葉月華，劉曉艷 *，白衛(wèi)東，黃漢聰

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市如豐果子調(diào)味食品有限公司，廣東 廣州 510300）

醬油的歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，得益于其特有的色、香、味、體而備受歡迎，不僅可以增加消費(fèi)者的食欲，而且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此成為我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品之一。但美中不足的是，在醬油釀造過(guò)程中，會(huì)自發(fā)性地產(chǎn)生有毒有害的可能致癌物質(zhì)即氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）。迄今，很多研究者在其他發(fā)酵食品和酒精飲料也檢測(cè)到EC的存在。據(jù)報(bào)道[1]，醬油中EC的含量范圍是＜檢出限（limit of detection，LOD）～43.93 ng/g，而酒類(lèi)中EC的含量范圍是＜LOD～239.40 ng/g。盡管醬油中EC的含量相對(duì)于酒精飲料中EC的含量較低，但醬油在人們的日常飲食當(dāng)中占據(jù)不可或缺的地位，毫無(wú)疑問(wèn)日積月累的攝入量仍然會(huì)給人體的健康帶來(lái)一定隱患，很可能成為EC的主要危害來(lái)源[2]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織規(guī)定EC含量≤20 μg/L[3]；1985年，加拿大對(duì)各類(lèi)酒中的EC限量標(biāo)準(zhǔn)作出規(guī)定：白蘭地和烈性酒不能超過(guò)0.4 mg/L，強(qiáng)化葡萄酒和日本清酒不能超過(guò)0.10 mg/L，蒸餾酒不能超過(guò)0.15 mg/L，佐餐葡萄酒不能超過(guò)0.03 mg/L；1988年，美國(guó)也限定了葡萄酒中EC的含量：佐餐葡萄酒不得超過(guò)0.015 mg/L，餐后葡萄酒不得超過(guò)0.06 mg/L[4]；然而我國(guó)尚未對(duì)發(fā)酵制品中EC制定限量標(biāo)準(zhǔn)?！懊褚允碁樘?，食以安為先”。隨著人們對(duì)食品安全重視程度的提高，作為醬油生產(chǎn)大國(guó)應(yīng)盡快解決醬油中EC的形成機(jī)理及減除的問(wèn)題。因此，很有必要探究如何抑制醬油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，有利于保障我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的安全性和維護(hù)其國(guó)際形象[5]。本文針對(duì)醬油中EC的危害、形成機(jī)制、檢測(cè)技術(shù)及調(diào)控措施等方面進(jìn)行綜述，以期為醬油中EC的控制，提高醬油的安全性提供參考。

1 氨基甲酸乙酯的概況

氨基甲酸乙酯又稱(chēng)為烏拉坦（urethane），易溶于水、乙醇和乙醚，分子式為C3H7NO2，分子質(zhì)量為89.09。早年EC的用途相當(dāng)廣泛，是制造香料、醫(yī)藥等的中間材料及用于生物化學(xué)研究。20世紀(jì)40年代初，EC是主要的麻醉藥；1943年，NETTLESHIP首次發(fā)現(xiàn)了EC的致癌性，只是當(dāng)時(shí)EC在食品中的含量并未足夠引起人們的重視[6]；1974年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)確定EC為2B類(lèi)致癌物質(zhì)，直到2007年，再次將EC從2B類(lèi)致癌物質(zhì)列入2A類(lèi)致癌物質(zhì)[7]。自此，學(xué)者們深入剖析了EC的致癌機(jī)理，發(fā)現(xiàn)EC屬于多位點(diǎn)致癌物，可以通過(guò)多種途徑進(jìn)入人體內(nèi)，其中大概5%的EC無(wú)須代謝以排泄物的形式直接排出體外；而90%以上的EC在肝臟細(xì)胞的微粒酯酶水解作用下產(chǎn)生乙醇、氨和碳水化合物并被代謝掉；還有0.1%左右的EC通過(guò)線粒體中的細(xì)胞色素P450作用下氧化成N-羥基-氨基甲酸乙酯，N-羥基-氨基甲酸乙酯會(huì)誘發(fā)部分器官中的酯酶產(chǎn)生O2-及NO，Cu2+可以催化NO和O2-產(chǎn)生過(guò)氧化氮，最終形成8-羥基-脫氧鳥(niǎo)苷，隨后會(huì)導(dǎo)致脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）發(fā)生堿基顛換，由此誘發(fā)癌變[8]。此外約0.5%的EC被細(xì)胞色素P450氧化成乙烯基氨基甲酸乙酯，后轉(zhuǎn)化成的乙烯基氨基甲酸酯環(huán)氧化物能夠與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）等結(jié)合誘發(fā)堿基對(duì)置換從而造成DNA損壞。目前國(guó)內(nèi)研究EC的對(duì)象主要是酒類(lèi)，而其他釀造食品如醬油中EC的研究相對(duì)較少，這是一項(xiàng)亟待解決的工作[9]。

2 醬油中氨基甲酸乙酯的形成機(jī)制

已有文獻(xiàn)報(bào)道，EC的形成與其前體物質(zhì)的種類(lèi)和含量有關(guān)，而前體物又和發(fā)酵微生物本身性質(zhì)密切相關(guān)（如釀酒酵母可以代謝精氨酸為尿素，而醬油中的乳酸桿菌可以代謝精氨酸為瓜氨酸）[10]。由于發(fā)酵制品中的EC主要是由乙醇和尿素、瓜氨酸等前體物質(zhì)自發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生的，因此酒中大量的乙醇為EC的形成提供了更好的環(huán)境，所以其EC的平均含量（35.74 ng/g）比醬油中EC的平均含量（23.45 ng/g）高，如表1所示[1]。但兩者中EC的具體形成機(jī)制是否一樣還需進(jìn)一步研究。

表1 市售酒類(lèi)和醬油中的氨基甲酸乙酯含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of ethyl carbamate contents in commercial alcoholic beverage and soy sauce

在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過(guò)程中，釀造原料會(huì)被微生物分解成小分子物質(zhì)，有一部分會(huì)進(jìn)入常見(jiàn)酵母菌（如魯氏接合酵母、畢赤酵母等）后經(jīng)糖酵解途徑（embden meyerhof pathway，EMP）和鳥(niǎo)氨酸循環(huán)（ornithine cycle）這兩種途徑生成的尿素和乙醇被釋放到細(xì)胞外；另一部分則經(jīng)胞內(nèi)精氨酸脫亞氨酶途徑被嗜酸乳酸足球菌利用，從而代謝精氨酸生成瓜氨酸和氨甲酰磷酸被釋放到細(xì)胞外，這兩種重要的中間物質(zhì)在整個(gè)發(fā)酵環(huán)境體系中聚合后，由特定的酶的催化下從而形成EC。

MATUSUDO T等[11]曾認(rèn)為醬油中EC的主要前體物質(zhì)是瓜氨酸，這是分別通過(guò)研究日式醬油和國(guó)內(nèi)醬油分析前體物的添加與EC生成量的關(guān)系得出的重要結(jié)論。乳酸發(fā)酵時(shí)期和乙醇發(fā)酵時(shí)期都能積累瓜氨酸，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瓜氨酸的主要積累時(shí)期是乳酸發(fā)酵期。瓜氨酸在乳酸發(fā)酵期主要是通過(guò)嗜酸乳酸足球菌代謝精氨酸產(chǎn)生的，在醬油的高鹽條件下，嗜酸乳酸足球菌在精氨酸脫亞氨酶途徑中分別負(fù)責(zé)編碼精氨酸脫亞胺酶和鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的兩個(gè)關(guān)鍵基因arcA和arcB的表達(dá)量縮減，造成瓜氨酸的生成速率大于其降解速率，從而導(dǎo)致瓜氨酸的積累；瓜氨酸在乙醇發(fā)酵期的積累則是因?yàn)橛坞x脂肪酸的存在促使更多的精氨酸轉(zhuǎn)化成瓜氨酸。此外，pH和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等環(huán)境因素也會(huì)影響精氨酸脫亞氨酶途徑中編碼精氨酸脫亞氨基酶（arginine desiminase，AD）arc A；編碼鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（ornithine carbamyl transferase，OCT）arc B；編碼氨甲酰磷酸激酶（carbamyl phosphate kinase，CPK）arc C這3種關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)醬油中瓜氨酸的積累產(chǎn)生影響。

由于醬油樣品易受生產(chǎn)原料、發(fā)酵方式、工藝、產(chǎn)地等因素的限制，因此不同地區(qū)和不同釀造工藝的醬油中EC含量會(huì)大相徑庭（見(jiàn)表2）[13]。通常情況下，添加入酵母的醬油EC含量高于傳統(tǒng)工藝醬油的，原因是外源性加入的酵母菌會(huì)通過(guò)代謝精氨酸產(chǎn)生尿素，致使EC含量也會(huì)隨之增加。

表2 不同地域和各類(lèi)生產(chǎn)工藝醬油中的氨基甲酸乙酯含量Table 2 Ethyl carbamate contents in soy sauce in different regions and various production processes

3 醬油中氨基甲酸乙酯的檢測(cè)方法

由于EC濃度低、在定量測(cè)定時(shí)還會(huì)受到不同基質(zhì)不同程度的干擾，因此需要特別靈敏的方法[14]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者始終致力于對(duì)檢測(cè)醬油中EC的研究方法進(jìn)行不斷的優(yōu)化。目前，已有報(bào)道的針對(duì)醬油中EC的檢測(cè)方法[15]主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatographytandem massspectrometry，GC-MS/MS）技術(shù)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術(shù)、高效液相色譜-熒光檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）技術(shù)和熒光光度（fluorophotometry）法等。

3.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是多數(shù)文獻(xiàn)所提及到的用于檢測(cè)食品中EC含量的方法，其結(jié)合了色譜法的高分離效能與質(zhì)譜法的高鑒別能力，對(duì)EC達(dá)到同時(shí)定量、定性的檢測(cè)目的。以下是研究者將醬油樣品采用不同的前處理方法，包括液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）、固相萃?。╯olidphaseextraction，SPE）、固液萃?。╯olid liquid extraction，SLE）、分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE）、頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HSSPME），結(jié)合GC-MS對(duì)測(cè)定結(jié)果等方面進(jìn)行分析比較，以此驗(yàn)證方法的可行性與可靠性。

3.1.1 固相萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

呂昱等[16]建立一種使用選擇離子掃描（selective ion monitoring，SIM）模式以及外標(biāo)法的固相萃取結(jié)合GC-MS方法來(lái)檢測(cè)貴州當(dāng)?shù)氐氖惺坩u油，其中醬油需在萃取小柱中停留30 min，而后選擇1∶9（V/V）的丙酮-二氯甲烷來(lái)洗脫EC，由于EC易溶于C18萃取柱中，所以固相萃?。⊿PE）比液液萃?。↙LE）更能有效分離提取醬油中的EC。結(jié)果顯示，EC的含量為340～440 μg/mL，在1～10 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.014 μg/mL，定量限（S/N=10）為0.048 μg/mL，加標(biāo)回收率達(dá)97.78%，加標(biāo)回收率結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.59%；其特點(diǎn)在于較高的靈敏度、良好的精密度以及較廣的線性范圍等，能夠達(dá)到定性定量的目的。

3.1.2 固液萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

肖泳[17]分別采用液液萃?。↙LE）和固液萃?。⊿LE）對(duì)醬油中EC進(jìn)行前處理，其中LLE使用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，而SLE的層析柱使用可吸附顏色的活性炭-硅膠和無(wú)水硫酸鈉作填充，并在條件優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)選擇40 mL甲醇∶二氯甲烷（1∶9，V/V）使EC回收率達(dá)到90.34%～98.96%，日內(nèi)精密度RSD為2.61%～4.67%，日間精密度RSD為3.53%～6.05%，結(jié)合GC-MS檢測(cè)出EC在20～1 500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有著良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限（S/N＞3）為4 μg/L；然而LLE法的日內(nèi)精密度RSD為4.14%～5.27%，日間精密度RSD為4.53%～7.22%，不僅回收率最低達(dá)不到70%，還存在大量色素和造成離子源污染。綜上研究發(fā)現(xiàn)，SLE法相比于LLE法具有更高的精準(zhǔn)度、更好的重現(xiàn)性且有機(jī)溶劑耗費(fèi)少，尤為凸顯其環(huán)保性。因此，SLE結(jié)合GC-MS法檢測(cè)醬油中EC更具優(yōu)勢(shì)。

3.1.3 分散固相萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

目前測(cè)定醬油中EC的GC-MS 法大多采用以硅藻土為填料的SPE進(jìn)行凈化處理，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DSPE比SPE法更快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定且無(wú)需較大的溶劑體積[18]。章晴等[19]對(duì)飲料酒中的EC用GC-MS測(cè)定時(shí)，其分散固相萃取的凈化方法使用了N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA），后發(fā)現(xiàn)它對(duì)醬油中的氨基酸、有機(jī)酸和色素等大量干擾成分有很不錯(cuò)的消除能力。對(duì)此，陳達(dá)煒等[20]對(duì)醬油樣品液液萃取時(shí)選擇的是乙腈，DSPE凈化用N-丙基乙二胺（PSA），采用氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測(cè)定醬油中的EC。學(xué)者優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件（選擇離子檢測(cè)模式和選取100 mg PSA粉）后發(fā)現(xiàn)EC在10～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有著較好的線性相關(guān)關(guān)系，方法的檢出限為2.0 μg/kg，此法簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確，具有很好的實(shí)際推廣價(jià)值。

3.1.4 頂空-固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

豐帆[21]考慮到固相萃取法對(duì)樣品前處理的復(fù)雜性和耗時(shí)性，在此基礎(chǔ)上建立了頂空固相微萃取技術(shù)，用以處理不同種類(lèi)醬油樣品，可有效縮短時(shí)間且不需要萃取溶劑，簡(jiǎn)單方便，易穩(wěn)定；分別優(yōu)化了萃取纖維頭、pH值、萃取時(shí)間、萃取溫度等條件，同一樣品經(jīng)GC-MS檢測(cè)所得結(jié)果與美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（association of official analytical chemists，AOAC）官方檢測(cè)結(jié)果比對(duì)相差無(wú)幾（相關(guān)系數(shù)R2＞0.95），檢出限（S/N=3）為1.0 μg/L，EC回收率達(dá)70.56%～129.21%，足以證明該方法的可行性與準(zhǔn)確性。此外，還有待研究合成特異性吸附的纖維頭涂層，可進(jìn)一步提高和完善氨基甲酸乙酯的檢測(cè)靈敏度和有效性。

張燕等[22]對(duì)萃取纖維涂層等分析條件的優(yōu)化也建立了一種HS-SPME-GC/MS方法，頂空萃取是將纖維暴露于樣品，頂空吸附不同pH值的樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醬油中EC的回收率達(dá)到了70.56%～129.21%，檢出限為1.0 μg/L，日內(nèi)精密度RSD為3.69%，日間精密度RSD為8.50%；研究表明該方法具有一定的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，不足的是定量檢測(cè)的精確度不高，檢測(cè)范圍較窄，檢測(cè)周期較長(zhǎng)。

3.2 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

3.2.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

GC-MS法因其靈敏度較高被視為測(cè)定酒中EC最為普遍的方法[21]，但醬油基體復(fù)雜會(huì)嚴(yán)重干擾GC-MS中絕大多數(shù)特征離子，其定性確證能力因此受到很大局限。徐小民等[23]利用有機(jī)硅藻土填充的固相萃取法提取醬油中的EC，所采用的同位素內(nèi)標(biāo)法比外標(biāo)法大大減少將近7倍的有機(jī)溶劑用量，EC的回收率達(dá)96.2%～104.0%；后經(jīng)比較多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式與選擇離子監(jiān)測(cè)（selected ion monitoring，SIM）模式的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MRM模式對(duì)EC定性定量的準(zhǔn)確性較高，檢測(cè)限為2 μg/kg，還能避免SIM模式出現(xiàn)的基體干擾和假陽(yáng)性現(xiàn)象。

3.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

PARK S K等[24]以韓國(guó)醬油作為研究對(duì)象，建立了使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（highperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry，HPLC-MS/MS）技術(shù)測(cè)定其EC含量的方法，EC的質(zhì)量濃度在10～100 μg/L和0.1～20 μg/L范圍內(nèi)變化時(shí)，該方法均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.25 μg/L；缺點(diǎn)是儀器設(shè)備昂貴，樣品制備繁瑣，測(cè)定周期較長(zhǎng)。

綜上可知，串聯(lián)質(zhì)譜方法要優(yōu)于單級(jí)質(zhì)譜法，但目前遠(yuǎn)不足以滿(mǎn)足市場(chǎng)量大面廣的需求。

3.3 高效液相色譜-熒光檢測(cè)器技術(shù)

該方法適用于檢測(cè)酒類(lèi)飲料中的EC含量，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)便，設(shè)備要求簡(jiǎn)單是優(yōu)點(diǎn)所在，但檢測(cè)限卻僅達(dá)20 μg/L左右[25]。由于醬油等發(fā)酵食品EC濃度水平較低，因此并不建議使用該方法測(cè)定。不過(guò)，陳可[26]通過(guò)利用乙酸乙酯萃取醬油中的EC，優(yōu)化樣品的衍生化反應(yīng)條件以及高效液相色譜熒光檢測(cè)器（high performance liquid chromatographyfluorescence detector，HPLC-FLD）法的色譜條件，使其檢測(cè)限降低至5 μg/L，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.988，平均回收率達(dá)到100.12%，能基本滿(mǎn)足醬油中EC的檢測(cè)需求。同時(shí)還利用該方法對(duì)不同種類(lèi)的醬油進(jìn)行了分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC含量與釀造工藝和地域存在很大的關(guān)聯(lián)性，如低鹽固態(tài)法和南方醬油中EC含量要高于高鹽稀態(tài)法和北方醬油；對(duì)于不同功能型醬油EC含量相差無(wú)幾，濃口醬油和老抽中EC含量比淡口醬油和生抽低約10%。魏華[27]分別采用紫外分光光度法、熒光光度法對(duì)醬油中的EC進(jìn)行有效測(cè)定，結(jié)果經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，熒光光度法對(duì)醬油中EC的最低檢測(cè)限值為0.01 mg/L，低于紫外分光光度法的0.04 mg/L，表明熒光光度法檢出效果更佳。黃秋婷等[28]針對(duì)醬油類(lèi)樣品的特點(diǎn)，采用優(yōu)化的QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）前處理方案，更具針對(duì)性的開(kāi)發(fā)了四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜的EC檢測(cè)手段，在1～20 μg/L范圍內(nèi)相關(guān)性良好，檢出限為1.5 μg/kg，具有較佳的精準(zhǔn)度和靈敏度。

綜上研究發(fā)現(xiàn)，從線性范圍、檢出限、回收率和精密度等方面對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)GC-MS法比HPLC-FLD法精準(zhǔn)度更高、重現(xiàn)性更好以及檢出限要低一些，顯然GC-MS法會(huì)更為成熟。而HPLC-MS/MS法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、靈敏度等特性也要比GC-MS更勝一籌，但美中不足的是它和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法一樣面臨儀器價(jià)格不菲和維護(hù)成本過(guò)高等問(wèn)題，因此也難以推廣使用。經(jīng)過(guò)諸多方法的比較，目前SPE結(jié)合GC-MS法相對(duì)會(huì)占優(yōu)勢(shì)，在保證試劑用量少的同時(shí)還能批量操作，而且GC-MS法也是國(guó)際檢測(cè)EC含量的標(biāo)準(zhǔn)[29]，倘若研究學(xué)者能夠在此基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件將會(huì)是今后較有發(fā)展前景方向的檢測(cè)方法。

4 醬油中氨基甲酸乙酯的控制

已有研究表明[30]，屬于混菌發(fā)酵的醬油在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)存在微生物代謝某些含氮物質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生多類(lèi)前體物質(zhì)參與EC的合成，導(dǎo)致醬油潛在的安全隱患。目前很多研究策略專(zhuān)注于減少這些前體物質(zhì)。多種方法已被開(kāi)發(fā)用于控制EC的合成，普遍使用的方法有物理、微生物、理化和酶法等技術(shù)。

4.1 物理法

引入活性炭過(guò)濾技術(shù)是用于減除醬油中EC有效且常見(jiàn)的方法，該方法可以去除約45%～47%的EC，但活性炭過(guò)濾會(huì)導(dǎo)致其口感下降[31]，其應(yīng)用價(jià)值受到一定的限制。據(jù)報(bào)道，黃酒中EC 的直接減除與多種材料有關(guān)，如活性炭、硅膠、硅藻土、殼聚糖和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）等，其中用硅藻土吸附黃酒中的EC后能最大程度地保持酒體風(fēng)味，故在黃酒中使用較多，且符合經(jīng)濟(jì)效益。由于硅藻土產(chǎn)地不同，吸附性能差異很大，天然的硅藻土雜質(zhì)含量也較高，會(huì)限制其在多方面的應(yīng)用，需要通過(guò)提純改性等手段進(jìn)一步提高其吸附性能。曹甜等[32-33]利用堿法改性硅藻土和殼聚糖改性硅藻土，探索其對(duì)黃酒中EC的吸附性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)堿處理后，硅藻土對(duì)黃酒中EC的減除率大大提升，且處理后酒體風(fēng)味與原酒基本一致?？梢試L試將此法運(yùn)用于減除醬油中的EC。

4.2 微生物干預(yù)法

張繼冉[13]嘗試從醬油乳酸發(fā)酵末期的醬醪樣品中篩選出控制EC前體物產(chǎn)生的解淀粉芽孢桿菌JY06，該芽孢桿菌在高濃度NaCl條件下利用精氨酸且不積累瓜氨酸。在小型模擬生產(chǎn)體系中添加該菌干擾微生物群落和消耗前體物質(zhì)，可以達(dá)到降低EC積累的效果。由此可知，學(xué)者通過(guò)探尋一種關(guān)鍵微生物是對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中EC前體形成有關(guān)聯(lián)性的，并理清了微生物代謝途徑與EC前體生成的關(guān)系，闡述了醬油中EC的生成途徑，在控制或減除醬油中EC含量這方面意義深刻，具有前瞻性。

張夢(mèng)寒[34]以上述的解淀粉芽孢桿菌JY06 作為研究對(duì)象，通過(guò)高通量篩選手段對(duì)3種解淀粉芽孢桿菌JY06（分別采取紫外誘變、等離子誘變和定向馴化育種方法）進(jìn)行改造，目的是提高菌株JY06 利用精氨酸的能力。學(xué)者將由此獲得的若干個(gè)可高效利用精氨酸的突變株添加入在醬油發(fā)酵前期的醬醪中，結(jié)果表明，其在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)EC及其前體瓜氨酸的降解效果甚好，且證實(shí)了該菌株不會(huì)對(duì)醬油風(fēng)味品質(zhì)造成影響。

4.3 優(yōu)化發(fā)酵工藝

王旭鋒[35]通過(guò)使用醬汁模擬體系替代完全醬醪發(fā)酵，使發(fā)酵在相對(duì)封閉環(huán)境中進(jìn)行的同時(shí)，對(duì)醬油發(fā)酵中常見(jiàn)的原材料、常用酵母以及發(fā)酵溫度3種發(fā)酵工藝條件進(jìn)行調(diào)控，跟隨發(fā)酵過(guò)程研究其中EC及其前體物的變化情況，找到可以在一定程度上減少EC合成的最佳工藝組合（18 ℃的低溫發(fā)酵與添加魯氏接合酵母S），從而為高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵生產(chǎn)控制提供理論依據(jù)。經(jīng)調(diào)查，該方法的優(yōu)勢(shì)在于安全性高和成本低。

4.4 酸性脲酶法

2015 年，KIM Y G等[36]以添加脲酶的韓國(guó)豆瓣醬為研究對(duì)象，在含有不同前體物（如乙醇、尿素和瓜氨酸）的發(fā)酵體系中加入此酶，結(jié)果顯示，發(fā)酵后的豆瓣醬中EC含量分別下降了17.3%、18.8%和38.4%。說(shuō)明脲酶用于類(lèi)似的發(fā)酵食品中EC的控制會(huì)產(chǎn)生異曲同工之妙。但是尚未有耐高滲脲酶能夠在高濃度NaCl的醬油發(fā)酵體系中完全適應(yīng)的相關(guān)報(bào)道，對(duì)此還需要進(jìn)一步深究。

4.5 氨基甲酸乙酯水解酶法

2006 年，日本首次從馬紅球菌（Rhodococcus equi）中獲得了EC水解酶的序列，但該酶是對(duì)一系列氨基甲酸乙酯類(lèi)化合物都有效，并非只針對(duì)于EC水解，其對(duì)EC的目的性不強(qiáng)。因此，EC水解酶在食品中的使用效果還有待考究。在國(guó)內(nèi)，李京京等[37]從小鼠胃腸道中分離得到的賴(lài)氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）SC02中EC水解酶進(jìn)行純化后獲得了純酶。經(jīng)驗(yàn)證，此酶可耐受高濃度的酒精和鹽分，因此具備在醬油中消除EC的開(kāi)發(fā)潛力。卜攀攀[38]從鼠胃中分離到了一株肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），特點(diǎn)在于其能夠產(chǎn)耐高滲EC水解酶，學(xué)者對(duì)該酶純化后并深究該酶的性質(zhì)。研究表明，該酶在NaCl含量18%的條件下仍能保持40%的活性，因此應(yīng)用在去除醬油中EC這一領(lǐng)域具有無(wú)限的潛在價(jià)值?？墒窃撁覆灰啄褪芩岬拿{迫，在環(huán)境pH＜6時(shí)，酶活性顯著下降。因而，該酶需要經(jīng)過(guò)耐酸性改造后方可適用于醬油生產(chǎn)。以上這些減除策略為醬油生產(chǎn)中直接消除EC奠定基礎(chǔ)的同時(shí)還提供了不少新的出路。

5 展望

目前，針對(duì)于醬油中EC的檢測(cè)方法未趨成熟，還不夠穩(wěn)定、快速和可靠；大多數(shù)仍停留于實(shí)驗(yàn)室階段，還不足以投入到大型生產(chǎn)當(dāng)中。與本文所綜述的檢測(cè)手段相比較而言，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)則具有高特異性、高靈敏度、簡(jiǎn)單快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前對(duì)EC的酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的研究還很缺乏，可以考慮利用單克隆抗體提高酶聯(lián)免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)的特異性，研發(fā)一款高效實(shí)用的EC快速檢測(cè)試劑盒，方可作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法的一個(gè)重要的補(bǔ)充手段[39]。

盡管現(xiàn)有條件已檢出存在EC，但其生成的各種條件及影響因素還有待加強(qiáng)研究證實(shí)，才能更好地完善減除EC的措施。下一步可以考慮在醬油發(fā)酵中直接添加某種安全的化學(xué)物質(zhì)抑制EC的合成或者研發(fā)可以降低EC的食品添加劑（如天然提取物），均可作為未來(lái)的研究熱點(diǎn)及趨勢(shì)[40]。另外，不僅要確保減除EC含量，更要保證醬油產(chǎn)品的感官品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及貯藏期等問(wèn)題，往后進(jìn)一步研究不同減除技術(shù)對(duì)其貨架期的影響也是很有必要的。這些舉措將有利于我國(guó)盡快建立有關(guān)發(fā)酵食品中EC的安全標(biāo)準(zhǔn)體系，同時(shí)也為醬油行業(yè)的發(fā)展保駕護(hù)航[41]。