龍利 張繼波 余建峰 覃慧群 金晟 徐敏

湖北省第三人民醫(yī)院腎病內科（武漢430033）

原發(fā)性高尿酸血癥患病率逐年攀升，成為影響人類健康的常見病、多發(fā)病。腎臟為尿酸主要代謝場所，90%高尿酸患者屬于“尿酸代謝不足”[1-2]。人尿酸鹽轉運因子（human urate transporter，hUAT）又名人生電型的尿酸鹽轉運蛋白，主要將尿酸鹽通過腎小管分泌入管腔，50%尿酸鹽由其介導，經腎臟排出體外[3-4]。hUAT 蛋白表達水平過低是原發(fā)性高尿酸血癥的重要發(fā)病機制[5]。陳艷梅等[6]發(fā)現(xiàn)，替米沙坦通過促進hUAT表達起到降尿酸作用，但具體機制未明。過氧化物酶體增殖物激活型受體-γ（peroxidosome proliferator activated type receptor-γ，PPAR-γ）屬Ⅱ型核受體超家族，在腎臟表達豐富，與配基結合后可調控腎內髓集合管和間質細胞的增殖和分化，發(fā)揮生物學效應[7-8]。而替米沙坦有類似PPAR-γ相同結構，能夠激活PPAR-γ 受體，誘導血清、腎組織PPAR-γ mRNA表達，從而起到腎臟保護作用[9]。而替米沙坦對于高尿酸血癥腎臟保護作用是否也是通過PPAR-γ途徑介導，目前尚未明確。本研究擬通過對高尿酸鹽刺激下腎小管上皮細胞對PPAR-γ和hUAT的表達，研究替米沙坦降尿酸機制，以進一步論證和完善PPAR-γ/hUAT 蛋白表達通路。

1 材料與方法

1.1 材料HK-2人腎小管上皮細胞，購自中國科學院細胞庫（中國上海）；CO2細胞培養(yǎng)箱購置于美國Thermo公司；胎牛血清（FBS）購于GIBCO公司；0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）、青霉素-鏈霉素購于北京索萊寶科技有限公司；尿酸購于美國Sigma公司；Trizol RNA 提取試劑購于美國Invitrogen公司；TaqTMⅡPCR 試劑盒、逆轉錄試劑盒購于TaKaRa公司；引物購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組用完全培養(yǎng)液，在培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2 細胞，選第3- 5 代細胞，取同步處于G0期的細胞，隨機分為7組，分別為對照組（培養(yǎng)基，NC組）、模型組[尿酸（600 μmol/L），UM組]、高尿酸+替米沙坦組[尿酸（600 μmol/L）+替米沙坦（10 μmol/L），UT組]、高尿酸+羅格列酮組[尿酸（600 μmol/L）+羅格列酮（10 μmol/L），UR組]、高尿酸+GW9662組[預先用5 000 nmol/L PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸（600 μmol/L），UG組]、高尿酸+替米沙坦+GW9662組[預先用5 000 nmol/L PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸（600 μmol/L）+替米沙坦（10 μmol/L），UTG組]和高尿酸+羅格列酮+GW9662組[預先用5 000 nmol/L PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸（600 μmol/L）+羅格列酮（10 μmol/L），URG組]。各組刺激培養(yǎng)48 h后，細胞融合約90%～95%。

1.2.2 流式細胞儀檢測HK-2細胞凋亡情況終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)基吸出，用PBS 清洗、0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞（1×106）。離心去上清，用70%冰乙醇沉淀，4℃懸浮固定24 h。固定細胞經碘化丙啶綜合染料（PI、Rnase、Triton X-100）一步法染色30 min后，300 目尼龍篩網過濾，上流式細胞儀檢測，檢測DNA 含量，計數(shù)在G1 峰前出現(xiàn)的DNA含量下降的亞二倍體峰的細胞數(shù)，計算出細胞凋亡率。

1.2.3 流式細胞儀檢測HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達終止培養(yǎng)后收集細胞（1×106）。離心、洗滌、棄上清，加1∶100 稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ蛋白單克隆抗體100 μL；37℃水浴、離心、棄上清，加1∶20 稀釋的羊抗鼠IgG-FITC 100 μL，水浴、離心洗滌、去上清，除去未結合熒光抗體，調整細胞數(shù)為1×106/L，上機（FACSCalibur，BD）檢測。實驗設正常對照：用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替1∶100 稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ 單抗。陰性對照：只加1∶100 稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ 單抗而不加IgG-FITC 抗體的陰性對照。結果以陽性細胞率表示。

1.2.4 Q-PCR 法檢測HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、TGF-β1的表達情況Trizol 法提取總RNA：RNA溶液在-80℃條件下保存。取1 μL RNA 溶液，用紫外分光光度計于260 nm和280 nm 處測吸光度，OD260/OD280比值在1.8～2.0。逆轉錄cDNA：合成后的cDNA 在-20℃或更低溫度下保存。熒光定量PCR反應：通過GenBank查找hUAT、PPAR-γ和轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）序列，選取GAPDH 作為內參。應用CFX96TM 實時熒光定量PCR 儀，進行熒光定量PCR。每個樣品設2個復孔，取平均擴增循環(huán)次數(shù)Ct值。以內參GAPDH為對照，計算相對定量ΔCt值。以對照組為對照，計算相對定量ΔΔCt值。采用相對定量2-ΔΔCt法比較三個基因的mRNA的表達差異。2-ΔΔCt代表實驗組目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)。ΔΔCt值=實驗組（目的基因Ct值-內參基因Ct值）-對照組（目的基因Ct值-內參基因Ct值）。熒光定量PCR 擴增基因引物序列，hUAT：上游（5′→3′）GACTTCCTAGTGGGTGTGAA，下 游（5′→3′）AATGTCATTTCCACTGAAGC，產 物 長 度225 bp；PPAR-γ：上游（5′→3′）AGCCAACACTAAACCACA，下游（5′→3′）AGAAACCCTTGCATCCT，產物長度337 bp；TGF-β1：上 游（5′→3′）AGCGACTCGCCAGAGTGGTTA，下游（5′→3′）GCAGTGTGTTATCCCTGCTGTCA，產物長度130 bp；GAPDH：上游（5′→3′）CCTTCCGTGTTCCTAC，下游（5′→3′）GACAACCTGGTCCTCA，產物長度152 bp。

1.2.5 Western blot檢測正常及高尿酸條件下HK-2 細胞hUAT、PPAR-γ、TGF-β1的表達取出相應的實驗處理組的培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)液，用預冷的PBS 沖洗2遍，按照6孔板每孔加入100～200 μL（6 cm 培養(yǎng)皿200～300 μL）裂解液的比例加入裂解液。充分裂解，取上清，進行蛋白質定量后貯存于-80℃冰箱。全自動化學發(fā)光分析儀中檢測，通過TANONGIS 軟件讀取相關條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據均以均數(shù)±標準差表示。各組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）及t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組HK-2細胞凋亡的結果與NC組相比，UM組凋亡率明顯增加（P＜0.05），提示尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞存在明顯凋亡表現(xiàn)；與UM組相比，UT組、UR組凋亡率下降明顯（P＜0.05），替米沙坦、羅格列酮能抑制尿酸鹽刺激導致的細胞凋亡；與NC組相比，UG組凋亡率增加（P＜0.05），而在應用PPAR-γ抑制劑后聯(lián)合替米沙坦、羅格列酮，與單純應用抑制劑（UG組）相比，則凋亡率下降明顯（P＜0.05）；與單獨應用替米沙坦（UT組）、羅格列酮（UR組）相比，UTG組（P＜0.05）、URG組（P＞0.05）凋亡率存在輕度升高，提示替米沙坦無法逆轉PPAR-γ抑制劑的促凋亡作用。見表1。

表1 各組HK-2 細胞凋亡的結果Tab.1 Apoptosis of HK-2 cells in each group x±s

2.2 各組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達的結果通過流式細胞儀檢測蛋白表達（以陽性細胞率表示），與NC組相比，UM組hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率比例減少（P＜0.05）；經替米沙坦（10 μmol/L）、羅格列酮（10 μmol/L）干預后，與模型組比較，UT組、UR組兩組患者hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率比例均有增加（P＜0.05），其中UT組尤為明顯（P＜0.05），表明替米沙坦增加hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率比例較羅格列酮更顯著；用PPAR-γ 阻斷劑GW9662 處理后，與NC組相比，UG組hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率比例明顯減少（P＜0.05），與UM組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；加入PPAR-γ 抑制劑，同時用替米沙坦或羅格列酮干預后，與UT組相比，UTG組hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率比例均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與UR組相比，URG組在hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率比例下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 各組HK-2 細胞hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率Fig.1 Protein positive cell rate in hk-2 cells among all groups

表2 各組HK-2 細胞hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率Tab.2 Protein positive cell rate among all groups ±s

表2 各組HK-2 細胞hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率Tab.2 Protein positive cell rate among all groups ±s

注：***P＜0.001。a，與NC組比較；b，與UM組比較；c，與UT組比較；d，與UR組比較

組別NC組UM組UT組UR組UG組UTG組URG組F值hUAT（%）34.42±5.17 14.86±2.87a 30.63±2.39b 24.10±1.26b 12.46±1.19ab 21.57±1.64c 19.53±1.51d 89.807***PPAR-γ（%）33.44±6.76 17.20±4.92a 30.59±8.08b 27.73±5.46b 14.15±1.07ab 24.12±4.66c 24.45±3.73d 16.657***

2.3 各組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ基因表達（QPCR）的結果與NC組相比，UM組hUAT、PPAR-γ基因表達明顯減少（P＜0.05），提示高尿酸可抑制hUAT、PPAR-γ基因表達；經替米沙坦或羅格列酮干預刺激，與UM組相比，UT組、UR組兩組hUAT、PPAR-γ基因表達增強（P＜0.05）；給予PPAR-γ 抑制劑刺激后，與NC相比，UG組hUAT、PPAR-γ基因表達明顯減少（P＜0.05）；給予PPAR-γ 抑制劑處理，同時給予替米沙坦或羅格列酮后，與UT組相比，UTG組hUAT、PPAR-γ基因表達下降（P＜0.05）；與UR組相比，URG組hUAT、PPAR-γ基因表達下降（P＜0.05）。見表3、4和圖2。

表3 各組HK-2 細胞PPAR-γ mRNA表達Ct值結果Tab.3 Results of Ct value of mRNA expression of PPAR-γ in HK-2 cells among all groups ±s

表3 各組HK-2 細胞PPAR-γ mRNA表達Ct值結果Tab.3 Results of Ct value of mRNA expression of PPAR-γ in HK-2 cells among all groups ±s

注：***P＜0.001。a，與NC組比較；b，與UM組比較；c，與UT組比較；d，與UR組比較

NC組UM組UT組UR組UG組UTG組URG組F值PPAR-γ Ct值24.41±0.16 25.69±0.1 27.05±0.08 26.06±0.06 26.38±0.2 24.22±0.3 24.67±0.04內參Ct值20.62±0.05 19.37±0.02 22.33±0.09 21.98±0.16 20.57±0.19 19.42±0.15 19.47±0.07△Ct 3.79±0.19 6.32±0.09 4.72±0.08 4.08±0.11 5.81±0.11 4.80±0.19 5.20±0.04△△Ct 0±0.19 2.53±0.09 0.92±0.08 0.28±0.11 2.02±0.11 1.01±0.19 1.41±0.04 2-△△Ct 1.00±0.19 0.17±0.09a 0.53±0.08b 0.82±0.11b 0.25±0.11a 0.50±0.19c 0.38±0.04d 59.614***

表4 各組HK-細胞hUAT mRNA表達Ct值結果Tab.4 Results of Ct value of hUAT mRNA expression in HK-cells among all groups ±s

注：***P＜0.001。a，與NC組比較；b，與UM組比較；c，與UT組比較；d，與UR組比較

NC組UM組UT組UR組UG組UTG組URG組F值UAT Ct值23.75±0.12 24.91±0.26 26.58±0.08 26.24±0.12 27.74±0.15 24.25±0.13 24.37±0.03內參Ct值20.62±0.05 19.37±0.02 22.33±0.09 21.98±0.16 20.57±0.19 19.42±0.15 19.47±0.07△Ct 3.13±0.07 5.54±0.25 4.25±0.01 4.26±0.04 7.17±0.04 4.82±0.26 4.90±0.09△△Ct 0±0.07 2.41±0.25 1.12±0.01 1.13±0.04 4.04±0.04 1.69±0.26 1.77±0.09 2-△△Ct 1.0±0.07 0.19±0.25a 0.46±0.01b 0.46±0.04b 0.06±0.04a 0.31±0.26c 0.29±0.09d 328.336***

2.4 各組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達的結果與NC組相比，UM組hUAT、PPAR-γ蛋白表達減少（P＜0.05）；經替米沙坦、羅格列酮刺激后，與UM組相比，UT組、UR組hUAT、PPAR-γ蛋白表達增加（P＜0.05）；給予PPAR-γ 抑制劑后，與NC組相比，UG組hUAT、PPAR-γ蛋白表達明顯減少（P＜0.05）；加入PPAR-γ 抑制劑后，應用替米沙坦或羅格列酮干預后，與UT組相比，UTG組hUAT、PPAR-γ蛋白表達下降（P＜0.05）；與UR組相比，UTG組hUAT、PPAR-γ蛋白表達下降（P＜0.05）。見圖3、4。

圖2 各組HK-2 細胞PPAR-γ mRNA、hUAT mRNA 熒光定量PCR 結果Fig.2 Fluorescence quantitative PCR results of PPAR-γ mRNA and hUATmRNA from HK-2 cells among all groups

圖3 各組HK-2 細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達灰度值Fig.3 Gray values of hUAT and PPAR-γ protein expression in HK-2 cells among all groups

圖4 各組HK-2 細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達相對量Fig.4 Relative levels of hUAT and PPAR-γ protein expression in HK-2 cells among all groups

2.5 各組HK-2腎小管上皮細胞TGF-β1表達情況從Q-PCT及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，UM組TGF-β1 mRNA及蛋白表達增加（P＜0.05），提示尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞容易誘發(fā)腎間質纖維化；而單獨應用替米沙坦及羅格列酮后，與UM組相比，mRNA及蛋白表達減少（P＜0.05），表明替米沙坦及羅格列酮存在抗纖維化作用；應用PPAR-γ抑制劑后，與NC組相比表達增加明顯（P＜0.05），與UM組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PPAR-γ抑制劑聯(lián)合替米沙坦、羅格列酮治療后，與UG組相比，表達有所減少（P＜0.05），而分別與UT組（P＜0.05）、UR組（P＞0.05）相比，仍呈高表達，提示抑制PPAR-γ表達，替米沙坦無法逆轉TGF-β1 蛋白表達增強。見表5和圖5-7。

表5 各組HK-細胞TGF-β1 mRNA表達Ct值結果Tab.5 Results of Ct value of TGF-β1 mRNA expression in HK-cells among all groups ±s

表5 各組HK-細胞TGF-β1 mRNA表達Ct值結果Tab.5 Results of Ct value of TGF-β1 mRNA expression in HK-cells among all groups ±s

注：***P＜0.001。a，與NC組比較；b，與UM組比較；c，與UT組比較；d，與UR組比較

NC組UM組UT組UR組UG組UTG組URG組F值TGF-β1 Ct值23.13±0.1 19.46±0.13 23.72±0.64 23.49±0.44 20.88±0.13 20.04±0.15 20.35±0.31內參Ct值20.62±0.05 19.37±0.02 22.33±0.09 21.98±0.16 20.57±0.19 19.42±0.15 19.47±0.07△Ct 2.51±0.07 0.09±0.11 1.39±0.67 1.51±0.43 0.31±0.10 0.62±0.23 0.88±0.37△△Ct 0±0.07-2.42±0.09-1.11±0.7-1.0±0.48-2.19±0.04-1.89±0.24-1.63±0.35 2-△△Ct 1.00±0.07 5.35±0.33a 2.16±1.18b 1.99±0.67b 4.57±0.11a 3.72±0.64c 3.09±0.78d 25.263***

3 討論

體內嘌呤代謝紊亂或尿酸鹽排泄失常，導致血尿酸水平升高，與痛風、高血壓、心血管和腎臟疾病關系密切[10]。近曲腎小管對尿酸的重吸收增加或分泌減少是其排泄減少的重要原因[11]。hUAT是具有高選擇性的尿酸鹽單向轉運通道，主要將尿酸鹽通過近曲腎小管分泌入管腔[12]，此外腸道中的UAT 也發(fā)揮類似的分泌功能[13]。因此，UAT 在調節(jié)全身尿酸穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。高尿酸環(huán)境下，人腎小管上皮細胞hUAT表達顯著增高，主要表達于近端腎小管刷狀緣側，遠端小管、間質無陽性表達[14]。早期可能表現(xiàn)為代償性增加，當血尿酸達到600 μmol/L時，UAT 蛋白表達明顯減弱，提示通過調節(jié)腎小管上皮細胞UAT的表達，降低血尿酸水平，對腎臟有保護作用[6]。

圖5 各組HK-2 細胞TGF-β1 mRNA 熒光定量PCR 結果Fig.5 Fluorescence quantitative PCR results of TGF-β 1mRNA from HK-2 cells among all groups

圖6 各組HK-2 細胞TGF-β1 蛋白表達灰度值Fig.6 Gray values of TGF-β1 protein expression in HK-2 cells among all groups

圖7 TGF-β1 蛋白相對表達量Fig.7 Relative levels of TGF-β1 protein expression in HK-2 cells among all groups

PPAR-γ屬Ⅱ型核受體超家族，通過與配基（或配體）結合后調節(jié)相應基因的轉錄。生理情況下，集合管強表達，間質細胞、腎小球內皮細胞和系膜細胞弱表達[15]。體內外實驗證實其激動劑，通過與配基結合，具有抗炎、抗增殖、抗纖維化及減少蛋白尿等腎臟保護作用[16-18]。羅格列酮/吡格列酮為PPAR-γ受體激動劑代表藥，可抑制單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）分泌、抑制TLR/NF-κB信號通路激活，下調趨化因子表達水平，發(fā)揮抗炎、腎臟保護作用[19-20]。在急性腎損傷、糖尿病腎病模型中，羅格列酮可提高大鼠腎組織PPAR-γ蛋白的活性，抑制大鼠的腎損傷[21-22]。以羅格列酮為參照發(fā)現(xiàn)，尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞后PPAR-γ、hUAT表達下調，羅格列酮干預能提高PPAR-γ及hUAT表達，加入PPAR-γ抑制劑同時應用羅格列酮，PPAR-γ、hUAT 變化不顯著，羅格列酮無法逆轉PPAR-γ抑制后尿酸鹽所致腎小管上皮細胞hUAT表達下降，提示通過刺激PPAR-γ受體可調節(jié)hUAT表達。

陳艷梅等[6]研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦有提高hUAT表達，減少TGF-β1表達，起到降尿酸、抗腎間質纖維化作用，而替米沙坦也能部分激活PPAR-γ 受體[24]，其激活PPAR-γ 能力不依賴于血管緊張素轉換酶抑制作用。臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦能上調組織中PPAR-γ mRNA及蛋白表達，對心梗后心衰、肥胖相關腎病及5/6 腎切除大鼠有保護作用[9，25-26]。替米沙坦對尿酸性腎病患者的腎臟保護作用，除外與血尿酸降低有關（血尿酸是慢性腎臟疾病發(fā)生、進展獨立危險因素[26]），是否與激活PPAR-γ有關，它們之間是否存在相關性，目前尚未明確，因此筆者建立尿酸鹽刺激下腎小管上皮細胞模型，以之來論證這種機制是否存在。

TGF-β1為公認致纖維化因子，能夠反映腎臟損傷程度，在尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞中可見明顯表達[27]，此外，隨著尿酸鹽濃度增加，腎小管上皮細胞增殖能力下降，凋亡率升高，尿酸還可通過抑制腎小管上皮細胞增殖并促進凋亡[28]，加劇腎臟損傷。因此監(jiān)測TGF-β1表達和HK-2腎小管上皮細胞凋亡情況，能直接反映腎臟損傷情況。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組腎小管上皮細胞凋亡率及TGF-β1 增加（P＜0.05），hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率、基因及蛋白表達減少（P＜0.05），替米沙坦能顯著減少細胞凋亡及TGF-β1表達，提高hUAT及PPAR-γ表達；PPAR-γ抑制劑聯(lián)合替米沙坦應用，發(fā)現(xiàn)尿酸鹽刺激所致細胞凋亡及TGF-β1 增加未逆轉，而且hUAT及PPAR-γ仍然減少，因此得出結論：尿酸鹽刺激HK-2腎小管上皮細胞PPAR-γ蛋白表達，替米沙坦具有激活PPAR-γ受體作用；替米沙坦能調節(jié)尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞后所致hUAT蛋白下降，起到腎臟保護作用，這種作用是通過PPAR-γ調節(jié)腎小管上皮細胞凋亡及TGF-β1蛋白表達實現(xiàn)的。