酵母對重金屬的耐受性。研究結果也為進一步對BvGST基因的功能開發(fā)和利用生物技術改造人工超累積能源甜菜奠定基礎。