周士祥 李鳳 蔡彭 張群 汪庚明 孫謙 丁建明 周育夫 李多杰

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放療科（安徽蚌埠233004）

食管癌是我國高發(fā)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率分別居第6 位和第4 位，男性發(fā)病率是女性的2.25 倍，在60 ～64 歲發(fā)病人數(shù)最多［1-2］。在我國，80%以上食管癌患者組織學(xué)類型為鱗癌，腺癌較少見，與西方歐美國家食管癌患者有很大區(qū)別。手術(shù)切除是早期食管癌患者標(biāo)準(zhǔn)治療策略，大部分食管鱗癌患者由于早期無特異性癥狀，而且缺乏特異性腫瘤預(yù)測標(biāo)志物，確診時往往已經(jīng)發(fā)展成晚期，此時可手術(shù)切除患者比例低，死亡率高，預(yù)后差，5年生存率不到30%［3］。食管鱗癌生物學(xué)特性是惡性生長并且早期局部浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，因此，尋找新型生物標(biāo)志物對食管鱗癌患者早期診斷、判斷預(yù)后及治療至關(guān)重要。

鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體LIV-1 蛋白（又稱SLC39A6、ZIP6），在乳腺癌［4］、肝癌［5］、宮頸癌［6］等實體瘤中高表達(dá)，且LIV-1 高表達(dá)的患者死亡風(fēng)險顯著高于低表達(dá)患者。但到目前為止關(guān)于LIV-1 蛋白在食管鱗癌中的研究比較少，缺乏作為早期診斷、判斷預(yù)后和治療食管鱗癌的靶基因證據(jù)。因此，本研究回顧性分析局部中晚期食管鱗癌患者術(shù)后標(biāo)本，對LIV-1 蛋白表達(dá)水平不同的食管鱗癌患者的臨床特征、預(yù)后進(jìn)行對比分析。

1 資料與方法

1.1 病例資料收集2012年5月至2016年3月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科收治并存檔的139 例食管鱗癌患者術(shù)后石蠟組織標(biāo)本和36 例癌旁正常食管上皮組織，術(shù)后病理分期為T3N0-3M0 的患者，術(shù)前未做放化療。并收集患者社會人口學(xué)資料、病史、影像學(xué)資料及術(shù)后病理資料，2019年5 ～6月通過電話進(jìn)行隨訪，終點事件為疾病進(jìn)展和全因死亡，所有實驗方案均經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行，所有患者均填寫書面知情同意書。

1.2 實驗試劑試劑為兔抗LIV-1 單克隆抗體，來源于abcam（美國公司）。S-P 試劑盒、免疫顯色試劑（DAB 顯色液）來源于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LIV-1 在食管鱗癌組織中表達(dá)分析石蠟包埋標(biāo)本取自4%福爾馬林固定的食管鱗癌組織和癌旁組織（前期收集記錄的139 例食管鱗癌組織和36 例癌旁組織）。然后對139 例食管鱗癌組織和36 例癌旁組織進(jìn)行HE 染色。按4 μm 的厚度對石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，將石蠟包埋的4 μm 切片在65 ℃下持續(xù)烘烤1 h（防止掉片），然后將石蠟切片浸入二甲苯溶液中，分別靜置10 min 進(jìn)行脫蠟，后將石蠟切片依次放入不同梯度的酒精中分別靜置5 min 脫二甲苯，玻片放入水中浸洗3 次進(jìn)行水化，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的具體操作步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。然后根據(jù)LIV-1 蛋白表達(dá)水平不同進(jìn)行分組，分成LIV-1 蛋白高表達(dá)組和LIV-1 蛋白低表達(dá)組。

1.3.2 免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)采用免疫組化Envision 試劑盒檢測LIV-1 蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，按照試劑盒說明書上免疫組化的步驟進(jìn)行上述操作，用abcam 試劑公司提供的照片為陽性對照，滴加PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照，LIV-1 蛋白染色結(jié)果以細(xì)胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。對LIV-1 蛋白染色標(biāo)記的表達(dá)結(jié)果均以組織中陽性細(xì)胞比例、陽性細(xì)胞百分比和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行判斷，免疫組化染色結(jié)果描述［7-8］：≥++ 被定義為高表達(dá)，＜+為低表達(dá)。每張切片在高倍鏡下觀察并計算LIV-1 陽性細(xì)胞數(shù)，得分用陽性染色細(xì)胞百分比與細(xì)胞染色強(qiáng)度的計分成績來判斷，有差異的結(jié)果則由兩位病理科專家討論后達(dá)成一致。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法計量資料若符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布用M（P25，P75）表示，組間比較用兩獨立樣本t檢驗、Satterthwaite 近似t檢驗或Wilcxon 秩和檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。生存曲線用Graphpad prism8 繪制，兩組間比較采用Log-rank 檢驗，Cox 比例風(fēng)險回歸模型評價LIV-1 蛋白表達(dá)與終點事件的關(guān)系，所用變量進(jìn)行單因素分析，多因素分析納入單因素分析中P≤0.10 及認(rèn)為有臨床意義的變量；統(tǒng)計學(xué)分析采用IBM SPSS 26.0 軟件，進(jìn)行雙側(cè)檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同LIV-1 蛋白表達(dá)水平的食管鱗癌患者臨床特征本研究納入139 例食管鱗癌患者術(shù)后組織標(biāo)本并進(jìn)行LIV-1 蛋白表達(dá)水平檢測?；颊吣挲g40 ～78 歲，平均63.3 歲，男110 例（79.1%），女29 例（20.9%），LIV-1 蛋白高表達(dá)73 例（52.5%），低表達(dá)66 例（47.5%）。LIV-1 蛋白高表達(dá)與低表達(dá)組間年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)狀態(tài)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 臨床組織病理學(xué)結(jié)果在癌旁食管上皮組織中，LIV-1 蛋白的表達(dá)主要著色在基底細(xì)胞胞漿上，而食管鱗癌組織LIV-1 蛋白的表達(dá)主要著色在細(xì)胞漿及細(xì)胞核。139 例食管鱗癌組織及36 例癌旁正常組織（正常組織距離食管癌細(xì)胞邊緣大于5 cm）病理結(jié)果見圖1。

表1 LIV-1 蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征Tab.1 The expression of LIV-1 protein andclinicopathological characteristics of patients with esophageal squamous cell carcinoma 例（%）

2.3 癌旁食管上皮組織與食管鱗癌組織LIV-1 蛋白表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示在癌旁食管上皮組織中LIV-1 蛋白高表達(dá)率為11.11%，食管鱗癌組織中高表達(dá)率為52.5%（表2）。

2.4 生存分析在中位隨訪時間31（2，91）個月后，獲得139 例（100%）患者生存資料，低表達(dá)組的總生存期（OS）與無病生存期（DFS）明顯高于高表達(dá)組（圖2A、D）。根據(jù)淋巴結(jié)狀態(tài)進(jìn)行亞組分析提示：在淋巴結(jié)陰性組中，LIV-1 蛋白低表達(dá)食管鱗癌患者的OS 與DFS 高于LIV-1 蛋白高表達(dá)食管鱗癌患者（圖2B、E）；而在淋巴結(jié)陽性組中，LIV-1蛋白表達(dá)高低與OS 和DFS 無關(guān)（圖2C、F）。Cox單因素回歸分析提示，LIV-1 蛋白高表達(dá)的死亡風(fēng)險顯著高于低表達(dá)組（HR= 1.789，95%CI：1.141～2.804，P= 0.011），見表3。多因素回歸分析仍提示，LIV-1 蛋白高表達(dá)的死亡風(fēng)險顯著高于低表達(dá) 組（HR= 1.633，95%CI：1.040 ～2.566，P=0.033），見表3。

圖1 食管鱗癌臨床組織病理切片F(xiàn)ig.1 Clinicopathological section of esophageal squamous cell carcinoma

表2 LIV-1 蛋白在癌旁食管上皮組織和食管鱗癌組織中表達(dá)的強(qiáng)陽性率Tab.2 Dysregulation frequency of LIV-1 protein expression in non-tumor esophageal and esophageal squamous cell carcinoma tissue 例（%）

3 討論

本研究回顧性分析了139 例食管鱗癌患者一般臨床特征及預(yù)后分析，并對LIV-1 蛋白低表達(dá)與高表達(dá)兩組患者特征進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LIV-1蛋白高表達(dá)與低表達(dá)兩組間年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)狀態(tài)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而LIV-1 蛋白低表達(dá)組OS 與DFS 明顯高于高表達(dá)組。

圖2 預(yù)后生存分析Fig.2 Survival analysis of prognosis

表3 食管鱗癌患者無病生存期與總生存期COX 回歸單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate Cox regression analyses of the prognostic variables in ESCC patients

LIV-1 基因?qū)儆赯IP 家族中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LZT）的新亞家族成員，是MANNING 等［9］最早于1988年在人乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)一種大小為4.4 kb 可被雌激素誘導(dǎo)的新基因。LIV-1 基因位于細(xì)胞膜上，主要功能是維持細(xì)胞內(nèi)外鋅離子濃度穩(wěn)定，把細(xì)胞外的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。鋅離子作為機(jī)體內(nèi)的必要微量元素，在細(xì)胞分裂、細(xì)胞之間信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 和蛋白質(zhì)合成過程中具有重要作用，是細(xì)胞生長和分化必不可少的離子，在很多生物學(xué)過程中，鋅離子充當(dāng)酶的催化輔助因子或蛋白質(zhì)成分，比如含鋅指的蛋白質(zhì)［10］。在某些惡性腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度的增加或LIV-1基因表達(dá)失活可能是細(xì)胞凋亡抵抗和細(xì)胞加速生長的決定性因素［11-12］。而且研究報道［13］在斑馬魚胚胎和人類癌細(xì)胞中LIV-1 基因控制著上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程是惡性腫瘤發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移過程中的重要生物學(xué)事件，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中LIV-1基因是STAT3下游靶點，LIV-1基因與鋅指蛋白Snail 共同抑制鈣黏附蛋白E 的表達(dá)。

食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后受遺傳、生活方式和環(huán)境的影響［14-15］，某些基因的單核苷酸多態(tài)性可能通過某種方式改變蛋白質(zhì)表達(dá)水平或活性，促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生。WU 等［7］首次報道了與漢族食管鱗癌患者生存相關(guān)的新遺傳位點，rs1050631和rs7242481，位于18q12.2 染色體上LIV-1 基因。CHENG 等［16］進(jìn)一步探究LIV-1 基因促進(jìn)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，在細(xì)胞水平和動物實驗中，檢測經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路ERK1/2 和AKT 信號通路下游效應(yīng)，比如MMP1、MMP3、MYC 和SLUG 信號分子的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)不論是在動物實驗中還是食管鱗癌組織標(biāo)本中LIV-1 mRNA 表達(dá)水平與MMP1、MMP3、MYC 和SLUG 信號分子的mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)，說明LIV-1 基因可能通過調(diào)控AKT 和ERK1/2 信號通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

WU 等［7］發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌患者中，LIV-1 基因是食管鱗癌獨立預(yù)后因素，LIV-1 蛋白高表達(dá)的患者死亡風(fēng)險顯著高于LIV-1 蛋白低表達(dá)患者，本研究也提示LIV-1 蛋白高表達(dá)的死亡風(fēng)險顯著高于低表達(dá)組。CVI 等［17］發(fā)現(xiàn)LIV-1 蛋白在食管上皮癌前病變和食管鱗癌組織中均高表達(dá)，且與食管鱗癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)LIV-1 蛋白高表達(dá)是食管鱗癌獨立預(yù)后因素，在食管癌前病變時，LIV-1 蛋白就出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象。本研究中，在癌旁食管上皮組織中，LIV-1 蛋白基本上處于低表達(dá)狀態(tài)，LIV-1 蛋白高表達(dá)率為11.11%，食管鱗癌組織中高表達(dá)率為52.5%，并發(fā)現(xiàn)LIV-1 蛋白是食管鱗癌的獨立預(yù)后因素，但是LIV-1 蛋白高表達(dá)及低表達(dá)組間的食管鱗癌患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在本實驗中亞組分析結(jié)果得出，在淋巴結(jié)陰性組中，LIV-1 蛋白低表達(dá)組食管鱗癌患者OS、DFS 顯著高于高表達(dá)組；而淋巴結(jié)陽性組，LIV-1 蛋白低表達(dá)組和高表達(dá)組食管鱗癌患者OS、DFS 差異無統(tǒng)計學(xué)學(xué)意義，可能原因為LIV-1 基因在早期食管癌患者中對預(yù)后有一定影響，促進(jìn)腫瘤的浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，大部分屬于中晚期患者，預(yù)后普遍都很差，LIV-1 基因在這部分患者對預(yù)后的影響未能體現(xiàn)出來。亞組分析結(jié)果的不同提示，LIV-1 蛋白在食管鱗癌患者早期階段更具有預(yù)測價值。GAO 等［8］報道在胃腺癌術(shù)后患者中，LIV-1 基因rs1050631 遺傳位點與胃腺癌患者術(shù)后預(yù)后相關(guān)，LIV-1 基因可能促進(jìn)胃腺癌患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，LIV-1基因rs1050631 遺傳位點CT 和TT 基因型患者復(fù)發(fā)風(fēng)險和死亡風(fēng)險顯著高于CC 基因型患者。LIV-1 蛋白高表達(dá)可能是消化道腫瘤患者預(yù)后差的獨立預(yù)后因素。

近期有研究表明LIV-1 基因在T 淋巴細(xì)胞活化過程中具有重要作用，LIV-1 基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度的穩(wěn)定影響T 淋巴細(xì)胞的激活和凋亡，將來可能以LIV-1 基因作為免疫調(diào)節(jié)的治療靶點［18-19］。SUSSMAN 等［20］報道以LIV-1基因為靶點的新型抗體偶聯(lián)藥物SGN-LIV1A 有望用于治療難治性轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)型乳腺癌患者。BAGHERI 等［21］在兔子體內(nèi)合成針對LIV-1 基因的抗體，可以識別LIV-1 基因靶標(biāo)并與其天然蛋白結(jié)合。目前食管鱗癌患者藥物治療效果欠佳，無特異性靶向藥。在食管鱗癌患者中LIV-1 蛋白高表達(dá)率顯著高于正常食管上皮組織，相信不久的將來以LIV-1 基因為靶點的藥物可以為食管鱗癌患者帶來曙光。

綜上所述，LIV-1 蛋白低表達(dá)是食管鱗癌改善預(yù)后因子，對食管鱗癌早期診斷、潛在靶點的治療具有重要意義，但是距離找到針對LIV-1 基因靶點的藥物治療食管鱗癌患者仍需要很長的路，需要更深層次的研究。