張紫琴，張洪昌，沈根祥,*，胡雙慶，顧海蓉，趙曉祥,#

1. 東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620 2. 上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 200233

自被發(fā)現(xiàn)以來，青霉素就作為治療人類和動(dòng)物傳染病的藥物被廣泛使用，同時(shí)也作為一種添加劑在促進(jìn)動(dòng)物生長方面廣泛應(yīng)用[1-3]。Chen等[4]和Klein等[5]研究了包括中國在內(nèi)的76個(gè)國家在2000—2015年抗生素的消費(fèi)趨勢，結(jié)果表明，抗生素的消費(fèi)總量增加了65%，至2015年廣譜青霉素占抗生素消費(fèi)總量高達(dá)39%。2013年，我國獸用抗生素消費(fèi)量約占抗生素總消費(fèi)量的52%[6]。研究表明，獸用抗生素進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后不能被動(dòng)物完全吸收，大約有50%～90%的抗生素會(huì)以原藥或其代謝物的形式排出[7-8]。而目前畜禽糞尿還田是最常用的畜禽糞污處理方法，糞尿中的抗生素也會(huì)隨著還田過程進(jìn)入農(nóng)田、水體環(huán)境并富集到生物體中，從而對(duì)環(huán)境微生物群落和人體健康產(chǎn)生危害[9-10]。在所有的抗生素種類中，四環(huán)素和青霉素是最常用的2種獸用抗生素[11]。

抗生素在土壤中的降解動(dòng)力學(xué)研究以磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類較多[12-14]，而β-內(nèi)酰胺類抗生素雖然在土壤及有機(jī)肥中常被檢出，濃度范圍在0.62～12 mg·kg-1[15-17]，但其降解動(dòng)力學(xué)研究主要集中在牛奶和廢水等基質(zhì)中[18-21]，在土壤中的研究鮮見報(bào)道。馬靜靜[17]檢測了內(nèi)蒙古牧區(qū)12個(gè)土壤樣品中的青霉素，其中，陽性樣本占50%，檢出濃度最高為1.88 mg·kg-1。劉燕等[16]指出江蘇省南京市橫溪鎮(zhèn)農(nóng)田土中青霉素殘留濃度為2 mg·kg-1。段子恒[15]的研究表明，某制藥廠提供給西紅柿種植的青霉素菌渣肥(處理后)中青霉素濃度為12 mg·kg-1。Li等[22]的研究表明，制藥廢水經(jīng)過厭氧、水解及2個(gè)好氧單元處理，大部分的青霉素G可以被除去，最終濃度為μg·L-1量級(jí)，且其在地表水中的主要降解產(chǎn)物為青霉噻唑酸(penilloic acid)、中間體青霉氧酸(penicilloic acid)和青霉二酸異構(gòu)體(isopenillic acid)。

因此，本文選取畜禽養(yǎng)殖業(yè)中常用的典型β-內(nèi)酰胺類抗生素——青霉素G鉀作為目標(biāo)抗生素，研究其在滅菌及未滅菌的蔬菜地土壤以及添加有機(jī)肥土壤中的降解行為，并使用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程來擬合，為防止抗生素對(duì)環(huán)境造成污染提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

試劑：青霉素G鉀(penicillin G potassium, PG)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>97%)、內(nèi)標(biāo)物氘代青霉素G鉀鹽(penicillin G-d5 potassium salt, phenyl-d5)標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.7%)，均購于德國Dr. Ehrenstorfer公司；本實(shí)驗(yàn)中用到的甲醇、乙腈和甲酸等均為色譜級(jí)試劑，其中，有機(jī)溶劑購于美國Tedia公司，甲酸購于德國CNW科技公司；磷酸、磷酸二氫鈉為分析純，購于上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。將青霉素G鉀標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解配制為500 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存在4 ℃冰箱中。

磷酸鹽緩沖溶液：稱取24.0 g磷酸二氫鈉，用超純水定容至1 L，用磷酸調(diào)節(jié)溶液pH至3.0。

供試土壤及有機(jī)肥：本實(shí)驗(yàn)所用土壤采自上海市金山區(qū)的一塊空白實(shí)驗(yàn)蔬菜地(121.278933°W, 30.788379°N)，該地在之前的5年內(nèi)未施用有機(jī)肥，采集農(nóng)田表層土壤(深度0～20 cm)帶回，經(jīng)自然風(fēng)干后，去除植物殘根及沙礫，磨碎過10目篩，保存在4 ℃環(huán)境中。有機(jī)肥采集自沁儂豬場自然堆肥18 d后的豬糞，保存在-20 ℃環(huán)境中。所用土壤及有機(jī)肥均未有目標(biāo)抗生素檢出，理化性質(zhì)如表1所示。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 The basic physical and chemical properties of the soil

儀器與材料：Waters Xevo TQ-S Micro高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)，色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 collumn(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) (美國Waters公司)；CEM MARS CLASSIC高壓微波消解萃取儀(美國CEM公司)；YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀(廈門?？苾x器有限公司)；AUTO-EVA全自動(dòng)氮吹濃縮儀(廈門?？苾x器有限公司)；Oasis?HLB 60 μm (6 mL, 500 mg)固相萃取柱(美國Waters公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；LDG-0.3C低溫真空冷凍干燥機(jī)(上海昊博低溫真空設(shè)備有限公司)。

1.2 降解實(shí)驗(yàn)

1.2.1 青霉素G鉀在滅菌及未滅菌蔬菜地土壤中的降解實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取(50.000 ± 0.0001) g(干重)過篩土壤于100 mL燒杯中，設(shè)置滅菌組和未滅菌組。滅菌組在121 ℃條件下濕熱滅菌3次，間隔時(shí)間為24 h。將抗生素的甲醇稀釋液加入到土壤中，充分混勻，使土壤中的其初始濃度分別為1、5和10 mg·kg-1，然后將燒杯置于通風(fēng)櫥下24 h，待載體溶劑甲醇揮發(fā)干后，用滅菌后的超純水調(diào)節(jié)土壤濕度為30%。最后，將樣品用保鮮膜封口，在保鮮膜上保留通氣孔，且用鋁箔紙包裹置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天稱重并補(bǔ)充樣品損失水分，每天搖晃以鼓入空氣，維持好氧條件。在培養(yǎng)的第0、1、3、5、7、14、21、28、35和42天破壞性取樣，測定土壤樣品中抗生素的殘留量，并記錄。

1.2.2 青霉素G鉀在添加與未添加有機(jī)肥蔬菜地土壤中的降解實(shí)驗(yàn)

中國有機(jī)農(nóng)業(yè)網(wǎng)發(fā)布的要使蔬菜地大棚的土壤有機(jī)質(zhì)保持在1.5%的水平，對(duì)于150 000 kg耕作層土壤而言，每年施入的有機(jī)質(zhì)至少應(yīng)為450 kg，根據(jù)有機(jī)肥的有機(jī)質(zhì)含量(12%)設(shè)定混合基質(zhì)中土壤與有機(jī)肥的質(zhì)量比為1∶0.025，有機(jī)肥在培養(yǎng)的第0天一次性添加，即準(zhǔn)確稱取50 g土壤(干重)和1.25 g有機(jī)肥(干重)于100 mL燒杯中。剩余實(shí)驗(yàn)過程與1.2.1中一致。

1.3 樣品提取與凈化

將土壤樣品真空低溫凍干后，研磨過20目篩，準(zhǔn)確稱取(1.000 ± 0.0001) g于100 mL微波萃取管中，加入10 μL 5 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)物，加入50 mL乙腈-磷酸鹽緩沖液(V∶V= 1:1)，于65 ℃條件下微波萃取30 min。后續(xù)抗生素提取液的富集凈化步驟參考汪仙仙等[7]的方法。

1.4 樣品檢測分析

目標(biāo)抗生素的定性和定量分析通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀來實(shí)現(xiàn)。液相色譜條件：流動(dòng)相A為0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速為0.35 mL·min-1，進(jìn)樣量為2 μL。梯度洗脫程序?yàn)椋?～2.2 min，84% B；2.2～5.5 min，84%～5% B；5.5～6.0 min，5%～84% B；6.0～9.0 min，84% B。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，掃描方式為多反應(yīng)離子檢測(MRM)，毛細(xì)管電壓為3 kV，脫溶劑氣溫度為500 ℃，脫溶劑氣流速為1 000 L·h-1。用甲醇將抗生素儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋成不同系列的濃度，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為1.37～500 μg·kg-1，以濃度為橫坐標(biāo)，儀器響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。目標(biāo)抗生素的母離子、子離子、標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限、檢測限和加標(biāo)回收率等參數(shù)如表2所示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)為3次平行實(shí)驗(yàn)的算術(shù)平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由Origin 2017進(jìn)行一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合，顯著性分析采用單因素方差分析。

(1)降解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程：Ct=C0e-kt

表2 目標(biāo)抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限、定量限和加標(biāo)回收率Table 2 The standard curves, detection limits, quantitative limits and recoveries of antibiotics

式中：C0為土壤中抗生素初始濃度，mg·kg-1；Ct為時(shí)間為t時(shí)土壤中抗生素濃度，mg·kg-1；t為時(shí)間(d)；k為降解速率常數(shù)(d-1)；η為降解速率(mg·kg-1·d-1)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 滅菌與未滅菌對(duì)土壤中抗生素降解的影響

以青霉素G鉀初始濃度為10 mg·kg-1為例，培養(yǎng)周期內(nèi)土壤中抗生素的殘留量和降解速率變化如圖1(a)、1(c)所示(降解速率由擬合后一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的參數(shù)計(jì)算得出)。在未滅菌的土壤中，實(shí)驗(yàn)第0、1、3、5和7天的降解速率分別為4.32、2.83、1.22、0.53和0.23 mg·kg-1·d-1，在第7天，抗生素的降解率>97%，已基本降解完全。7 d后降解速率<0.01 mg·kg-1·d-1，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，青霉素G鉀在土壤中的最終濃度為29.8 μg·kg-1。在滅菌土壤中，實(shí)驗(yàn)第0、1、3、5和7天的降解速率分別為1.53、1.31、0.96、0.70和0.52 mg·kg-1·d-1，在第7天，抗生素的降解率<60%，7 d后仍以較快速度繼續(xù)降解，到14 d時(shí)降解速率為0.06 mg·kg-1·d-1(降解率為94%)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，抗生素的最終濃度為22.6 μg·kg-1。

滅菌與未滅菌土壤、不同初始濃度的青霉素G鉀的降解動(dòng)力學(xué)計(jì)算結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)(1～10 mg·kg-1)，一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程均能很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合相關(guān)系數(shù)(r2)在0.951～0.997之間，二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合相關(guān)系數(shù)(r2)在0.85～0.975之間，降解速率與抗生素的初始濃度有關(guān)。由表3可知，青霉素G鉀在滅菌土壤中的半衰期在4.48～6.48 d之間，在未滅菌土壤中的半衰期在1.61～1.67 d之間。青霉素G鉀在滅菌土壤中的半衰期顯著高于未滅菌土壤，表明微生物與其他非生物因素在抗生素的降解中發(fā)揮著重大的作用，且抗生素在土壤中的半衰期較短(<7 d)，在環(huán)境中易分解而不易殘留和轉(zhuǎn)移。

表3 PG在滅菌和未滅菌土壤上的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters for the degradation of PG in sterile and non-sterile soils

2.2 添加有機(jī)肥對(duì)土壤中抗生素降解的影響

培養(yǎng)周期內(nèi)青霉素G鉀在添加有機(jī)肥土壤中的殘留量和降解速率變化如圖1(b)、1(d)所示(降解速率由擬合后一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的參數(shù)計(jì)算得出)。以青霉素G鉀初始濃度為10 mg·kg-1為例，可以看出，土壤中青霉素G鉀的濃度隨時(shí)間逐漸降低，在培養(yǎng)的前7天，抗生素快速降解，第0、1、3、5和7天的降解速率分別為3.71、2.61、1.29、0.64和0.32 mg·kg-1·d-1，降解在第7天之后趨于平緩。在實(shí)驗(yàn)第7天，土壤中青霉素G鉀的濃度為0.07 mg·kg-1，降解率為99.3%，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，抗生素的濃度為28.7 μg·kg-1。

添加有機(jī)肥土壤中不同初始濃度的青霉素G鉀的降解動(dòng)力學(xué)計(jì)算結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)(1～10 mg·kg-1)，一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程均能很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合相關(guān)系數(shù)(r2)在0.91～0.978之間。由表4可知，青霉素G鉀在添加了有機(jī)肥蔬菜地土壤中的半衰期為1.85～2.39 d。

圖1 PG在蔬菜地土壤中殘留量和降解速率隨時(shí)間的變化注：圖中1、5和10分別表示土壤中PG的初始濃度為1、5和10 mg·kg-1；(a)、(c)表示PG在滅菌與未滅菌組土壤中的殘留量和降解速率，(b)、(d)表示PG在施加有機(jī)肥與未施加有機(jī)肥組土壤中的殘留量和降解速率。Fig. 1 Residue and degradation rates of PG in vegetable soilNote: 1, 5 and 10 denote the initial concentration of 1, 5 and 10 mg·kg-1 for PG in soil, respectively; (a) and (c) denote residue and degradation rates of PG in sterile and non-sterile soil; (b) and (d) indicate residue and degradation rates of PG in compost and compost-free soil.

表4 PG在添加有機(jī)肥土壤中的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters for the degradation of PG in vegetable soils with compost

3 討論(Discussion)

青霉素G鉀在未滅菌土壤和滅菌土壤中的降解存在著顯著差異(P<0.05)，未滅菌土壤中青霉素G鉀的降解速率快于滅菌土壤，且無論是滅菌土壤還是未滅菌土壤，青霉素G鉀的降解都呈現(xiàn)先快后慢的趨勢，最后趨于平衡，青霉素G鉀會(huì)以一個(gè)很低的水平(小于獸藥國際協(xié)調(diào)委員會(huì)提出的生態(tài)毒害效應(yīng)觸發(fā)值100 μg·kg-1)在土壤中存在很長時(shí)間，可能會(huì)存在誘導(dǎo)土壤中抗性基因的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[23]。研究表明，青霉素G鉀在土壤中的降解由生物與非生物共同作用所致。這一結(jié)果與Andreozzi等[24]研究阿莫西林的降解工藝包括非生物(水解)和生物(活性污泥中的生物降解)一致。Liu等[25]研究好氧堆肥過程中阿莫西林的降解也得出類似結(jié)論，阿莫西林的降解過程中β-內(nèi)酰胺環(huán)的開環(huán)受到生物和非生物因素的共同影響。

相同實(shí)驗(yàn)時(shí)間和相同處理?xiàng)l件下，不同濃度的抗生素降解速率表現(xiàn)出顯著不同(P<0.05)，抗生素初始濃度越高，降解速率越快，但不同初始濃度的抗生素在土壤中降解的半衰期基本一致，最終降解程度也無明顯差異，即污染水平對(duì)抗生素的半衰期無明顯影響，進(jìn)入環(huán)境中的青霉素G鉀能很快降解(參考POPs國際公約中關(guān)于化學(xué)品持久性的定義，有機(jī)物在土壤中的半衰期小于1個(gè)月的為易降解)，但由于青霉素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用，導(dǎo)致青霉素源源不斷地進(jìn)入到環(huán)境中，造成假性持久性污染。Zhang等[26]研究初始濃度為898.51 mg·kg-1的青霉素菌渣與豬糞共堆肥時(shí)，發(fā)現(xiàn)青霉素的半衰期為1.7 d，在堆肥混合料中添加青霉素發(fā)酵菌渣對(duì)堆肥過程沒有影響，甚至對(duì)堆肥中微生物的活性沒有促進(jìn)作用。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，Yang等[27]研究磺胺嘧啶在土壤中的降解情況時(shí)，設(shè)置了1、10和25 mg·kg-13個(gè)濃度，發(fā)現(xiàn)其半衰期分別為2、18和34 d，認(rèn)為高濃度的磺胺嘧啶抑制了土壤中的微生物活性，影響到了抗生素的降解過程。Selvam等[28]研究四環(huán)素的降解時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，四環(huán)素的半衰期為11.5 d。因此，可以假設(shè)，由于青霉素降解速率快，半衰期短，其初始濃度對(duì)細(xì)菌種群的影響較小且非生物作用在青霉素的降解過程中起著重要的作用。

運(yùn)用SPSS 24對(duì)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)抗生素在未添加有機(jī)肥土壤和添加有機(jī)肥土壤的殘留量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)2組數(shù)據(jù)差異不明顯(P>0.05)?？赡苁怯捎诒緦?shí)驗(yàn)用的是堆肥18 d后的有機(jī)肥，每單位干重有機(jī)肥的碳、氮含量低于動(dòng)物鮮糞[29]，且添加有機(jī)肥比例較小，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)土壤碳源充足，導(dǎo)致所添加有機(jī)肥不能有效地增加土壤中微生物的數(shù)量，對(duì)土壤中抗生素的生物降解影響較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，2種土壤中青霉素G鉀含量均<30 μg·kg-1，差異不大，表明在當(dāng)前添加有機(jī)肥的含量下，對(duì)抗生素的最終降解率不產(chǎn)生明顯影響。

抗生素在土壤中的降解，除生物降解以外，還有其他因素的影響，如抗生素的理化性質(zhì)、土壤的理化性質(zhì)及環(huán)境因素等[30-33]。本實(shí)驗(yàn)在避光環(huán)境下進(jìn)行，光照對(duì)于抗生素降解的影響可忽略不計(jì)，因此，非生物降解主要考慮水解和土壤理化性質(zhì)影響。研究表明，β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定，在環(huán)境中容易受酸堿度、二價(jià)重金屬離子、羥基離子和β-內(nèi)酰胺酶的影響，發(fā)生酰胺鍵斷裂開環(huán)，使得抗生素發(fā)生降解[25,34-35]。青霉素類抗生素在酸性、中性和堿性環(huán)境中，均能發(fā)生水解反應(yīng)，β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)[36]，有些金屬離子，例如Chen等[37]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+能與氨芐西林的羧基和叔氮配位，促進(jìn)抗生素的水解反應(yīng)。王偉杰和賈勵(lì)瑛[38]研究頭孢克洛的水解行為，發(fā)現(xiàn)溫度在25～45 ℃內(nèi)，抗生素水解率隨溫度升高而增大，推測是溫度的升高加速了水解反應(yīng)的進(jìn)行。章明奎等[39]研究4類抗生素在10種不同土壤中的降解行為，結(jié)果表明，土壤粘粒含量和氧化鐵含量與降解率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，土壤有機(jī)質(zhì)含量輕微影響抗生素降解率，土壤pH和陽離子交換量幾乎不影響抗生素降解率。

綜上，本研究表明，青霉素G鉀在土壤中的降解速度很快，7 d內(nèi)降解率達(dá)到97%以上。本實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)(42 d)青霉素G鉀以較低的水平(<100 μg·kg-1)在土壤中長期存在且難以降解完全；青霉素G鉀在滅菌與未滅菌蔬菜地土壤的降解曲線顯示，其降解過程受生物和非生物作用共同影響。動(dòng)力學(xué)擬合方程表明，青霉素G鉀的降解速率與濃度呈正相關(guān)，但其半衰期與濃度無顯著關(guān)系(1.61～1.67 d)；按質(zhì)量比1∶0.025(土壤∶有機(jī)肥)添加自然堆肥18 d后的豬糞不改變青霉素G鉀的最終降解率，且降解過程和未添加有機(jī)肥組無顯著差異。