張倩倩 鄭松柏

復旦大學附屬華東醫(yī)院消化內科(200040)

背景：老年人胃腸動力障礙性疾病高發(fā)，可能與腸肌間神經(jīng)叢(MP)的老化有關。目的：探討不同月齡大鼠結腸MP的形態(tài)結構隨增齡的變化。方法：將14只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠按年齡分為6、18和25月齡組，以HE染色測定MP及其神經(jīng)元的形態(tài)學變化，免疫組化染色檢測蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)和c-kit免疫陽性細胞的數(shù)量。結果：三組大鼠MP內神經(jīng)節(jié)面積(H=8.14，P=0.02)、神經(jīng)節(jié)密度(F=4.12, P=0.046)、神經(jīng)元胞體面積(F=9.60，P=0.00)、神經(jīng)元胞核面積(H=9.29，P=0.01)、每個神經(jīng)節(jié)內神經(jīng)元數(shù)量(F=7.60，P=0.01)以及PGP9.5陽性神經(jīng)元數(shù)量(F=26.11，P=0.00)、AChE陽性神經(jīng)元數(shù)量(H=11.83，P=0.00)、nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量(F=20.77，P=0.00)、c-kit陽性細胞數(shù)量(F=14.25，P=0.00)相比差異有統(tǒng)計學意義。與6月齡組相比，18月齡組、25月齡組神經(jīng)節(jié)面積、神經(jīng)元胞體面積、神經(jīng)元胞核面積顯著升高(P<0.05)，而神經(jīng)節(jié)密度、每個神經(jīng)節(jié)內神經(jīng)元數(shù)量、PGP9.5陽性神經(jīng)元數(shù)量、AChE陽性神經(jīng)元數(shù)量、nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量、c-kit陽性細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。結論：隨著增齡，MP存在明顯的衰老(或稱退化)和代償現(xiàn)象，這可能與老年人胃腸動力減退、胃腸動力障礙性疾病高發(fā)有密切關系。

老年人功能性消化不良、慢性便秘等胃腸動力障礙性疾病高發(fā)[1-4]，但其機制尚不明確，可能與消化道肌間神經(jīng)叢(myenteric plexus, MP)隨增齡而發(fā)生衰老等因素有關[5-7]。MP是腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system, ENS)的重要組成部分，其神經(jīng)元通過興奮性神經(jīng)遞質(如乙酰膽堿、P物質和5-羥色胺)和抑制性神經(jīng)遞質(如一氧化氮、血管活性腸肽和生長抑素等)調節(jié)消化道運動功能。因此，MP退化可能是老年人胃腸道動力低下的重要原因。本研究通過對不同月齡的大鼠結腸MP內神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)元形態(tài)以及蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)和c-kit免疫陽性細胞的數(shù)量進行分析，旨在探討MP隨增齡變化的特點及其與腸道運動功能的關系，從一個側面了解老年人胃腸動力障礙性疾病的發(fā)生機制。

材料與方法

一、實驗動物

選取4只6月齡(體質量472.40～521.30 g)、5只18月齡(體質量632.30～687.50 g)和5只25月齡(體質量702.50～750.00 g)SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[合格證號：SCXK(滬)2017-0005]，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。按照網(wǎng)站https://www.taletn.com/rats/age/，將不同月齡大鼠的年齡換算成人類年齡，分別為18歲、45歲和62歲。大鼠自由進食、飲水，飼養(yǎng)于溫度為(24±2) ℃、相對濕度為50%±5%的環(huán)境中，自然光照，12 h明暗周期，適應性飼養(yǎng)1周后用于后續(xù)實驗研究。實驗過程中對動物的處置均符合動物倫理學標準。

二、研究方法

1. 標本獲取：所有動物在取材前1 d 20∶00后禁食、禁水，取材當天稱重后，采用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，剖腹，以肛門為起點，于距肛門8.0 cm處(相當于乙狀結腸和直腸交界部位)取全層腸段1.0 cm。

2. HE染色：將腸段置于4%甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片。行HE染色，二甲苯脫蠟，中性樹脂封片。由2名病理科醫(yī)師在光學顯微鏡下觀察并拍照，測量神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)元形態(tài)學指標：①應用Image J軟件在200倍鏡下測量標本長度，手動勾勒出神經(jīng)節(jié)輪廓，測量神經(jīng)節(jié)面積；②在400倍鏡下逐一計數(shù)MP中神經(jīng)節(jié)數(shù)量，計算神經(jīng)節(jié)密度(神經(jīng)節(jié)密度=標本中神經(jīng)節(jié)數(shù)量/標本長度)；③在400倍鏡下，每張切片選擇10～20個切面完整的神經(jīng)元，應用Image J軟件手動勾勒出神經(jīng)元及其細胞核輪廓，測量并記錄神經(jīng)元及其細胞核的面積[8-9]。

3. 免疫組化染色：將石蠟切片常規(guī)脫蠟、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶活性、封閉，滴加一抗兔抗鼠PGP9.5(購自Abcam，以1∶1 000稀釋)、兔抗鼠AChE(購自Diagbio，以1∶20稀釋)、兔抗鼠nNOS(購自Abcam，以1∶500稀釋)、兔抗鼠c-kit單克隆抗體[購自愛必信(上海)生物科技有限公司，以1∶200稀釋]4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，滴加二抗室溫孵育，DAB顯色，蘇木素染核，脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。

結果判斷：PGP9.5、AChE和nNOS均定位于細胞質，以MP中細胞質呈棕黃色的細胞為陽性；c-kit定位于細胞質和質膜，以內環(huán)肌和外縱肌之間細胞質和(或)質膜呈棕黃色的細胞為陽性。兩名病理科醫(yī)師在高倍鏡下(×400)觀察，每張切片隨機選擇10個神經(jīng)節(jié)，計數(shù)每個神經(jīng)節(jié)內PGP9.5免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量；每張切片隨機選擇5個不重疊視野，計數(shù)內環(huán)肌與外縱肌之間PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit陽性細胞數(shù)量并記錄均值。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的形態(tài)學增齡變化

三組大鼠結腸壁內環(huán)肌和外縱肌間均可見MP及其神經(jīng)節(jié)，6月齡大鼠神經(jīng)節(jié)面積小，數(shù)量多，其內神經(jīng)元數(shù)量多，神經(jīng)元胞質呈粉紅色，胞核呈紫藍色。18月齡和25月齡大鼠神經(jīng)節(jié)面積增大，神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元胞體和胞核染色較6月齡淺，胞核面積增大。三組大鼠神經(jīng)纖維均呈淡粉色，相互交織成網(wǎng)，6月齡組神經(jīng)纖維排列整齊、致密，18月齡組略疏松，25月齡組神經(jīng)纖維排列雜亂、扭曲(圖1A-1I)。

二、神經(jīng)節(jié)面積和神經(jīng)節(jié)密度的增齡變化

三組MP內神經(jīng)節(jié)面積相比差異有統(tǒng)計學意義(H=8.14，P=0.02)，且18月齡組和25月齡組顯著高于6月齡組(P=0.01，P=0.01)，而25月齡組與18月齡組相比差異無統(tǒng)計學意義；三組神經(jīng)節(jié)密度相比差異有統(tǒng)計學意義(F=4.12，P=0.046)，其中25月齡組較6月齡組顯著下降(P=0.02)，其余各組間相比差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。

三、神經(jīng)元面積和數(shù)量的增齡變化

三組神經(jīng)元胞體面積相比差異有統(tǒng)計學意義(F=9.60，P=0.00)，其中18月齡組和25月齡組顯著高于6月齡組(P=0.02，P=0.01)，而18月齡組和25月齡組相比差異無統(tǒng)計學意義；三組神經(jīng)元胞核面積相比差異有統(tǒng)計學意義(H=9.29，P=0.01)，其中18月齡組和25月齡組顯著高于6月齡組(P=0.01，P=0.01)，而18月齡組和25月齡組相比差異無統(tǒng)計學意義；三組每個神經(jīng)節(jié)內神經(jīng)元數(shù)量相比差異有統(tǒng)計學意義(F=7.60，P=0.01)，其中18月齡組和25月齡組顯著低于6月齡組(P=0.01，P=0.00)，而18月齡組與25月齡組相比差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 三組大鼠神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)元形態(tài)學增齡變化

四、MP內PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit陽性細胞數(shù)量的增齡變化

免疫組化染色可見陽性細胞呈棕黃色，灶狀分布于內環(huán)肌和外縱肌之間，胞體大小不等，形態(tài)多樣，細胞核呈藍色。三組間PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit陽性細胞數(shù)量相比差異均有統(tǒng)計學意義(F=26.11，P=0.00；H=11.83，P=0.00；F=20.77，P=0.00；F=14.25，P=0.00)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，18月齡組和25月齡組MP內PGP9.5陽性神經(jīng)元均較6月齡組顯著減少(P=0.00，P=0.00)，18月齡組與25月齡組相比差異無統(tǒng)計學意義；18月齡組和25月齡組MP內AChE陽性神經(jīng)元數(shù)量較6月齡組顯著減少(P=0.01，P=0.01)，25月齡組又顯著低于18月齡組(P=0.00)；18月齡組和25月齡組MP內nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量較6月齡組顯著降低(P=0.00，P=0.00)，而18月齡組與25月齡組相比差異無統(tǒng)計學意義；18月齡組和25月齡組c-kit陽性細胞較6月齡組顯著減少(P=0.00，P=0.00)，而18月齡組與25月齡組相比差異無統(tǒng)計學意義(圖2A-2L、表2)。

表2 各組大鼠PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit陽性細胞數(shù)量的增齡變化

A-C：PGP9.5；D-F：AChE；G-I：nNOS；J-L：c-kit

討 論

腸道平滑肌受ENS和外來神經(jīng)(迷走神經(jīng)和脊神經(jīng))支配，其中ENS起主導作用[10]。ENS由黏膜下神經(jīng)叢和MP組成，MP內神經(jīng)元通過分泌神經(jīng)遞質可直接調節(jié)腸道運動。腸腔內的化學信號和機械信號經(jīng)迷走神經(jīng)傳入纖維和脊神經(jīng)傳入纖維分別傳導至腦干背側孤束核和脊髓背角，通過上行神經(jīng)傳導束投射至大腦皮質，大腦皮質接收信號后經(jīng)迷走神經(jīng)和脊神經(jīng)傳導至MP，從而調節(jié)腸道平滑肌的運動。此外，ENS可通過蠕動反射獨立調節(jié)腸道運動。

老齡是腸道動力障礙的重要危險因素之一。老年人反流性食管炎、慢性便秘和功能性消化不良等疾病的患病率顯著高于中青年人[6,11]。60歲以上老年人功能性消化不良患病率達11.30%[3]，84歲及以上老年人慢性便秘患病率可達20.00%～37.30%[4]。乙狀結腸與直腸交界處是MP隨增齡退化最為顯著的部位[12-13]。因此，本研究選擇距肛門8 cm處的腸段(相當于乙狀結腸與直腸交界部位)為標本，探討MP隨增齡的變化。

Sun等[14]的研究以蛋白質印跡法和免疫熒光法對2、16和20月齡C57BL/6J小鼠結腸MP神經(jīng)元進行定量分析發(fā)現(xiàn)，20月齡組神經(jīng)元數(shù)量顯著低于2和16月齡組。Bernard等[15]以免疫熒光法檢測人結腸MP內神經(jīng)元HuC/D表達，結果顯示神經(jīng)元總數(shù)量隨增齡顯著下降。本研究對6、18和25月齡大鼠結腸MP神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)元的形態(tài)學變化以及相關指標進行分析，結果顯示神經(jīng)節(jié)密度和每個神經(jīng)節(jié)內神經(jīng)元數(shù)量均隨增齡顯著下降，而神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)元及其胞核的面積隨增齡顯著增加，神經(jīng)纖維排列逐漸紊亂，這些變化可能是對神經(jīng)元丟失產(chǎn)生的代償反應[14-16]。

MP神經(jīng)元依據(jù)神經(jīng)遞質的不同可分為多種亞型，膽堿能神經(jīng)元是ENS的主要興奮性神經(jīng)元。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結腸組織AChE陽性神經(jīng)元隨增齡逐漸減少，與Sun等[14]的研究結果一致。在體外，以同等強度的電流刺激青年組和老年組狒狒結腸平滑肌，老年組肌肉收縮力顯著下降，但加入膽堿能受體抑制劑阿托品后，再給予兩組同等強度的電刺激，老年組平滑肌收縮抑制作用顯著低于青年組，提示老年組結腸MP內膽堿能神經(jīng)元數(shù)量低于青年組[6]。

目前關于氮能神經(jīng)元數(shù)量隨增齡的變化尚存爭議。Takahashi等[17]發(fā)現(xiàn)，隨著增齡，F(xiàn)isher大鼠每個神經(jīng)節(jié)內nNOS免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著下降(P<0.01)，22～28月齡大鼠結腸組織nNOS mRNA和蛋白表達較4～8月齡組分別下降35%和54%。Gamage等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，雖然18～19月齡和24～25月齡C57BL/6小鼠MP內NO能神經(jīng)元數(shù)量無明顯差異，但24～25月齡神經(jīng)纖維密度增加，并可見軸突腫脹、扭曲等表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，nNOS免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量隨增齡顯著下降，神經(jīng)纖維隨增齡排列逐漸紊亂。推測神經(jīng)元丟失后，尚存神經(jīng)元之間聯(lián)系減少，故神經(jīng)纖維代償性增粗、增長以加強神經(jīng)元間信號傳輸。本研究中，與18月齡組相比，25月齡組AChE陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著下降，而nNOS陽性神經(jīng)元無明顯變化，提示興奮性神經(jīng)元與抑制性神經(jīng)元的老化可能是非同步的、不平衡的，且抑制性神經(jīng)元受年齡的影響較小。

Cajal間質細胞(ICCs)位于消化道肌層內，是胃腸道慢波起搏細胞，與MP內神經(jīng)元共同調節(jié)腸道運動。李永等[12]對3、9、18、24和30月齡SD大鼠腸道傳輸速度以及胃體、空腸、回腸、結腸和乙狀結腸與直腸交界處5個部位的ICCs進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)20和24月齡組腸道傳輸速度減慢；各部位c-kit表達均隨增齡而下降，尤以結腸與直腸交界處最為明顯。Sun等[14]發(fā)現(xiàn)，24月齡C57BL/6J小鼠結腸ICCs顯著下降。24月齡組Fischer344大鼠升結腸和降結腸c-kit表達顯著低于6周齡組[19]。本研究中，25月齡SD大鼠c-kit表達顯著低于6月齡組，與上述研究結果一致。

綜上所述，本研究證實老年MP存在衰老(或稱退化)和代償現(xiàn)象，與老年人胃腸動力減退關系密切，為闡明胃腸動力障礙性疾病高發(fā)的機制提供了一些實驗和理論依據(jù)。考慮到衰老是不可逆轉的，而代償是有限的，因此建議未來研究應關注MP神經(jīng)遞質的調節(jié)方面，為治療老年人胃腸動力障礙性疾病尋找新的干預靶點。