邳植，吳則東，黃林玉

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

糖用甜菜（Beta vulgaris L.）屬于石竹目（Caryophyllales）、莧科（Amaranthaceae）、甜菜亞科（Betoideae）、普通甜菜屬（Beta）[1]。栽培甜菜是兩年生異花授粉的草本植物，在第一年進(jìn)行營養(yǎng)生長，長出膨大的根，經(jīng)過春化后，在第二年進(jìn)行生殖生長[2]。糖用甜菜是世界上重要的兩種制糖原料之一，甜菜所生產(chǎn)的食糖約占世界食糖總量的20%，其中美國和歐盟是全球甜菜糖的領(lǐng)導(dǎo)者[3]。糖甜菜也是我國北方重要的經(jīng)濟(jì)作物，2017年內(nèi)蒙古和新疆甜菜種植面積為12.77萬hm2[4]。

自2000年以來，從國外引進(jìn)品種幾乎占據(jù)了中國甜菜種子的全部市場，目前，國外甜菜品種已經(jīng)占到中國甜菜種子市場的95%以上，其中從德國、比利時(shí)、意大利和法國引進(jìn)的甜菜種子數(shù)量占98%以上[5]。甜菜種子多采用包衣或丸?；幚恚捎谔鸩说倪z傳基礎(chǔ)較窄[6-7]，從傳統(tǒng)外形上的差異來辨別甜菜品種很難，不同的國外跨國種子公司會(huì)在甜菜丸?；庸r(shí)加入不同的警戒色，但要實(shí)現(xiàn)甜菜品種真實(shí)性的鑒別，使用最多的仍然是形態(tài)學(xué)的DUS 測試。目前“NY/T 2482-2013 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南糖用甜菜”的國家標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)頒布，雖然甜菜新品種登記必須要進(jìn)行DUS 測試，但是由于甜菜本身遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，品種間使用同一父本或同一母本的現(xiàn)象比較普遍，而形態(tài)學(xué)鑒定的方法不僅受環(huán)境的影響比較大，也受到具體測試人員的影響，而且檢測的周期非常長，一般需要整個(gè)生長周期。分子標(biāo)記技術(shù)具有任何時(shí)間均可取樣的特點(diǎn)，而且不受環(huán)境的影響。目前已經(jīng)有多種分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于甜菜等作物的品種鑒定，例如SRAP[8]、CDDP[9]、ISSR[10-13]、RAPD[11-12]、AFLP[11]、DAMD[12]、SSR[13-14]及SNP 分子標(biāo)記[15]等，這些標(biāo)記表現(xiàn)出基因之間的實(shí)際遺傳變異水平，其構(gòu)建得到的指紋圖譜能更加直接、準(zhǔn)確區(qū)分出不同品種的差異。

在本研究中，擬選擇的起始密碼子多態(tài)性（Start codon targeted polymophism，SCoT）分子標(biāo)記進(jìn)行甜菜指紋圖譜構(gòu)建，該標(biāo)記是2009 年由Collard 等人提出的一種基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的目的基因分子標(biāo)記方法[16]。SCoT 分子標(biāo)記是一種單引物的標(biāo)記，因此引物分別與模板的上游和下游結(jié)合，又由于該引物擁有較長的引物長度，重復(fù)性要好于RAPD 標(biāo)記，并能有效產(chǎn)生和性狀連鎖的標(biāo)記，方便分子標(biāo)記輔助育種[16]。目前SCoT分子標(biāo)記已經(jīng)在甘蔗[17]、大豆、柑橘、花生、棉花、芥菜[18]和鷹嘴豆[19]等作物的遺傳多樣性分析得到了應(yīng)用，雖然甜菜SCoT 體系已經(jīng)建立并完成了引物篩選[20-21]，但還沒有利用SCoT 引物進(jìn)行品種鑒定的研究。因此，本研究擬利用篩選出的3條多態(tài)性較好的SCoT引物對(duì)15個(gè)已經(jīng)登記的甜菜品種進(jìn)行指紋鑒定，以期為甜菜品種的快速鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試甜菜品種15個(gè)，見表1。

表1 甜菜品種名稱及編號(hào)Table 1 Name and number of sugarbeet varieties

1.2 方法

1.2.1DNA提取

將15個(gè)甜菜品種種植在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)試驗(yàn)基地，當(dāng)甜菜幼苗長出4片真葉時(shí)，每個(gè)品種取10株。使用CTAB法[22]進(jìn)行DNA的提取，最后利用超微量紫外分光光度計(jì)測量DNA的純度及濃度，并將其濃度稀釋至10 ng/μL的工作液。

1.2.2SCoT引物

從80 條引物中選擇了3 條多態(tài)性相對(duì)較高、帶型清晰、易分辨且重復(fù)性好的引物，它們分別是SCoT21、SCoT12和SCoT2（表2），引物由上海生工合成，HAP純化，每條引物均稀釋至10μmol/L備用。

表2 試驗(yàn)所用的引物名稱及序列Table 2 Name and sequence of primers used in the test

1.2.3SCoT-PCR反應(yīng)體系

PCR總反應(yīng)體系為5μL，其中含有2.5μL 2倍的Mix，0.4μL引物，2μL模板DNA，最后加入滅菌去離子水補(bǔ)充至5μL，振蕩混勻。

1.2.4SCoT-PCR反應(yīng)程序

在94 ℃下預(yù)變性3 min；然后在94℃下進(jìn)行45 s 變性，退火55 ℃45 s，最后在72 ℃進(jìn)行40 s 的延伸；反應(yīng)結(jié)束后，將其在72 ℃延伸5 min。

1.2.5聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測

在擴(kuò)增后的產(chǎn)物中加入2μL Loading Buffer，用微孔板離心機(jī)進(jìn)行離心。使用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，電泳緩沖液為0.5×TBE，180 V 恒壓，電泳120 min。電泳結(jié)束后，利用快速銀染法[23]進(jìn)行漂洗、染色、顯影成像，最后進(jìn)行拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

3 條SCoT 引物擴(kuò)增銀染結(jié)果見圖1，從圖1 中可以看出，3 條引物均擴(kuò)增出了清晰的條帶，每一條擴(kuò)增的條帶多態(tài)性都非常好。利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別品種的方法主要有特征譜帶法、引物組合法和核心引物組合法[24]，引物組合法和核心引物組合法一般需要將擴(kuò)增條帶做成0、1 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較復(fù)雜，由于SCoT 擴(kuò)增條帶多態(tài)性非常豐富，所以適宜于使用特征譜帶法。本研究SCoT12 和SCoT12 這兩條引物在15 個(gè)甜菜品種中就產(chǎn)生了15種不同的帶型，即可把15個(gè)甜菜品種全部鑒別區(qū)分開；而SCoT2引物除了2號(hào)品種和9號(hào)品種難以鑒別外，能夠區(qū)別其它13個(gè)品種。

圖1 15個(gè)甜菜品種指紋圖譜條帶Fig.1 Fingerprinting strips of 15 sugar beet varieties

3 討論與結(jié)論

目前，我國大多數(shù)植物品種純度鑒定方法均采用形態(tài)識(shí)別鑒定法。然而形態(tài)識(shí)別方法具有長周期，識(shí)別工作量大，受環(huán)境條件或生物因素的影響等要素的制約，其弊端日益呈現(xiàn)，人為因素的影響比較高。

分子標(biāo)記技術(shù)由于不受環(huán)境條件的影響，并且有識(shí)別時(shí)間短，精度高等優(yōu)良特性。目前利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建甜菜品種指紋圖譜的國外文獻(xiàn)有AFLP 技術(shù)[25]和SNP 技術(shù)[26]等，AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)雖然擴(kuò)增的條帶比較多，多態(tài)性較好，但由于此技術(shù)不僅有專利的限制，而且擴(kuò)增條帶過多，不易識(shí)別，另外該技術(shù)使用起來也比較麻煩，要經(jīng)過一次酶切和兩次PCR 擴(kuò)增；而SNP技術(shù)雖然是未來發(fā)展的方向，但由于該技術(shù)目前使用起來還比較復(fù)雜，對(duì)儀器和設(shè)備要求很高，一般的單位難以應(yīng)用。目前國內(nèi)主要利用SSR[27]和ISSR[10]分子標(biāo)記技術(shù)鑒定甜菜品種，SSR 分子標(biāo)技術(shù)雖然擴(kuò)增條帶清晰、易于識(shí)別，但缺點(diǎn)是單個(gè)引物的多態(tài)性較小，一個(gè)引物一般只能鑒別2 個(gè)品種，如果鑒別品種較多，需要很多的引物組合；雖然個(gè)別ISSR 引物具有很好的多態(tài)性，單個(gè)引物能夠鑒別多個(gè)品種，但缺點(diǎn)是多態(tài)性的引物較少?；诖?，我們選擇一種新的分子標(biāo)記技術(shù)SCoT 對(duì)15 個(gè)甜菜品種進(jìn)行品種真實(shí)性的鑒定。SCoT 分子標(biāo)記具有高度多態(tài)性和可重復(fù)性，且實(shí)驗(yàn)獲得的條帶清晰，利用特征引物法，兩條引物SCoT12 和SCoT21 單獨(dú)使用均可鑒別全部15個(gè)甜菜品種，即使將來隨著甜菜登記品種的增加，有個(gè)別品種在一條引物擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生相同的條帶，利用核心引物組合法也可以比較容易地實(shí)現(xiàn)對(duì)甜菜品種的鑒別。因此SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜品種鑒定上的應(yīng)用可以實(shí)現(xiàn)快速鑒定甜菜品種的目的，為保護(hù)甜菜育種家以及農(nóng)民的利益，促進(jìn)我國甜菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展發(fā)揮重要的作用。