王 可，劉志海，趙 莉，劉旭東，，任海燕，胡龍飛，，郝智慧，王金泉

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院,山東 青島 266000)

細(xì)菌耐藥性(AMR)已經(jīng)成為21世紀(jì)人類健康的最大威脅之一[1]。自2009年Yong等[2]首次發(fā)現(xiàn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺類(NDM-1)以來，該酶能夠介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)幾乎所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，包括碳青霉烯類藥物。其耐藥基因blaNDM已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)最主要的碳青霉烯耐藥基因[3]。近年來，多黏菌素一度被認(rèn)為是對(duì)抗碳青霉烯類耐藥菌引起的嚴(yán)重感染的最后一道防線[4-5]。攜帶碳青霉烯耐藥基因blaNDM和多黏菌素耐藥基因mcr-1超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)傳播，進(jìn)一步揭示了細(xì)菌耐藥對(duì)公共衛(wèi)生安全的威脅。

自2011年中國(guó)首次檢測(cè)到攜帶blaNDM-1的鮑曼不動(dòng)桿菌以來，中國(guó)多個(gè)省份的醫(yī)院迅速出現(xiàn)blaNDM-1陽性腸科桿菌[6]。攜帶blaNDM耐藥菌株多數(shù)源于臨床患者，目前在養(yǎng)殖動(dòng)物與養(yǎng)殖環(huán)境中也有報(bào)道[7]。同樣，自從mcr-1在動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)以后，世界各地超過25個(gè)國(guó)家從動(dòng)物、食品、人體中都分離出了mcr-1[8-9]。隨著碳青霉烯和多黏菌素耐藥腸科桿菌的出現(xiàn)，意味著在大多數(shù)多重耐藥(MDR)腸桿科細(xì)菌引起感染中，幾乎無抗生素可用。然而，全世界越來越多的報(bào)道顯示，人和動(dòng)物的腸科桿菌中存在blaNDM和mcr-1共存[10-11]。這些菌株的出現(xiàn)無疑是一個(gè)危險(xiǎn)信號(hào)——人類公共衛(wèi)生安全和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展或?qū)⒚媾R巨大威脅。目前，我國(guó)已經(jīng)成為動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性最為嚴(yán)重的國(guó)家之一[12]。國(guó)內(nèi)關(guān)于養(yǎng)殖動(dòng)物源腸桿科細(xì)菌的研究報(bào)道不斷，同時(shí)大腸桿菌擁有不斷積累耐藥基因的能力，被認(rèn)為是耐藥基因的天然儲(chǔ)存庫，因此可能導(dǎo)致耐藥基因的散播，并使得人用和獸用藥物效果降低。

由于雞源大腸桿菌同時(shí)攜mcr-1與blaNDM的相關(guān)研究報(bào)道不多。本試驗(yàn)調(diào)查了山東青島地區(qū)雞養(yǎng)殖場(chǎng)與雞屠宰場(chǎng)中大腸桿菌的耐藥情況，及黏菌素耐藥基因mcr-1與碳青霉烯耐藥基因blaNDM的攜帶情況，以期為雞養(yǎng)殖業(yè)臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為耐藥菌的產(chǎn)生和傳播提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 2018年11月-2019年4月采集山東青島地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)雞泄殖腔拭子105份和屠宰場(chǎng)雞盲腸90份，共計(jì)195份。

1.2 主要試劑Taq酶、Marker，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；阿莫西林(AMX)、多黏菌素E(CL)、四環(huán)素(TET)、頭孢氨芐(LEX)、替加環(huán)素(TGC)、亞胺培南(IMP)、慶大霉素(GEN)、氧氟沙星(OFL)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)等藥敏試驗(yàn)藥物，均購(gòu)自武漢威得利化學(xué)科技有限公司；LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。16S rRNA引物為：上游引物：5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和下游引物：5′-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3′，擴(kuò)增后目的片段大小1 300 bp。引物合成及一代測(cè)序，均由北京六合華大基因科技有限公司負(fù)責(zé)。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定 將采集的雞泄殖腔拭子、雞盲腸內(nèi)容物接種于麥康凱瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑選粉紅色至紅色圓形菌落于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中富集培養(yǎng)后純化。對(duì)于純化后的單菌落進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn) 使用瓊脂稀釋法確定以下抗生素的最低抑菌濃度(MIC):亞胺培南、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢吡肟、四環(huán)素、替加環(huán)素、慶大霉素、多黏菌素E 和氧氟沙星。具體操作如下：(1)藥物稀釋按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)制訂的指南進(jìn)行藥物原液制備和稀釋；(2)挑取培養(yǎng)好的受試菌制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海?3)瓊脂稀釋法最終接種菌量為104CFU/點(diǎn)進(jìn)行接種；(4)接種完畢后將培養(yǎng)基放入35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h;(5)肉眼觀察結(jié)果并分析。大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)量控制菌株。耐藥折點(diǎn)及相關(guān)操作均遵循CLSI指南。多重耐藥(MDR)分離株被定義為對(duì)3種以上抗生素具有耐藥性。

1.5 耐藥基因檢測(cè) 對(duì)于分離的菌株用水煮法提取細(xì)菌DNA。碳青霉烯耐藥基因blaNDM、mcr-1到mcr-9耐藥基因的檢測(cè)采用已經(jīng)報(bào)道的引物[11]。碳青霉烯耐藥基因包括blaIMP、blaOXA、blaNDM、blaKPC。PCR反應(yīng)體系為：Taq酶15 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，水13 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，并利用NCBI進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 采集的195份樣品中，共分離到186株(95.4%)大腸桿菌，其中雞養(yǎng)殖場(chǎng)98株(93.3%)，雞屠宰場(chǎng)88株(98%)。

2.2 藥敏試驗(yàn) 186株雞源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、阿莫西林、頭孢氨芐耐藥率較高，均達(dá)到95%以上，分別為98.9%、97.3%、95.2%。其他依次為慶大霉素(88.7%)、頭孢噻肟鈉(87.1%)、氧氟沙星(86.6%)、多黏菌素E(81.2%)、頭孢吡肟(76.9%)、亞胺培南(45.2%)、替加環(huán)素(4.8%)(見圖1)。除替加環(huán)素和亞胺培南外，雞屠宰場(chǎng)大腸桿菌的耐藥率均高于雞養(yǎng)殖場(chǎng)。雞屠宰場(chǎng)大腸桿菌對(duì)阿莫西林、四環(huán)素、頭孢氨芐、頭孢噻肟4種抗生素的耐藥率高達(dá)100%；其MIC分別為256 μg/mL、16 μg/mL、256 μg/mL和16 μg/mL。雞屠宰場(chǎng)大腸桿菌的多重耐藥情況比雞養(yǎng)殖場(chǎng)嚴(yán)重。所有分離株對(duì)8種抗生素耐藥的大腸桿菌占35.4%(n= 66)；對(duì)9種抗生素耐藥的大腸桿菌占24.7%(n= 46)。主要的耐藥譜型為AMX、LEX、CTX、FEP、TET、GEN、CL和OFL。甚至出現(xiàn)5株對(duì)10種抗生素全部耐藥的情況(圖2)。

圖1 雞源大腸桿菌對(duì)10種抗菌藥物的耐藥率Fig.1 The resistance rate of chicken E.coli to ten antibacterial drugs

圖2 雞源大腸桿菌的多重耐藥率Fig.2 Multidrug resistance rate of chicken E.coli

186株雞源大腸桿菌的MIC50與MIC90相差較大，主要體現(xiàn)在雞養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌。雞屠宰場(chǎng)大腸桿菌除對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、氧氟沙星外的MIC50與MIC90相差較大外，對(duì)頭孢吡肟、頭孢噻肟鈉、頭孢氨芐、阿莫西林的MIC50與MIC90相同，分別為16 μg/mL、16 μg/mL、256 μg/mL、256 μg/mL(見表1)。

表1 雞源大腸桿菌的MIC50和MIC90Table 1 MIC50 and MIC90 of E.coli from chicken (μg/mL)

2.3 耐藥基因檢測(cè) 186株大腸桿菌中共檢測(cè)出42株(22.6%)攜帶mcr-1基因(見表2)，未發(fā)現(xiàn)其他mcr亞型，其中雞養(yǎng)殖場(chǎng)源(18株，18.4%)低于雞屠宰場(chǎng)源(30株，34.1%)；碳青霉烯耐藥基因blaNDM的檢出率為7.5%(n= 14)，blaNDM-5為主要的亞型，其次為blaNDM-1，未發(fā)現(xiàn)其他碳青霉烯耐藥基因，其中雞養(yǎng)殖場(chǎng)源和雞屠宰場(chǎng)源分別為6.1%(n=6)、9.1%(n= 8)。值得注意的是，只有養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)了6株(3.2%)大腸桿菌同時(shí)含有多黏菌素耐藥基因mcr-1與碳青霉烯耐藥基因blaNDM，分別為5株(blaNDM-5+mcr-1)、1株(blaNDM-9+mcr-1)。

表2 雞源大腸桿菌的mcr-1與blaNDM檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of mcr-1 and blaNDM of chicken E.coli [%(株)]

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)山東青島地區(qū)雞源大腸桿菌進(jìn)行10種抗生素的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)菌株對(duì)阿莫西林、頭孢氨芐、慶大霉素、多黏菌素E等8種抗生素耐藥率均在76.9%以上。邵志勇等[13]報(bào)道了武漢雞源大腸桿菌對(duì)青霉素、氨芐西林的耐藥率達(dá)到100%；對(duì)頭孢拉定、鏈霉素、氯霉素、氟苯尼考、四環(huán)素的耐藥率超過80%。岳秀英等[14]對(duì)四川省1 458株雞源大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其耐藥率為：青霉素類(85.01%)、磺胺類(83.40%～89.41%)、四環(huán)素類(58.90%～83.01%)、氟喹諾酮類(63.37%～72.03%)、頭孢類(46.9%)、氨基糖苷類(33.91%～50.52%)。這與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。表明我國(guó)雞源大腸桿菌耐藥十分嚴(yán)重。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)雞屠宰場(chǎng)大腸桿菌的MIC90要普遍大于雞養(yǎng)殖場(chǎng)，兩者的MIC50相差不大。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，除替加環(huán)素和亞胺培南外，雞屠宰場(chǎng)大腸桿菌的耐藥率均高于養(yǎng)殖場(chǎng)。說明該地區(qū)屠宰場(chǎng)大腸桿菌耐藥情況較養(yǎng)殖場(chǎng)嚴(yán)重。

賴婧等[15]對(duì)800株大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)耐受3種以上藥物的菌株占92.6%；王娟等[16]發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株占分離菌株的96.28%。毛福超等[17]報(bào)道了豫西地區(qū)禽源大腸桿菌耐藥種類最高的菌株對(duì)18種抗生素耐藥，9～14種耐藥菌株有76株(77.55%)。馮敏燕等[18]在2008-2014年對(duì)山東省不同地區(qū)雞場(chǎng)的210株大腸桿菌進(jìn)行14種抗生素的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，其中對(duì)10種抗生素的耐受性在7年間增長(zhǎng)1倍以上。而本試驗(yàn)中對(duì)8種以上抗菌藥物多重耐藥率高達(dá)62.9%，與國(guó)內(nèi)的一些報(bào)道相一致，表明我國(guó)禽源大腸桿菌耐藥十分嚴(yán)重，且山東青島地區(qū)存在多重耐藥的現(xiàn)象。

大腸桿菌作為人和動(dòng)物重要腸道菌，被認(rèn)為是可移動(dòng)耐藥元件的儲(chǔ)存庫[19]。耐藥基因blaNDM能使目前人類臨床的重要的抗菌藥物碳青霉烯類抗生素(如亞胺培南等)失效。同樣，mcr-1則能導(dǎo)致多黏菌素?zé)o作用，其中mcr-1的多見于禽源。Shen Z等[20]從全國(guó)8個(gè)省份內(nèi)收集了1 611株雞源大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)在20世紀(jì)80年代已經(jīng)存在多黏菌素耐藥的現(xiàn)象，且從2009-2014年耐藥率持續(xù)上升，到2014年已經(jīng)達(dá)30%；朱家杭等[21]對(duì)山東地區(qū)雞源大腸桿菌碳青霉烯耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)blaNDM的檢出率為31%,且blaNDM-5為主要的亞型。這與我們的結(jié)果相一致，提示blaNDM-5可能為山東青島地區(qū)主要的流行亞型。

mcr-1和blaNDM共出現(xiàn)和傳播引起了廣泛的關(guān)注。我們?cè)陴B(yǎng)殖場(chǎng)中還發(fā)現(xiàn)了6株同時(shí)攜帶mcr-1與blaNDM的大腸桿菌，mcr-1+blaNDM-5型與mcr-1+blaNDM-9型分別為5株、1株，且對(duì)幾乎所有測(cè)試抗菌藥物都耐藥。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者在1只雞體內(nèi)分離得到mcr-1與blaNDM-9的大腸桿菌和板琦腸桿菌[22]，這與我們的結(jié)果相一致。Du H等[23]在醫(yī)院的病人中發(fā)現(xiàn)了mcr-1與blaNDM-5共存的肺炎克雷伯菌，且對(duì)多種抗生素耐藥。這種共存菌株的不斷出現(xiàn)對(duì)公共衛(wèi)生安全和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展影響越來越大，應(yīng)該引起我們的重視。