王仲朝 劉龍梅 王家璞 蔡雨晴 楊霞

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦峭{人類(lèi)健康的一類(lèi)重大疾病。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈（冠脈）介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前冠心病血運(yùn)重建的重要臨床手段，因能快速、高效、安全地開(kāi)通“罪犯血管”而被國(guó)內(nèi)外各大指南推薦［1-2］。近年來(lái)，全球接受PCI治療的人數(shù)不斷增加，我國(guó)接受PCI 治療人數(shù)的增加更為明顯，但PCI 術(shù)后再狹窄（in-stent restenosis，ISR）嚴(yán)重限制了其遠(yuǎn)期血運(yùn)重建效果。目前認(rèn)為，PCI 過(guò)程中會(huì)損傷冠脈內(nèi)皮細(xì)胞，撕裂血管內(nèi)膜，引起血管重塑，因此，研究血管重塑中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋和抑制平滑肌細(xì)胞增殖的相關(guān)分子機(jī)制對(duì)揭示ISR 的發(fā)病機(jī)制從而及時(shí)給予臨床干預(yù)至關(guān)重要。

血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可作用于心肌細(xì)胞，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)改變和心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，與PCI 術(shù)后ISR 發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)［3-4］。有研究表明，在不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血中存在AngⅡ-1型受體自身抗體（AngⅡ-type 1 receptor auto antibodies，AT1-AA）［5］，這種自身抗體可以通過(guò)激活A(yù)ngⅡ-1型受體（AngⅡ-type 1 receptor，AT1R）加快乳鼠原代心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞組織因子異常表達(dá)和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、損傷血管功能等與AngⅡ激活A(yù)T1R后類(lèi)似的生物學(xué)效應(yīng)，這種效應(yīng)可部分被纈沙坦（valsartan，Val）阻斷［6］。但是，關(guān)于Val 對(duì)AT1-AA 誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖與遷移影響的研究并不多。本研究選用大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌A7r5 細(xì)胞，觀察AT1-AA及Val 對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌A7r5 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自以色列BI 公司，青霉素-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）購(gòu)自北京全式金公司，細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，AT1-AA（英國(guó)Abcam 公司），Val（魯南貝特制藥有限公司）；Herocell 180 CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司），安圖PHOMO酶標(biāo)儀（鄭州安圖生物工程股份有限公司），ZEISS AXIO Observer A1 倒置顯微鏡（德國(guó)卡爾蔡司公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A7r5 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、0.1 U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d 更換1 次培養(yǎng)基，每周按1：3 比例傳代1 次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。精密稱(chēng)量10 mg Val，加入二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）超聲分散配制成50 μmol/L 的溶液，使用DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2 AT1-AA 對(duì)A7r5 細(xì)胞增殖的影響 預(yù)先用DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋AT1-AA。A7r5 細(xì)胞接種于96 孔板（5 000個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%融合時(shí)棄去原培養(yǎng)基，加入含2% FBS 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。向各孔中加入不同濃度（5、10、20 mg/L）AT1-AA 溶液，以不含藥培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。在培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)3、6、12、24h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8 孵育4h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度（A 值）。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率＝〔（A加藥-A空白）/（A對(duì)照-A空白）〕×100%，并統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)。

1.2.3 Val 對(duì)AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞增殖的影響 在96 孔板中接種A7r5 細(xì)胞懸液（5 000個(gè)/孔），分為空白對(duì)照組（不含藥）、AT1-AA 最適濃度組、AT1-AA+Val（濃度分別為0.1、1、10 μmol/L）組，并設(shè)置重復(fù)孔，加入不同濃度Val 處理0.5、1、2、4h 后再加入20 mg/L AT1-AA，培養(yǎng)12h 后進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 AT1-AA 對(duì)細(xì)胞遷移的影響 將A7r5 細(xì)胞接種于12 孔板，待細(xì)胞貼壁融合至80%時(shí)棄去上清，加入含2% FBS 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后用無(wú)菌200 μL 槍頭在各培養(yǎng)板細(xì)胞生長(zhǎng)單層相同位置劃垂直線，用PBS 洗滌2 次去除脫落的細(xì)胞，隨后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，分為空白對(duì)照組（不含藥）、AT1-AA 組（5、10、20 mg/L），繼續(xù)培養(yǎng)3、6、12、24h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移距離。超過(guò)劃線的細(xì)胞遷移最遠(yuǎn)距離即實(shí)際遷移距離，拍照并測(cè)定距離3 次，計(jì)算均值。根據(jù)細(xì)胞遷移距離測(cè)定結(jié)果，確定AT1-AA 誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的最適條件。

1.2.5 Val 對(duì)AT1-AA 誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移的影響 將A7r5 細(xì)胞接種于12 孔板，分為空白對(duì)照組（不含藥）、AT1-AA 最適濃度組、AT1-AA+Val（0.1、1、10 μmol/L）組，并設(shè)置重復(fù)孔，加入Val 預(yù)處理0.5、1、2、4h 后再加入10 mg/L AT1-AA 繼續(xù)培養(yǎng)24h，在顯微鏡下觀察并測(cè)定細(xì)胞遷移距離。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各濃度AT1-AA 作用不同時(shí)間對(duì)A7r5 細(xì)胞增殖的影響 隨著AT1-AA 濃度的升高，A7r5 細(xì)胞存活率呈升高趨勢(shì)，表明AT1-AA 能夠促進(jìn)A7r5 細(xì)胞增殖。用20 mg/L AT1-AA 處理A7r5 細(xì)胞，細(xì)胞存活率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后下降，以處理時(shí)間為12h 時(shí)細(xì)胞存活率最高（見(jiàn)表1）。因此以AT1-AA 20 mg/L 處理12h 為最適作用條件。

表1 各濃度AT1-AA 作用不同時(shí)間的A7r5 細(xì)胞存活率比較（±s）

表1 各濃度AT1-AA 作用不同時(shí)間的A7r5 細(xì)胞存活率比較（±s）

注：AT1-AA 為血管緊張素Ⅱ-1型受體自身抗體；與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05，bP＜0.01；以空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為1

細(xì)胞存活率3h 6h 12h 24h空白對(duì)照組 6 1 1 1 1 AT1-AA 5 mg/L 組 6 1.02±0.01 0.95±0.00 1.11±0.15 a 1.11±0.00 a AT1-AA 10 mg/L 組 6 1.03±0.05 1.14±0.05 1.25±0.04 a 1.16±0.01 a AT1-AA 20 mg/L 組 6 1.05±0.06 1.23±0.20 a 1.43±0.07 b 1.24±0.05 b組別 樣本量（孔）

2.2 Val 對(duì)AT1-AA 誘 導(dǎo)A7r5 細(xì) 胞增殖的影響 Val 能抑制AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞增殖，不同濃度Val 預(yù)處 理0.5h 后，用20 mg/L AT1-AA 處理12h，當(dāng)Val 濃 度 為10 μmol/L 時(shí)，AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞存活率最低；當(dāng)Val 預(yù)處理時(shí)間≥1h 時(shí)，0.1 μmol/L Val 組AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞存活率為同時(shí)間點(diǎn)最低。見(jiàn)表2。

表2 各濃度Val 預(yù)處理不同時(shí)間AT1-AA誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞存活率比較（±s）

表2 各濃度Val 預(yù)處理不同時(shí)間AT1-AA誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞存活率比較（±s）

注：AT1-AA 為血管緊張素Ⅱ-1型受體自身抗體，Val 為纈沙坦；與AT1-AA 組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；以空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為1

細(xì)胞存活率0.5h 1h 2h 4h空白對(duì)照組 6 1 1 1 1 AT1-AA 組 6 1.40±0.05 1.39±0.04 1.40±0.04 1.39±0.05 AT1-AA+組別 樣本量（孔）0.1 μmol/L Val 組 6 1.04±0.05 a 1.01±0.04 a 0.89±0.03 a 0.82±0.21 a AT1-AA+1 μmol/L Val 組 6 1.08±0.01 a 1.13±0.02 a 1.08±0.04 a 1.03±0.05 a AT1-AA+10 μmol/L Val 組 6 0.88±0.02 a 1.09±0.01 a 1.09±0.04 a 0.93±0.19 a

2.3 AT1-AA 對(duì)A7r5 細(xì)胞遷移的影響 AT1-AA 能促進(jìn)A7r5 細(xì)胞的遷移，相同濃度AT1-AA 處理A7r5 細(xì)胞不同時(shí)間，細(xì)胞遷移距離隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加。處理相同時(shí)間，A7r5 細(xì)胞的遷移距離隨AT1-AA 濃度升高呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)AT1-AA 濃度為10 mg/L 時(shí)，細(xì)胞的遷移距離較其他組遠(yuǎn)，當(dāng)處理時(shí)間為24h 時(shí)，細(xì)胞遷移距離最遠(yuǎn)（見(jiàn)表3）。因此，AT1-AA 10 mg/L 處理24h 為最適處理?xiàng)l件。

表3 不同濃度AT1-AA 作用不同時(shí)間A7r5 細(xì)胞遷移距離比較（±s）

表3 不同濃度AT1-AA 作用不同時(shí)間A7r5 細(xì)胞遷移距離比較（±s）

注：AT1-AA 為血管緊張素Ⅱ-1型受體自身抗體；與本組3h 比較，aP＜0.05，bP＜0.01

細(xì)胞遷移距離（μm）3h 6h 12h 24h空白對(duì)照組 3 6.05±2.53 21.03±4.74 35.60± 0.98 a 71.02± 0.54 a AT1-AA 5 mg/L 組 3 11.20±0.51 64.50±2.79 a 153.09±15.49 b 209.57±17.83 b AT1-AA 10 mg/L 組 3 12.10±0.44 57.33±1.64 a 171.39± 7.69 b 255.14± 9.51 b AT1-AA 20 mg/L 組 3 10.00±0.13 22.14±0.92 38.99± 0.29 a 109.72±16.45 a組別 樣本量（孔）

2.4 Val 對(duì)AT1-AA 誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞遷移的影響 Val能抑制AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞遷移，以0.1 μmol/L Val 預(yù)處理2、4h 或以10 μmol/L Val 預(yù)處理0.5、1h后，A7r5 細(xì)胞的遷移距離均明顯低于其他處理組（均P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 不同濃度Val 預(yù)處理不同時(shí)間AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞遷移距離比較（±s）

表4 不同濃度Val 預(yù)處理不同時(shí)間AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞遷移距離比較（±s）

注：AT1-AA 為血管緊張素Ⅱ-1型受體自身抗體，Val 為纈沙坦；與AT1-AA+0.1 μmol/L Val 組同期比較，aP＜0.01

細(xì)胞遷移距離（μm）0.5h 1h 2h 4h空白對(duì)照組 3 60.28±3.01 60.87±3.22 61.98±2.97 62.09±2.68 AT1-AA 組 3 105.24±3.08 107.98±3.17 108.25±2.99 108.61±3.22 AT1-AA+0.1 μmol/L Val 組 3 61.34±2.78 66.37±3.41 10.05±0.93 9.38±0.96 AT1-AA+1 μmol/L Val 組 3 69.02±1.08 85.04±5.25 62.54±1.16 82.15±3.45 AT1-AA+10 μmol/L Val 組 3 14.57±3.01 a 16.35±1.20 a 83.11±3.52 59.44±3.09組別 樣本量（孔）

3 討論

冠心病是一種慢性、終身性心血管疾病，近年來(lái)發(fā)病人數(shù)不斷增加，且發(fā)病人群多集中于中老年人，對(duì)患者生命和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重危害［7］。PCI可以迅速重建冠脈血運(yùn)，是目前治療急性心肌梗死（AMI）時(shí)間窗內(nèi)的首選治療方案［8-9］，目前PCI 術(shù)后半年再狹窄率高達(dá)10%［10］。PCI 過(guò)程會(huì)損傷冠脈內(nèi)皮細(xì)胞，撕裂血管內(nèi)膜，引起血管重塑，進(jìn)而啟動(dòng)凝血反應(yīng)，促進(jìn)炎癥發(fā)生，釋放各種酶、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等活性物質(zhì)，誘導(dǎo)血管中膜的平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖并遷移到內(nèi)膜，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，造成再狹窄發(fā)生［11-12］。有研究證實(shí)，快速內(nèi)皮覆蓋、恢復(fù)內(nèi)皮功能進(jìn)而減少平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，抑制血管內(nèi)膜增生，能夠降低再狹窄發(fā)生率［13］。本團(tuán)隊(duì)前期研究［14］對(duì)PCI 后ISR 患者血清中AT1-AA 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)再狹窄患者中AT1-AA 陽(yáng)性率顯著高于PCI 術(shù)后未發(fā)生再狹窄者，表明AT1-AA 可能參與PCI 術(shù)后再狹窄的發(fā)生發(fā)展［12］。

本研究采用CCK-8 法評(píng)估AT1-AA 和Val 對(duì)A7r5 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示AT1-AA 能促進(jìn)A7r5 細(xì)胞的增殖，不同濃度AT1-AA 處理A7r5 細(xì)胞后，細(xì)胞存活率隨著濃度的升高而升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且以20 mg/L AT1-AA處理A7r5 細(xì)胞12h 后的細(xì)胞存活率最高。此外，AT1-AA 促進(jìn)A7r5 細(xì)胞增殖的現(xiàn)象可被Val 抑制，經(jīng)不同濃度Val 預(yù)處理A7r5 細(xì)胞 0.5h，用20 mg/L AT1-AA 處理12h，10 μmol/L Val 對(duì)AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞增殖的抑制能力最強(qiáng)；預(yù)處理時(shí)間≥1h時(shí)，0.1 μmol/L Val 對(duì)AT1-AA 誘導(dǎo)A7r5 細(xì)胞增殖的抑制能力最強(qiáng)。

采用劃痕試驗(yàn)法檢測(cè)AT1-AA 和Val 對(duì)A7r5細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示AT1-AA 能促進(jìn)A7r5 細(xì)胞遷移，用不同濃度AT1-AA 處理A7r5 細(xì)胞相同時(shí)間，細(xì)胞的遷移距離隨濃度升高呈先增加后減少的趨勢(shì)。且以10mg/L AT1-AA 處理24h 后的細(xì)胞遷移距離較其他組遠(yuǎn)。此外，Val 能抑制AT1-AA 誘導(dǎo)的A7r5 細(xì)胞遷移，用0.1 μmol/L Val 預(yù)處理2、4h以及10 μmol/L Val 預(yù)處理0.5、1h 后，A7r5 細(xì)胞的遷移距離明顯低于其他處理組。

綜上所述，AT1-AA 能促進(jìn)A7r5 細(xì)胞增殖和遷移，且AT1-AA 促進(jìn)A7r5 細(xì)胞增殖和遷移的現(xiàn)象可被Val 抑制，間接提示Val 可能改善ISR，這與本團(tuán)隊(duì)之前進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［14］。從血管內(nèi)膜到血管中膜的驗(yàn)證結(jié)果提示，AT1-AA 對(duì)血管的影響在臨床上應(yīng)受到重視，而Val 的應(yīng)用恰好減輕了AT1-AA 的影響，這為今后臨床應(yīng)用Val 預(yù)防ISR 提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突