王 松，陳雪玲，游 玲*

（1.宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物與化工工程系，四川 宜賓 644000；3.宜賓學(xué)院 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000）

復(fù)糟發(fā)酵是指糟醅在作為丟糟進(jìn)入廢棄物利用環(huán)節(jié)之前的最后一次發(fā)酵，其主要目的是最大限度地提高原料中淀粉及還原糖等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，獲得品質(zhì)較差，價格較低的復(fù)糟酒，大部分企業(yè)通過添加糖化酶及釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）來提高復(fù)糟酒出酒率[1-3]。然而，實際生產(chǎn)中添加釀酒酵母提升復(fù)糟發(fā)酵出酒率和酒質(zhì)的效果并不明顯。相關(guān)研究和實際生產(chǎn)顯示，非釀酒酵母（non-Saccharomyces）（野生酵母）對發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味有重大貢獻(xiàn)，尤其在白酒發(fā)酵過程中尤為明顯[4-8]，但關(guān)于非釀酒酵母的產(chǎn)香機(jī)理及其對出酒率的影響研究仍較少，生產(chǎn)上也未見有非釀酒酵母菌劑的應(yīng)用。

宜賓作為濃香型白酒主產(chǎn)地，獨特的地理生態(tài)環(huán)境和長期的生產(chǎn)實踐中，傳承并孕育了獨特的濃香型白酒釀造生態(tài)因子[9]，課題組前期從宜賓產(chǎn)區(qū)發(fā)酵糟醅中分離到多株具有特色功能的酵母菌株，其中一株產(chǎn)香酵母Z9Y-91被鑒定為長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus），并在實驗室條件下對其發(fā)酵、產(chǎn)香特性進(jìn)行了研究[10]。本研究將菌株Z9Y-91應(yīng)用于濃香型白酒發(fā)酵，考察其對窖內(nèi)發(fā)酵微生物生態(tài)、糟醅物理化學(xué)特性、出酒率和酒質(zhì)的影響，為其在糧糟酒中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株及糟醅

長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）Z9Y-91（活菌數(shù)為1×108個/g），分離自濃香型白酒窖內(nèi)糟醅，現(xiàn)保存于固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，已委托某生物公司生產(chǎn)出酵母菌劑；對照酵母（活菌數(shù)為5×109個/g）為安琪活性干酵母：市售。

四川宜賓某濃香型白酒企業(yè)同一車間窖齡均為10年左右的2口窖池中為同一批次加曲（580 kg）混勻后的復(fù)糟發(fā)酵糟醅，均分為兩堆，每堆14甑左右，備用。

1.1.2 化學(xué)試劑

硫酸銅、氫氯化鈉、氧化鈉、葡萄糖、亞甲藍(lán)、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：成都科龍試劑廠；乙酸正戊酯（色譜純）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基、酵母賴氨酸培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂粉。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

5975C/7890B氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀、1220型液相色譜儀：美國安捷倫公司；LHS-150SC恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TU-191紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pHS-3C酸度計：上海雷磁儀器廠；SDB-4黏度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 入窖發(fā)酵實驗

將長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）Z9Y-91酵母菌劑及安琪活性干酵母菌劑各3.5 kg（二者實際細(xì)胞數(shù)量比例為1∶50）。在20 L 35 ℃左右溫水活化20 min，與糟醅充分混勻后直接入窖發(fā)酵；對照窖池添加7.0 kg安琪酵母入窖發(fā)酵。封窖發(fā)酵周期45 d，期間分別于0 d（未發(fā)酵）、7 d、15 d、25 d、45 d利用預(yù)埋在窖池內(nèi)對角線上三等分點的半片楠竹片（已預(yù)先清洗、高溫蒸煮）取上、中、下三層共9個取樣點的糟醅樣品，混勻后檢測其理化指標(biāo)、微生物數(shù)量及主要風(fēng)味物質(zhì)含量。

1.3.2 理化指標(biāo)測定

向糟醅中添加等體積純水過濾后，采用pH計測定糟醅pH，采用黏度計測定黏度，糟醅水分采用直接干燥法測定[11]，酸度采用酸堿滴定法測定[12]，淀粉及還原糖采用斐林試劑法測定[13-14]，α-氨基酸態(tài)氮采用滴定法測定[15]。

密度的測定：取兩個相同的燒杯（V燒杯=250 mL），烘干至恒質(zhì)量MA（g），在燒杯中裝滿待測糟培，輕輕搖動燒杯，用竹片沿著燒杯口慢慢刮平，將裝滿糟培的燒杯稱質(zhì)量MB（g），根糟醅密度ρ（kg/m3）計算公式如下：

糟醅中的乙醇及風(fēng)味物質(zhì)含量蒸餾后測定：每份取100g糟醅加無菌水200mL，利用常壓蒸餾裝置蒸餾出100mL餾分，待餾分冷卻至室溫后，采用酒度計測定乙醇含量，同時分裝1.5 mL至2 mL色譜進(jìn)樣瓶及20 mL頂空瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 風(fēng)味物質(zhì)含量測定

采用氣相色譜（gas chromatography，GC）法檢測糟醅樣品餾出液中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。氣相色譜檢測條件：載氣為高純氮氣（N2），柱溫55 ℃保持3 min，以3.5 ℃/min的速率升溫至150 ℃，保持1 min；以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持2 min，以20 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度220 ℃，進(jìn)樣量0.4 μL，分流比10∶1。

采用GC-MS通過頂空固相萃取法檢測糟醅樣品中揮發(fā)性成分含量：準(zhǔn)確稱取1.5 g糟醅及1 g氯化鈉于20 mL頂空固相微萃取瓶中，在向頂空瓶中加入4 mL超純水和25 μL 4-辛醇（500 mg/L），混勻，采用SUPELCO 57328萃取頭70～80 ℃萃取10～15 min，平衡1 min。GC-MS條件：進(jìn)樣口和檢測器溫度均為250 ℃，載氣為氦氣（He），流速1.5 mL/min，起始溫度40 ℃，保持3 min，然后以3 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持15 min。電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度150 ℃。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有理化指標(biāo)檢測設(shè)計3次重復(fù)。所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計，并采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Origin 8.1 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Z9Y-91的菌落及細(xì)胞形態(tài)

圖1 長孢洛德酵母Z9Y-91的菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.1 Colony (A) and cell (B) morphology of Lodderomyces elongisporus Z9Y-91

由圖1可知，產(chǎn)香酵母Z9Y-91在YPD固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)出典型酵母菌落特征，菌體細(xì)胞橢圓形，多邊出芽。

2.2 菌株Z9Y-91對糟醅理化指標(biāo)的影響

圖2 發(fā)酵過程中糟醅理化指標(biāo)的變化Fig.2 Changes of physicochemical indexes of fermented distiller's grain during the fermentation

由圖2A可知，處理組糟醅水分含量達(dá)到62.57%，顯著高于對照組的54.47%（P＜0.05），其最大原因在于處理組糟醅在發(fā)酵中后期生成大量水，導(dǎo)致糟醅水分含量明顯上升，這間接反映了處理糟醅中更強(qiáng)的微生物代謝強(qiáng)度，可能是由于非釀酒酵母對復(fù)糟發(fā)酵糟醅貧瘠營養(yǎng)狀況的適應(yīng)能力更強(qiáng)，其碳源利用譜系更加廣泛[16-17]，可充分利用糟醅中淀粉、纖維素分解產(chǎn)生的糊精、多糖、纖維二糖等生長、代謝，從而產(chǎn)生更多代謝水。由圖2B可知，發(fā)酵過程中處理及對照組窖池糟醅pH均呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，且二者最終pH差異不顯著（P＞0.05），一定程度上反映Z9Y-91對糟醅中有機(jī)酸的生成影響較小。

由圖2C和圖2D可知，對照組窖池糟醅中的淀粉含量下降2.57%，還原糖含量下降1.98%；而處理組窖池的淀粉下降3.67%，還原糖含量下降3.40%，最終淀粉含量僅7.57%，還原糖含量僅有0.63%，均顯著低于對照組（P＜0.05），表明菌株Z9Y-91可明顯提高復(fù)糟發(fā)酵過程中淀粉及還原糖的轉(zhuǎn)化率。另外，發(fā)酵過程中淀粉含量的下降主要是在中后期，而還原糖在整個發(fā)酵周期持續(xù)下降，表明復(fù)糟酒的發(fā)酵過程與糧糟酒的發(fā)酵不同。糧糟酒是典型的一邊糖化一邊發(fā)酵，還原糖的含量呈波動變化趨勢；而復(fù)糟酒發(fā)酵過程中，還原糖及淀粉的含量均處于酵母可利用發(fā)酵的極低水平，酵母菌首先充分利用糟醅中殘留的還原糖生長發(fā)酵，然后再利用淀粉，且淀粉糖化形成的糖能夠快速被酵母利用并轉(zhuǎn)化為乙醇，不會積累在糟醅中[18]。顯然，這也在一定程度上促進(jìn)了反應(yīng)向生成乙醇的方向進(jìn)行，進(jìn)而提高了原料利用率及乙醇產(chǎn)量。

糟醅物理特性對濃香型白酒續(xù)糟發(fā)酵有重要影響[19]，盡管復(fù)糟發(fā)酵糟醅不會進(jìn)入下一輪次發(fā)酵，但通過分析糟醅物理特性變化，可以初步評估該酵母用于糧糟酒發(fā)酵的可行性。由圖2E和圖2F可知，兩個實驗組糟醅密度均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且處理組糟醅密度增加幅度高于對照組，而減少幅度小于對照組，導(dǎo)致發(fā)酵完成后處理組糟培密度顯著高于對照組（P＜0.05），推測是由于處理組糟醅水分含量的波動而導(dǎo)致密度增加所致。同樣，處理及對照組窖池糟醅黏度在發(fā)酵過程中也表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，發(fā)酵開始后菌體快速增殖、淀粉等高聚碳水化合物開始初步降解，黏度升高；發(fā)酵后期這些初步降解的可利用碳源被進(jìn)一步分解利用，同時菌體數(shù)量呈下降趨勢，導(dǎo)致糟醅黏度下降。最終處理組糟醅黏度略高于對照組，可能是由于處理組微生物數(shù)量及代謝強(qiáng)度的增加所致。結(jié)果表明，菌株Z9Y-91強(qiáng)化接種對復(fù)糟發(fā)酵糟培的物理特性存在著一定程度的影響，雖然可能對復(fù)糟發(fā)酵或有限輪次糧糟發(fā)酵的影響不顯著，但持續(xù)多輪次糧糟發(fā)酵是否會累積改變糟醅物理特性，從而影響糟醅通透性，尚有待進(jìn)一步研究。

2.3 菌株Z9Y-91對糟醅微生物數(shù)量變化的影響

圖3 發(fā)酵過程中糟醅微生物數(shù)量變化Fig.3 Changes of microbial number in fermented distiller's grain during the fermentation

由圖3A和圖3B可知，處理組發(fā)酵中后期的菌落總數(shù)有一定波動，但與對照組相比，窖內(nèi)菌落總數(shù)變化趨于一致。同樣，處理組對窖池糟醅中的酵母菌數(shù)量幾乎沒有影響，發(fā)酵7 d后酵母數(shù)量持續(xù)減少，但直至發(fā)酵完成（45 d）仍有大量酵母存活，表明復(fù)糟酒發(fā)酵過程中乙醇可能一直在持續(xù)生成，延長發(fā)酵時間可以提高復(fù)糟酒得率，但企業(yè)需要考慮成本與效益之間的平衡。

由圖3C和圖3D可知，整個發(fā)酵過程中處理組非釀酒酵母數(shù)量均顯著高于對照組（P＜0.05），發(fā)酵第7天時處理組非釀酒酵母數(shù)量為對照組的4倍左右，發(fā)酵25 d時甚至達(dá)到對照組的7倍，雖然兩個實驗組非釀酒酵母數(shù)量變化趨勢均是先增加后減少，但在發(fā)酵過程中處理組非釀酒酵母數(shù)量減少趨勢比對照組小，強(qiáng)化接種菌株Z9Y-91大大延緩窖內(nèi)非釀酒酵母群體數(shù)量的減少過程[20]。另一方面，處理組糟醅中霉菌數(shù)量明顯低于對照，但發(fā)酵結(jié)束時，二者差距縮小，體現(xiàn)出非釀酒酵母生長對霉菌生長的抑制作用，且非釀酒酵母的生長越旺盛，對霉菌生長的抑制也越明顯，這也表明菌株Z9Y-91的接種量并不是越大越好，過大的接種量可能對窖內(nèi)霉菌生態(tài)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。本試驗條件下處理組對窖內(nèi)霉菌生長的影響隨著發(fā)酵結(jié)束而結(jié)束，該結(jié)果可為今后的續(xù)糟發(fā)酵試驗提供一定參考。

2.4 菌株Z9Y-91對復(fù)糟酒風(fēng)味物質(zhì)形成的影響

2.4.1 復(fù)糟酒風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果

通過GC-MS對復(fù)糟酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，其香氣成分總離子流色譜圖見圖4，各香氣成分含量見表1。

圖4 處理組成品酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatography of volatile flavor substances of Baijiu in treatment groups analyzed by GC-MS

由表1可知，GC-MS從處理組成品酒中檢出33種主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物，主要包括醇類8種、酯類17種、酸類3種以及其他化合物5種。酯類化合物對白酒主體風(fēng)格具有重要的影響，占總含量的82.29%，其中尤以乙酯類成分含量最高，如己酸乙酯（62.39%）、丁酸乙酯（6.53%）、戊酸乙酯（3.83%）和辛酸乙酯（1.11%）等。醇類化合物是白酒中醇甜和助香的重要成分，也是酯類化合物的前驅(qū)物質(zhì)，占總量的10.06%，其中含量較高的有正丁醇（3.68%）、仲戊醇（1.41%）、正丙醇（1.28%）、異戊醇（1.04%）、仲丁醇（0.91%）以及正己醇（0.89%）等，這些高級醇可以賦予白酒特殊的香氣，使酒體豐滿柔和、圓潤醇厚?？傮w來說，復(fù)糟酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和數(shù)量均遠(yuǎn)低于糧糟酒。

表1 處理組成品酒各香氣成分含量GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of aroma components contents of Baijiu in treatment groups analyzed by GC-MS

2.4.2 菌株Z9Y-91對復(fù)糟酒主要酯類物質(zhì)的影響

由圖5可知，處理組成品酒中主體酯類物質(zhì)如己酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸乙酯含量分別為2.92 g/L、0.15 g/L、1.98 g/L，與對照組相比雖然沒有顯著性差異（P＞0.05），均有不同程度增加；而如乳酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲酸乙酯等酯類含量相比對照組顯著下降（P＜0.05），在一定程度上改善了酒體中各種酯類成分的含量和比例，符合濃香型白酒“増己降乳”趨勢，從而提高復(fù)糟酒的酒質(zhì)[21]。值得注意的是，處理組乙酸異戊酯含量為0.84 g/L，相比對照組顯著增加了3倍多（P＜0.05），且檢測出了對照組中未發(fā)現(xiàn)的己酸異戊酯，含量達(dá)0.77 mg/100 mL，前人研究表明[22]，非釀酒酵母強(qiáng)化發(fā)酵可顯著提高這類酯在發(fā)酵酒尤其是果酒中的含量。一般來說，這2種酯類呈現(xiàn)明顯花果香氣特征，常用于食用果香型香精香料的調(diào)配，可使復(fù)糟酒風(fēng)味更加突出、協(xié)調(diào)、有層次感[23]。

圖5 成品酒中主體酯類物質(zhì)的種類及含量Fig.5 Types and contents of main esters in Baijiu

2.4.3 菌株Z9Y-91對復(fù)糟酒主要醇類的影響

由圖6可知，在醇類物質(zhì)方面，首先處理組成品酒中甲醇生成量為0.08 g/L，幾乎只有對照組甲醇含量的一半，添加菌株Z9Y-91強(qiáng)化發(fā)酵顯著降低了處理組成品酒中的甲醇含量（P＜0.05）；另外，除異丁醇、異戊醇含量低于對照組外，處理組其余檢出醇類物質(zhì)含量均顯著高于對照組（P＜0.05），特別是具有典型玫瑰花香的β-苯乙醇含量是對照組的3倍，達(dá)到0.33 mg/100 mL，可顯著增強(qiáng)酒體的層次感[24]。

圖6 成品酒中主要醇類物質(zhì)的種類及含量Fig.6 Types and contents of main alcohols in Baijiu

2.5 菌株Z9Y-91對復(fù)糟酒出酒率及酒質(zhì)的影響

由表2可知，發(fā)酵結(jié)束時，處理組糟醅中酒精度可達(dá)1.39%vol，比對照組高19.83%（P＜0.05），在發(fā)酵過程監(jiān)測中也發(fā)現(xiàn)，處理組窖池糟醅中的乙醇含量在整個發(fā)酵階段中均高于對照組，有研究表明[25]，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵能顯著提高乙醇產(chǎn)量。同時，兩個實驗組糟醅乙醇含量均在發(fā)酵7 d后快速增加，發(fā)酵15 d后保持穩(wěn)定，發(fā)酵25 d后又開始快速上升，直至發(fā)酵結(jié)束，說明整個發(fā)酵過程中存在兩個乙醇的主要生成時期，一是發(fā)酵中前期，二是發(fā)酵后期，再次驗證了延長發(fā)酵時間可以提高復(fù)糟酒產(chǎn)量的可能性。

表2 發(fā)酵完成后糟醅中酒精度、出酒量及感官評價Table 2 Ethanol content,liquor yield and sensory evaluation of fermented distiller's grain after the fermentation

蒸酒后統(tǒng)計產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，處理組窖池平均每甑產(chǎn)酒23.92 kg，顯著高于對照組的19.17 kg（P＜0.05），產(chǎn)量提高近25%；另外，經(jīng)技術(shù)人員品評后，處理組所得酒液具有明顯的植物花草香，入口更加協(xié)調(diào)，酒體層次感多樣，香氣更加優(yōu)雅，與GC-MS檢測結(jié)果基本保持一致。

3 結(jié)論

功能酵母菌應(yīng)用于生產(chǎn)從而提升濃香型白酒的產(chǎn)量和品質(zhì)一直是白酒企業(yè)采取的有效手段之一。然而，濃香型白酒是自然接種、多菌種混合固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)上采用續(xù)糟工藝，這種特殊的生產(chǎn)工藝可能會使人工強(qiáng)化接種持續(xù)性的對生產(chǎn)帶來不可預(yù)知的影響。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，將長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）Z9Y-91入窖發(fā)酵用于復(fù)糟酒生產(chǎn)，結(jié)果表明，強(qiáng)化接種菌株Z9Y-91可增強(qiáng)糟醅中微生物區(qū)系的代謝強(qiáng)度，提高淀粉利用率，出酒率明顯提高；同時能夠改善酒體中主要酯類和醇類含量和比例，降低甲醇含量，提高復(fù)糟酒品質(zhì)。另一方面，強(qiáng)化接種Z9Y-91可對糟醅物理特性及微生物群落產(chǎn)生一定影響，可能對糧糟酒生產(chǎn)過程中多輪次續(xù)糟發(fā)酵生產(chǎn)帶來累積影響?？傊?，菌株Z9Y-91在復(fù)糟酒生產(chǎn)應(yīng)用中展現(xiàn)了一定的應(yīng)用前景。