李莉，鄭璇，張曉嶺，鄒家素

（重慶市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，重慶 401147）

氯霉素類抗生素主要包括氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜氯霉素，它們能與細菌核糖體結合，干擾蛋白質合成而抑制細菌生成。氯霉素作為第一個人工合成的抗菌藥物，表現(xiàn)出廣譜的抗菌能力；甲砜霉素為氯霉素苯環(huán)上的硝基被一甲砜基取代后的產(chǎn)物，體內抗菌活性比氯霉素更強，水溶性和穩(wěn)定性比氯霉素更高，是氯霉素類的第二代廣譜抗菌藥；氟甲砜霉素是甲砜霉素的單氟衍生物，對甲砜霉素和氯霉素耐藥的菌株仍對氟甲砜霉素敏感。氟甲砜霉素的抗菌譜與抗菌活性略優(yōu)于氯霉素和甲砜霉素，是氯霉素類的第三代廣譜抗菌藥［1–3］。

氯霉素類抗生素被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜禽養(yǎng)殖中，但氯霉素類抗生素對人體造血功能有較大損害，因而威脅人類的健康，歐盟、美國等國家和地區(qū)先后將其列為禁用藥物［4–5］。隨著畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國抗生素的種類和用量的日益增加，人類和動物所使用的大部分抗生素類藥物未經(jīng)代謝便通過糞便或者尿液排出體外，進入環(huán)境，對地下水和地表水體造成一定程度的污染，進而影響人類的飲用水安全［6］。為適應新時期環(huán)境保護的需要，開展水環(huán)境中氯霉素殘留的檢測研究具有非常重要的意義。

高效液相色譜–串聯(lián)質譜（HPLC–MS／MS）法具有特異性強、靈敏度高、抗干擾能力強等特點，已廣泛應用于氯霉素殘留的分析［7–9］。牛奶、雞蛋、肉制品、水產(chǎn)品等食品都建立了利用該方法測定氯霉素的標準［10–14］，但水中抗生素的測定研究尚在起步階段［15］，測定方法多為多類抗生素混合測定，或目標物為單一氯霉素。筆者利用固相萃取（SPE）對樣品進行濃縮凈化，結合LC–MS／MS 分析技術，以氯霉素–D5 為內標，對樣品萃取劑的流量、固相萃取洗脫溶劑、液相分離流動相、質譜條件等方面進行探討和試驗，并確定了樣品保存時間，建立了一種簡單、快速、準確地同時定量檢測水環(huán)境中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜氯霉素3 種抗生素殘留的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜–串聯(lián)質譜儀：TSQ ACCESS 型，美國Thermo Scientific 公司；

固相萃取柱：Oasis HLB 型，6 mL／150 mg，美國Waters 公司，使用前需分別用10 mL 甲醇和10 mL 超純水活化；

濾膜：孔徑為0.2μm，親水性聚丙烯（GHP）針式微孔濾膜；

甲醇：農(nóng)殘級，韓國Duskan Minchem Corp 公司；

乙酸銨–甲醇溶液：取80 mL 乙酸銨溶液（5 mmol／L）與20 mL 甲醇混合；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標準物質：純度分別為98.5%，99.0%，99.8%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；

氯霉素-D5標準溶液：100 ng／μL，介質為乙腈，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標準儲備液：質量濃度均為1.00 mg／mL，取對應標準物質適量，用甲醇溶解定容制得；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標準溶液：氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的質量濃度均為100 μg／mL，取氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標準儲備液適量，混合，用甲醇稀釋制得；

氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素系列混合標準工作溶液：氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的質量濃度均為1.0～100 μg／L，取對應標準溶液及氯霉素-D5標準溶液適量（作為內標物），用甲醇稀釋制得；

實驗用水為超純水。

1.2 樣品前處理

水樣經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，取1 000 mL 濾液，調節(jié)pH 至4～7，用固相萃取柱進行富集萃取。水樣以低于10 mL／min 的流量通過HLB 小柱，待全部樣品過柱后，用10 mL 超純水淋洗小柱，用氮氣吹干，再用10 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于潔凈試管中，在氮氣濃縮儀上吹至近干，然后用乙酸銨–甲醇溶液定容至1 mL，加入氯霉素-D5標準溶液5.00 μL 作為內標，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，置于樣品瓶中，待測。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜

色譜柱：Thermo C18液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國Thermo Scientific 公司）；進樣體積：10μL；流動相：5 mmol／L 乙酸銨溶液–甲醇，流量為250 μL／min，梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫程序

1.3.2 質譜

電噴霧：負離子模式（ESI–）；離子傳輸毛細管溫度：350℃；氣化室溫度：200℃；鞘氣：氮氣，壓力為4.5 MPa；輔助氣：氮氣，壓力為1.5 MPa；噴霧電壓：3 000 V；監(jiān)測模式：選擇反應監(jiān)測（SRM）；碰撞氣：氬氣，壓力為200 Pa。3 種抗生素的質譜參數(shù)見表2。

表2 3 種抗生素的質譜參數(shù)

2 結果與討論

2.1 離子源極性的選擇

分別采用電噴霧電離源（ESI）的正離子和負離子模式，上機檢測組分質量濃度均為100 μg／L 的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標準溶液（含內標氯霉素-D5100 μg／L），發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，各化合物均無明顯出峰，且響應值均遠小于負離子模式，而在負離子模式下3 類目標物分離很好，如圖1。氯霉素類抗生素均含有酚羥基和氯原子，具有較強的電負性，故應采用負離子模式檢測。

圖1 3 種抗生素的SRM 色譜圖

2.2 流動相的選擇

分別以5 mmol／L 乙酸銨溶液–甲醇、甲醇–水、甲醇–0.05%甲酸溶液為流動相，采用相同的梯度洗脫程序，分析組分質量濃度均為100 μg／L 的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標準溶液（含內標氯霉素-D5100μg／L），實驗發(fā)現(xiàn)，以甲醇–0.05%甲酸溶液為流動相時，3 種物質分離不完全；以5 mmol／L 乙酸銨溶液–甲醇為流動相時，色譜峰形比以甲醇–水為流動相時要好。因此以5 mmol／L乙酸銨溶液–甲醇為流動相。

2.3 固相萃取條件的選擇

2.3.1 水樣pH 值

有文獻報道固相萃取時調節(jié)水樣的pH 值至4.0時，氯霉素類抗生素可得到滿意的回收率［4］，故進行了如下試驗：分別配制pH 值為4.0，6.0，7.0，8.0，10.0 的空白加標樣品，按1.2 方法進行樣品前處理后上機測試。平行測定3 次，計算抗生素的平均加標回收率，不同pH 條件下抗生素的回收率如圖2所示。結果表明，當pH 為4.0～7.0 時，樣品加標回收率穩(wěn)定在80%左右，變化不大，但當pH ＞7.0 時，樣品加標回收率明顯降低。因此適宜的水樣pH 值為4～7。不需要將水樣的pH 特別調至酸性。

圖2 水樣不同的pH 值對應的抗生素回收率

2.3.2 樣品萃取的流量

水樣經(jīng)過萃取小柱的流量直接影響小柱對目標化合物的富集效率。試驗考察了樣品流量分別為2，5，10 mL／min 時空白加標樣品的回收率，結果如圖3 所示。結果表明，3 種樣品流量的抗生素加標回收率均在87%～125%范圍，滿足樣品測定要求?？紤]到提高分析效率的因素，選取樣品萃取流量為10 mL／min。

圖3 樣品萃取不同流量時抗生素的回收率

2.3.3 淋洗液pH 值的影響

配制10 ng／L 的空白加標溶液，分別采用pH 7 和pH 2.0 的去離子水作為淋洗液，測定不同淋洗液pH 值對應的抗生素回收率，測定結果如圖4 所示。由圖4 可知，淋洗液的pH 值對樣品種抗生素的回收率影響不大。實驗選擇pH 7 的去離子水作為淋洗液。

圖4 不同淋洗液pH 值對應的抗生素回收率

2.3.4 洗脫液的選擇

分別選取10 mL 甲醇、10 mL 2%甲酸溶液–甲醇和10 ml 1%氨水–甲醇為洗脫液進行試驗，計算3 種洗脫液對應的抗生素回收率，結果如圖5 所示。試驗表明，10 mL 2%甲酸–甲醇作為洗脫液時，抗生素回收率顯著降低，10 mL 甲醇作為洗脫液時加標回收率最優(yōu)，故選擇10 mL 甲醇作為洗脫液。

圖5 洗脫液的種類對測定結果的影響

2.4 線性關系

配制質量濃度分別為1.0，2.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg／L 的氯霉素類抗生素系列混合標準工作溶液（其中內標氯霉素-D5的質量濃度均為50.0 μg／L），在設定的色譜條件下，由低濃度到高濃度依次對上述溶液進行測定，以系列混合標準工作溶液中目標組分的質量濃度為自變量，以對應的色譜峰面積與內標物色譜峰面積的比值和內標物濃度的乘積為因變量，進行線性回歸，計算線性方程和相關系數(shù)。3 種抗生素的線性范圍、線性方程和相關系數(shù)列于表3。由表3 可知，3 種抗生素的質量濃度在1.0～100.0 μg／L 范圍線性良好，相關系數(shù)為0.993 5～0.997 7。

表3 種氯霉素類抗生素的線性范圍、線性方程和相關系數(shù)

2.5 檢出限及測定下限

按照HJ 168–2010 空白實驗中未檢出目標物質的檢出限測定方法，配制7 份1 000 mL 3 ng／L平行水樣，按樣品測定的全過程進行分析，得3 種抗生素的檢出限為1.04～1.33 ng／L，測定下限為4.16～5.32 ng／L。

2.6 精密度試驗

分別配制5，10.0，20.0 μg／L 的空白加標樣品各6 份，按1.2 進行樣品前處理，上機分析，測定結果列于表4。由表4 可知，3 種抗生素3 水平加標測定值的相對標準偏差范圍3.0%～11.1%，本方法精密度滿足分析要求。

表4 空白樣品加標回收試驗結果

2.7 加標回收試驗

選取地表水、廢水樣品，加入氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標準溶液至質量濃度均分別為5，10 ng／L 和10，20 ng／L，配制加標樣品各6 份，按1.2 進行樣品前處理，上機分析，測定結果列于表5。由表5 可知，3 種抗生素的樣品加標回收率為101%～123%，該法準確度滿足分析要求。

表5 實際樣品加標回收試驗結果

2.8 樣品保存時間

吸取1.00 mg／L 氯霉素類使用液20 μL，用水定容至1.00 mL，分別置于棕色玻璃小瓶中，分別考察其在4℃冷藏條件下，存放1，2，4，7，14 d 后測定值的變化。結果表明，在14 d 內避光冷藏條件下，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜氯霉素的濃度均無顯著變化，因此，樣品應采用0～4℃避光保存，于14 d 內分析完畢。

3 結語

采用固相萃取與高效液相色譜–串聯(lián)質譜聯(lián)用技術，建立了同時測定水體中3 中氯霉素類抗生素的方法。實驗結果表明該方法線性良好，檢出限較低，精密度、準確度滿足分析要求，可應用于實際水樣中氯霉素類抗生素殘留的檢測。