柳小曼 陳穎偉,2*

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科1(200092) 上海市小兒消化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

核因子-紅血球相關(guān)因子-2(nuclear factor-erythroid 2 related factor-2, Nrf2)是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激程序的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，為CNC家族成員之一，能協(xié)調(diào)細(xì)胞保護(hù)性基因的激活，從而防御外源性應(yīng)力和氧化應(yīng)激[1]。炎癥性腸病(IBD)為基因易感個(gè)體在環(huán)境因素作用下發(fā)生腸道微生態(tài)紊亂、免疫功能失調(diào)、腸屏障損傷而誘發(fā)的慢性非特異性炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。IBD易復(fù)發(fā)遷延且并發(fā)癥多見，具有發(fā)展為腸纖維化和結(jié)直腸癌(CRC)的高風(fēng)險(xiǎn)。多項(xiàng)研究證實(shí)Nrf2通路與IBD腸纖維化和癌變關(guān)系密切，以Nrf2信號(hào)通路為靶點(diǎn)的治療藥物被廣泛研究。本文就Nrf2信號(hào)通路在IBD中的研究進(jìn)展作一綜述。

一、Nrf2概述

1. Nrf2基本結(jié)構(gòu)和激活：Nrf2是含堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子CNC亞家族成員之一，與Nrf1、Nrf3、NF-E2p45亞基協(xié)同調(diào)控基因表達(dá)。Nrf2含7個(gè)不同功能同源域(Neh1～7)，非應(yīng)激穩(wěn)態(tài)時(shí)，負(fù)性調(diào)節(jié)因子Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)在胞質(zhì)結(jié)合Neh2區(qū)域并通過Cullin3泛素E3連接酶(Cul3/E3)復(fù)合體誘導(dǎo)Nrf2持續(xù)泛素化降解，使其具有高代謝性并維持極低的表達(dá)水平[2]。應(yīng)激或生理狀態(tài)下線粒體、過氧化酶體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝產(chǎn)生大量自由基、活性氧簇(ROS)時(shí)，Keap1反應(yīng)性半胱氨酸殘基氧化失活，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并激活磷酸化，入核與小Maf家族成員異二聚化后通過Neh1區(qū)結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄[1-2]。

2. Nrf2-Keap1/ARE通路的功能：Nrf2/ARE通路在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。該通路可調(diào)控谷胱甘肽和硫氧還蛋白抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵組分的表達(dá)，參與內(nèi)外源代謝產(chǎn)物的Ⅰ期、Ⅱ期解毒，調(diào)節(jié)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生和血紅素代謝，同時(shí)亦與許多腫瘤、炎性疾病、神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，已成為新型治療靶點(diǎn)。此外，近年研究[1,3-4]發(fā)現(xiàn)了Nrf2通路的其他功能：調(diào)節(jié)線粒體生物能學(xué)、促進(jìn)未折疊蛋白反應(yīng)、調(diào)控腸道炎癥和腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)等。

二、Nrf2與IBD

1. Nrf2有助于維持腸上皮屏障：①Nrf2抑制氧化應(yīng)激降低腸道炎癥：ROS能通過氧化應(yīng)激或促進(jìn)炎癥，損傷腸黏膜細(xì)胞[5]。Nrf2激活能顯著抑制ROS產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞存活，改善腸上皮細(xì)胞氧化還原和炎癥狀態(tài)。葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的Nrf2-/-小鼠的促炎因子水平和腸道炎癥程度顯著高于野生型小鼠[6]。激活Nrf2及其下游多種抗氧化酶表達(dá)，可有效減輕豬空腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的腸上皮損傷和凋亡，并改善腸道黏膜屏障通透性，證實(shí)Nrf2能抑制氧化應(yīng)激，降低腸道炎癥[7]。

②Nrf2與自噬交叉調(diào)控腸道氧化應(yīng)激：p62蛋白位于自噬體形成位點(diǎn)，與自噬定位蛋白LC3和泛素化蛋白結(jié)合參與自噬過程，剪切p62蛋白pre-mRNA的Keap1相互作用域能顯著提高Keap1含量，增強(qiáng)Nrf2泛素化，抑制其靶基因表達(dá)[8]。Keap1基因消融則可促使泛素聚集體積累以及自噬激活障礙，說明Keap1-p62結(jié)合體亦參與泛素化蛋白降解過程[9]。因此，細(xì)胞內(nèi)各種自噬網(wǎng)絡(luò)和抗氧化應(yīng)激過程可通過p62-Keap1相互調(diào)節(jié)。Harada等[10]的研究顯示，自噬缺陷能激活Nrf2/Keap1/血紅素加氧酶1(HO-1)通路，減輕吲哚美辛誘導(dǎo)的小鼠腸上皮損傷，說明病理生理?xiàng)l件下，上述兩種途徑可通過相互協(xié)調(diào)來維持腸道屏障正常功能。

③Nrf2調(diào)節(jié)腸道免疫：Th1/Th2細(xì)胞分化是宿主腸道免疫防御的關(guān)鍵過程，該分化失調(diào)亦是IBD的發(fā)病機(jī)制之一。有研究[11]通過分析Th1/Th2細(xì)胞因子變化推測(cè)Nrf2激活劑特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)有促使CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化的傾向。但部分T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子獨(dú)立于Nrf2途徑，僅通過檢測(cè)細(xì)胞因子變化判斷T細(xì)胞分化的準(zhǔn)確性較低，不同類型的Nrf2激活劑對(duì)T細(xì)胞的影響亦不盡相同。因此，Nrf2對(duì)腸道免疫的影響仍有待進(jìn)一步深入研究。

④Nrf2影響腸道緊密連接蛋白和腸上皮細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)腸道通透性：研究[12-13]顯示細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/Nrf2/HO-1信號(hào)通路可介導(dǎo)線粒體自噬而減輕腸道氧化應(yīng)激所致的上皮損傷，并上調(diào)腸上皮間緊密連接蛋白表達(dá)，而自噬激活劑或抑制劑亦能改變緊密連接蛋白含量。此外，Nrf2通路激活亦能抑制腸上皮細(xì)胞凋亡和腸干細(xì)胞過度增殖[14]。

2. Nrf2調(diào)控腸道纖維化：多項(xiàng)研究[15-17]顯示Nrf2在多種器官中發(fā)揮抗纖維化作用，且此種保護(hù)作用與纖維化經(jīng)典通路轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)/Smads密切相關(guān)。纖維狹窄性CD和腸纖維化動(dòng)物模型中主要促纖維化因子TGF-β1及其受體均高表達(dá)，可向下游Smads蛋白家族傳遞信號(hào)，促進(jìn) 細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而加速纖維化[18]。TGF-β1能增加ROS產(chǎn)生并抑制抗氧化酶，導(dǎo)致氧化還原平衡失調(diào)，反之ROS亦為激活TGF-β1/Smads通路的重要介質(zhì)。因此，Nrf2通路失調(diào)所致氧化還原紊亂能通過大量產(chǎn)生ROS，激活TGF-β1/Smads通路，從而誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生[19]。Guan等[20]用TBHQ處理小鼠慢性纖維結(jié)腸炎模型、用TBHQ或SiNrf2預(yù)處理人腸成纖維細(xì)胞后，采用TGF-β1刺激轉(zhuǎn)化，通過檢測(cè)纖維化指標(biāo)和胞內(nèi)ROS水平表明，TBHQ能通過抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路減輕小鼠結(jié)腸炎和人腸成纖維細(xì)胞纖維化，而Nrf2-/-可促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的腸成纖維細(xì)胞分化。因此，Nrf2在體內(nèi)外均能通過ROS/TGF-β1/Smads途徑抑制腸纖維化進(jìn)程。

3. Nrf2參與IBD癌變轉(zhuǎn)化過程：CRC與IBD(尤其UC)關(guān)系確切，IBD患者CRC患病率是普通人群的2～6倍，IBD患者CRC發(fā)生率隨確診年限增加而增高[21]。炎癥狀態(tài)下細(xì)胞因子、趨化因子、炎性細(xì)胞共同組成的富含ROS的復(fù)雜微環(huán)境是促進(jìn)IBD炎癌轉(zhuǎn)變的主要因素[22]。作為細(xì)胞防御與生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典通路，Nrf2在腫瘤中的角色一直備受關(guān)注。目前認(rèn)為，Nrf2在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演雙重且有爭(zhēng)議的角色[23]。

①Nrf2在CRC發(fā)生早期具有保護(hù)作用：Khor等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，與DSS誘導(dǎo)的野生型小鼠相比，DSS誘導(dǎo)的Nrf2-/-小鼠腸道炎癥程度更重，患CRC風(fēng)險(xiǎn)更高，表明Nrf2參與炎癥相關(guān)CRC的保護(hù)作用，且雌激素(E2)對(duì)CRC的保護(hù)作用亦可能通過Nrf2信號(hào)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)。外源性E2可降低卵巢切除小鼠的炎性介質(zhì)水平，上調(diào)雌激素受體β(ERβ)，同時(shí)使Nrf2及其相關(guān)抗氧化酶表達(dá)增加[25]。Yokoo等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與高癌變風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Nrf2-/-小鼠較野生型小鼠的腫瘤前損害和腫瘤發(fā)生率顯著提高，且小鼠上皮DNA中8-羥基脫氧鳥苷(DNA氧化損傷標(biāo)志物)水平明顯高于Nrf2+/+小鼠。由此推測(cè)，識(shí)別能維持Nrf2恒定狀態(tài)的分子有助于早期預(yù)防癌癥發(fā)展。

②Nrf2在腫瘤晚期參與癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及放化療抵抗：以往Nrf2因其防御功能被認(rèn)定為腫瘤抑制因子，然而越來越多的證據(jù)顯示Nrf2通路過度激活有利于腫瘤細(xì)胞生存，可保護(hù)其免受氧化應(yīng)激和藥物作用。目前認(rèn)為Nrf2在腫瘤晚期可加速腫瘤進(jìn)展，促進(jìn)轉(zhuǎn)移，參與放化療抵抗[27]。

Homma等[28]使用3種Nrf2不同活化程度的人肺癌細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示A549(Nrf2高度活性)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性明顯高于NCI-H292(Nrf2中度活性)和LC-AI(未刺激狀態(tài)下Nrf2不激活)細(xì)胞，Nrf2-siRNA可有效抑制A549順鉑耐藥和細(xì)胞增殖。Zhang等[29]首次發(fā)現(xiàn)一種Nrf2去泛素化酶3(deubiquitinase 3, DUB3)能降低Nrf2泛素化，從而促進(jìn)Nrf2的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。值得注意的是，DUB3異位表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Nrf2依賴性腫瘤細(xì)胞耐藥。有研究[30]從Nrf2亞細(xì)胞定位角度探討其與CRC的相關(guān)性。在醌氧化還原酶1(NQO1)和HO-1陽性的結(jié)腸腫瘤組織中，Nrf2僅在核內(nèi)表達(dá)(nNrf2)，而在NQO-1、HO-1陰性腫瘤組織中，Nrf2表達(dá)局限于胞質(zhì)(cNrf2)。cNrf2腫瘤患者整體生存率低于nNrf2患者，且能上調(diào)蛋白酶體復(fù)合物組裝關(guān)鍵酶26S蛋白酶體非ATPase調(diào)節(jié)亞基4(PSMD4)促進(jìn)腫瘤侵襲性，而PSMD4通過p53降解，增加染色體區(qū)域穩(wěn)定蛋白1(CRM1)表達(dá)、促進(jìn)Nrf2核輸出，表明Nrf2/PSMD4共同參與CRC進(jìn)展。Cheng等[31]的研究顯示，cNrf2在體外(HCT116細(xì)胞株)和體內(nèi)(CRC動(dòng)物模型)均對(duì)5-氟尿嘧啶(5-FU)和奧沙利鉑耐藥，其機(jī)制與PSMD4促使Nrf2核輸出，最終激活NF-κB/AKT/β-catenin瀑布有關(guān)，進(jìn)一步證明了上述結(jié)論。此外，cNrf2和PSMD4陽性的CRC患者的化療耐藥率更高。

三、以 Nrf2為靶點(diǎn)的IBD治療進(jìn)展

Nrf2與IBD的發(fā)生發(fā)展、腸纖維化、CRC聯(lián)系緊密。在IBD早期階段，用Nrf2激活劑維持其穩(wěn)定水平或能限制IBD進(jìn)展以及并發(fā)癥的形成。近年研究[32]顯示，小檗堿可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀，減輕炎性標(biāo)志物表達(dá)，并以劑量時(shí)間依賴方式活化人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株Caco-2的Nrf2基因，提示Nrf2上調(diào)可能與小檗堿治療IBD的機(jī)制有關(guān)。其他天然化合物如高良姜黃素[33]、夾竹桃麻素[34]等能通過Nrf2信號(hào)通路緩解實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的炎癥程度和纖維化。但相關(guān)治療措施目前僅限于實(shí)驗(yàn)研究階段，其在臨床治療中的有效性和安全性有待證實(shí)。

另一方面，鑒于Nrf2在癌癥晚期過表達(dá)，Nrf2抑制劑可能是一種有效的輔助藥物。以黃酮類、生物堿為代表的植物提取物以及二甲雙胍等化學(xué)藥物作為Nrf2抑制劑均被考慮用于CRC輔助治療。體外研究[35]顯示,Nrf2抑制劑Brusatol和Nrf2 siRNA均能降低結(jié)腸癌細(xì)胞活力，增強(qiáng)對(duì)伊立替康(結(jié)腸癌治療藥物)的敏感性，皮下注射Brusatol能有效抑制移植CRC小鼠腫瘤生長，證實(shí)了Nrf2靶點(diǎn)的有效性。而二甲雙胍作為一種抗糖尿病藥物的同時(shí)亦具有抗癌作用。在IBD治療中，二甲雙胍不僅可改善腸道菌群種類和豐度，調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫，改善黏膜屏障，近年研究[36]亦證實(shí)了其預(yù)防癌癥進(jìn)展的可能性。二甲雙胍能以劑量時(shí)間依賴方式促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29凋亡和自噬，并伴隨Nrf2和NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，提示二甲雙胍有望作為預(yù)防和治療CRC的有效藥物 。

四、總結(jié)和展望

綜上所述，IBD作為臨床難治性疾病常伴隨嚴(yán)重的并發(fā)癥，危害患者身心健康，且目前尚無根治方案，因此限制IBD進(jìn)展以及腸纖維化、腫瘤等并發(fā)癥的發(fā)生至關(guān)重要。Nrf2是細(xì)胞對(duì)抗外部壓力的主要保護(hù)性分子，具有抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥的作用，參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。盡管目前Nrf2在IBD中作用的研究已取得諸多進(jìn)展，但以Nrf2為中心的具體信號(hào)通路仍尚未完全闡明，需更多研究明確其對(duì)腫瘤正、負(fù)面作用的界限，建立靶向Nrf2治療的精確依據(jù)。同時(shí)，研發(fā)以Nrf2為靶點(diǎn)的藥物，在疾病的不同發(fā)展階段嚴(yán)格調(diào)控該分子水平，亦為未來IBD的治療提供了一條新途徑。