陳進(jìn)林，許玉潔，高亮，蔡佳宏，梁嘉慧，余明喧，肖億金，陳桂蘭，馮寶欣，霍嘉維，梅承芳,#，曾國(guó)驅(qū),*

1. 廣東省微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，廣東省科學(xué)院，廣州 510070 2. 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070 3. 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070 4. 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

敵草隆(diuron)是一種常用的典型防污漆活性添加劑，也是一種抑制植物光合作用的除草劑[1]，其水解、光解和生物降解的半衰期均較長(zhǎng)，有環(huán)境持久性[2]。由于長(zhǎng)期廣泛的使用，近年來，敵草隆在地表水、海洋環(huán)境中被頻繁檢出，對(duì)環(huán)境和人類健康存在一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。有研究表明，敵草隆對(duì)水生生物有一定的生態(tài)毒性，其中，藻類是對(duì)其最為敏感的物種，并且隨著食物鏈的傳遞可在魚類和甲殼類生物體內(nèi)蓄積[1]。Mansano等[5]的研究表明，敵草隆對(duì)月牙藻(Raphidocelissubcapitata)的96 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.4 μg·L-1，對(duì)近具刺鏈帶藻(Desmodesmussubspicatus)的72 h-IC50為46.3 μg·L-1[6]，顯示出極高的毒性。Nebeker和Schuytema[4]的研究表明，敵草隆對(duì)枝角類、端足類、搖蚊、魚類、蚯蚓和螺都有一定的慢性毒性，其中，對(duì)蚤狀溞(Daphniapulex)繁殖抑制的7 d最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)為7.7 mg·L-1，無可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)為4.0 mg·L-1；對(duì)黑頭呆魚幼魚的10 d半致死濃度(LC50)為27.1 mg·L-1。目前，標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)試要求更長(zhǎng)生命周期的慢性毒性數(shù)據(jù)[7-8]，以支撐對(duì)化學(xué)品的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。但是，敵草隆對(duì)水生甲殼綱枝角類更長(zhǎng)生命周期的慢性毒性研究，卻鮮見有報(bào)道。

近年來，研究人員一直在探索無毒或低毒、對(duì)環(huán)境更友好的防污漆活性物質(zhì)，以替代目前常用的高毒性的物質(zhì)，其中一個(gè)研究方向是將低毒、具有殺生活性的天然產(chǎn)物添加于防污漆中[9]。辣椒素(capsaicin)被認(rèn)為是最具潛力的天然防污漆活性添加劑之一，有研究者認(rèn)為，與現(xiàn)有防污漆添加劑相比，辣椒素具有很多優(yōu)勢(shì)特性[10-13]。LaHann等[14]的研究表明，辣椒素的辛醇-水分配系數(shù)比較低(logKow= 3.04)，表明其不太可能具有生物蓄積性。辣椒素還具有快速生物降解性，對(duì)羊角月牙藻生長(zhǎng)抑制的72 h半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為5.114 mg·L-1，對(duì)斑馬魚的96 h-LC50為5.98 mg·L-1[9]。Angarano等[12]的研究表明，辣椒素對(duì)大型溞的LC50為18.3 mg·L-1。所以，辣椒素對(duì)水生生物具有一定的急性毒性。Oliveira等[15]的研究表明，1 mg·L-1的辣椒素對(duì)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的生長(zhǎng)、大型溞的急性活動(dòng)和斑馬魚胚胎的死亡率均沒有顯著影響，但可以顯著提高胚胎心臟的心率，因此，研究辣椒素在低濃度長(zhǎng)期暴露下對(duì)水生生物的慢性毒性，顯得尤為必要。

大型溞(Daphniamagna)屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼動(dòng)物綱(Crustacea)，在世界范圍分布廣泛，處在水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的第二級(jí)(初級(jí)消費(fèi)者)，具有重要的生態(tài)學(xué)地位。大型溞體形小、易于實(shí)驗(yàn)室操作和繁殖、全年可獲得幼溞，主要以孤雌生殖方式進(jìn)行繁殖，易于得到基因型一致的單克隆個(gè)體，對(duì)有毒物質(zhì)敏感性高，被作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物廣泛應(yīng)用于有毒物質(zhì)的急性和慢性毒性研究[16]，獲得的毒性數(shù)據(jù)是我國(guó)新化學(xué)物質(zhì)管理常規(guī)登記中必須提供的毒性數(shù)據(jù)之一[17]。

防污漆活性物質(zhì)的廣泛使用為控制船舶和海洋設(shè)施的生物污損貢獻(xiàn)巨大，但也導(dǎo)致了在世界范圍內(nèi)的許多港口和碼頭都檢出了高濃度的活性物質(zhì)，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了潛在威脅[3]，因此，研發(fā)、篩選獲得無毒或低毒、對(duì)環(huán)境友好的活性物質(zhì)成為當(dāng)前社會(huì)的迫切需求。筆者選用大型溞為受試生物，研究敵草隆和辣椒素對(duì)大型溞的急性和慢性毒性效應(yīng)，為其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大型溞引種自沈陽化工研究院安全評(píng)價(jià)中心，在實(shí)驗(yàn)室用Elendt M4培養(yǎng)基[7,18]培養(yǎng)和繁殖。環(huán)境溫度為(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，光照強(qiáng)度范圍為1 000～1 500 lux，投喂?jié)饪s的斜生柵藻液(Scenedesmusobliquus)或羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)液，使大型溞始終處于孤雌繁殖狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)前，大型溞已于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)半年以上，驗(yàn)證其對(duì)重鉻酸鉀的24 h-EC50為1.85 mg·L-1，95%的置信限為1.72～1.99 mg·L-1，符合相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中敏感性范圍(0.6～2.1 mg·L-1)[19-20]。選擇出生<24 h的幼溞作為實(shí)驗(yàn)溞。

敵草隆購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度≥98%，分子式為C9H10Cl2N2O，CAS號(hào)為330-54-1，外觀為白色晶體。辣椒素購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社，純度>96.0%，分子式為C18H27NO3，CAS號(hào)為404-86-4，外觀為白色粉末。

高分離度快速液相色譜儀(RRLC，Agilent 1260，美國(guó))，光照培養(yǎng)箱(PGX-330B-22H，寧波萊?？萍加邢薰?，pH計(jì)(pH3210，WTW，德國(guó))，溶解氧儀(Oxi330i和Oxi3210，WTW，德國(guó))，水質(zhì)硬度計(jì)(HI96735，HANNA，意大利)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 敵草隆分析方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了準(zhǔn)確表征敵草隆的實(shí)際暴露濃度，采用RRLC測(cè)定實(shí)驗(yàn)溶液中敵草隆濃度。建立的液相分析條件為：BDS Hypersil C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.4 μm)，流動(dòng)相為水-乙腈(體積比為50∶50)，柱溫40 ℃，檢測(cè)器DAD，檢測(cè)波長(zhǎng)212 nm，流速0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量3.0 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍和檢出限：準(zhǔn)確稱取敵草隆標(biāo)樣，用乙腈配制成251.7 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)貯備液。然后用50%乙腈逐步稀釋，分別獲得0.126、0.503、1.01、2.52、12.6和50.3 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述條件進(jìn)行測(cè)定。以信噪比(S/N)的3倍計(jì)算檢出限(LOD)，10倍計(jì)算定量限(LOQ)。

精密度分析：取2.52 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行濃度測(cè)定。

回收率分析：用試驗(yàn)用水逐步稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備液或標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別獲得理論濃度為1.01、1.26和2.52 mg·L-1的樣品，每個(gè)樣品進(jìn)樣測(cè)定3次，以實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的比值計(jì)算回收率。

1.2.2 辣椒素分析方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了準(zhǔn)確表征辣椒素的實(shí)際暴露濃度，采用RRLC測(cè)定實(shí)驗(yàn)溶液中辣椒素濃度。建立的液相分析條件為：BDS Hypersil C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.4 μm)，流動(dòng)相為0.05%磷酸-甲醇(體積比為30∶70)，柱溫40 ℃，檢測(cè)器DAD，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5.0 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍和檢出限：準(zhǔn)確稱取辣椒素標(biāo)樣，用甲醇配制成122.5 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)貯備液。然后用70%甲醇逐步稀釋，分別獲得0.245、0.490、1.96、4.90、12.3和49.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述條件進(jìn)行測(cè)定。以信噪比(S/N)的3倍計(jì)算檢出限(LOD)，10倍計(jì)算定量限(LOQ)。

精密度分析：取4.90 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行濃度測(cè)定。

回收率分析：用試驗(yàn)用水逐步稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備液或標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別獲得理論濃度為0.490、1.23和2.45 mg·L-1的樣品，每個(gè)樣品進(jìn)樣測(cè)定3次，以實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的比值計(jì)算回收率。

1.2.3 敵草隆和辣椒素在實(shí)驗(yàn)體系的溶解性和穩(wěn)定性

按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)系列指南文件No.23[21]的評(píng)估方法，通過預(yù)試驗(yàn)，獲知敵草隆和辣椒素均較難溶于水。經(jīng)過約10 min的超聲波分散和約24 h的連續(xù)磁力攪拌，獲得敵草隆和辣椒素在Elendt M4培養(yǎng)基中的飽和溶液(saturation solution, SS)，用RRLC測(cè)定其飽和溶解濃度分別為30 mg·L-1和17 mg·L-1。

敵草隆在急性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)體系中的濃度在48 h內(nèi)可維持在設(shè)置濃度的±20%范圍內(nèi)，因此，可以靜態(tài)方式開展急性毒性實(shí)驗(yàn)，以48 h更換1次暴露溶液的半靜態(tài)方式開展慢性毒性實(shí)驗(yàn)。可能是具有快速生物降解性的原因，辣椒素在急性毒性實(shí)驗(yàn)體系中的濃度半衰期約為48 h，在添加了濃縮綠藻液的慢性毒性實(shí)驗(yàn)體系中，濃度下降還可能會(huì)加快，因此，均以24 h更換1次暴露溶液的半靜態(tài)方式開展辣椒素的急性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)(表1)。

1.2.4 急性毒性實(shí)驗(yàn)

制備受試物的飽和溶液，再用Elendt M4培養(yǎng)基稀釋獲得不同濃度的受試物實(shí)驗(yàn)溶液。參照OECD 202[19]和《化學(xué)品測(cè)試方法 生物系統(tǒng)效應(yīng)卷》[18]的方法，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，獲得受試物對(duì)大型溞未產(chǎn)生活動(dòng)抑制的最高濃度(EC0)和完全產(chǎn)生活動(dòng)抑制的最低濃度(EC100)，從而確定正式實(shí)驗(yàn)的濃度范圍。

對(duì)于敵草隆，以1.310為濃度間隔系數(shù)，設(shè)置10.2、13.3、17.5、22.9和30.0 mg·L-1的受試物實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。對(duì)于辣椒素，以1.330為濃度間隔系數(shù)，設(shè)置32.0%、42.5%、56.5%、75.2%和100% SS的受試物實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。將每個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)溶液，分裝入4個(gè)試驗(yàn)容器(150 mL燒杯)，每個(gè)容器含50 mL實(shí)驗(yàn)溶液和5只幼溞。環(huán)境溫度控制在(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，實(shí)驗(yàn)持續(xù)48 h。在實(shí)驗(yàn)開始后24 h和48 h，觀察和記錄大型溞的活動(dòng)抑制情況。實(shí)驗(yàn)期間，不曝氣也不喂食。

在敵草隆的正式實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定新制備的飽和溶液中敵草隆的實(shí)際濃度，再用培養(yǎng)基稀釋獲得各濃度實(shí)驗(yàn)溶液。實(shí)驗(yàn)期間不更換實(shí)驗(yàn)溶液，為靜態(tài)實(shí)驗(yàn)。在0 h和48 h，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組的溫度、pH和溶解氧濃度，同時(shí)采集實(shí)驗(yàn)溶液，用于測(cè)定敵草隆的實(shí)際濃度。

在辣椒素的正式實(shí)驗(yàn)中，用培養(yǎng)基直接稀釋新制備的SS溶液，獲得各濃度實(shí)驗(yàn)溶液。實(shí)驗(yàn)期間每24 h更換1次實(shí)驗(yàn)溶液，為24 h半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)。在0、24和48 h，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組的溫度、pH和溶解氧濃度，同時(shí)采集新、舊實(shí)驗(yàn)溶液，用于測(cè)定辣椒素的實(shí)際濃度。

1.2.5 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

參照OECD 211[7]和《化學(xué)品測(cè)試方法 生物系統(tǒng)效應(yīng)卷》[18]的方法，依據(jù)大型溞急性活動(dòng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)的濃度范圍。對(duì)于敵草隆，以1.770為濃度間隔系數(shù)，設(shè)置1.02、1.80、3.19、5.56和10.0 mg·L-1的受試物實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組；對(duì)于辣椒素，以1.351為濃度間隔系數(shù)，設(shè)置15%、20.3%、27.4%、37%和50% SS的受試物實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置10個(gè)平行(容器)，每個(gè)容器(150 mL燒杯)含80 mL實(shí)驗(yàn)溶液和1只親溞。環(huán)境溫度控制在(20±1) ℃，光暗比為16 h∶8 h，光照強(qiáng)度范圍為1 000～1 500 lux，實(shí)驗(yàn)周期為21 d。實(shí)驗(yàn)期間，不曝氣，每天向各個(gè)容器投喂藻細(xì)胞濃縮液，投喂量(以碳計(jì))為0.1～0.2 mg C·溞-1·d-1。

在敵草隆的正式實(shí)驗(yàn)中，每天投喂?jié)饪s的斜生柵藻液，每48 h更換1次實(shí)驗(yàn)溶液，測(cè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)組在0、8和18 d的新實(shí)驗(yàn)溶液和2、10和20 d的舊實(shí)驗(yàn)溶液中敵草隆的實(shí)際濃度，測(cè)定空白對(duì)照組和1.02、10.0 mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組在0、8和18 d的新實(shí)驗(yàn)溶液和2、10和20 d的舊實(shí)驗(yàn)溶液中的溫度、pH、溶解氧濃度和總硬度。

表1 敵草隆和辣椒素在急性和慢性實(shí)驗(yàn)體系中的穩(wěn)定性Table 1 Stability of diuron and capsaicin in test system of acute and chronic test

在辣椒素的正式實(shí)驗(yàn)中，每天投喂?jié)饪s的羊角月牙藻液，每24 h更換1次實(shí)驗(yàn)溶液，測(cè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)、每次更換實(shí)驗(yàn)溶液前后和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)溶液中辣椒素的實(shí)際濃度，測(cè)定空白對(duì)照組和5% SS、50% SS的實(shí)驗(yàn)組在0、8和15 d的新實(shí)驗(yàn)溶液和1、9和16 d的舊實(shí)驗(yàn)溶液中的溫度、pH、溶解氧濃度和總硬度。

試驗(yàn)期間，每天觀察親溞的外觀和存活情況，及時(shí)移除出生的幼溞并計(jì)算存活幼溞的數(shù)量，記錄親溞的死亡率、產(chǎn)幼溞的數(shù)量、初次生殖時(shí)間和總生殖胎數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定所有存活親溞的體長(zhǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Office Excel 2010匯總和整理數(shù)據(jù)。

對(duì)大型溞急性毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)，用概率分析法(Probit Analysis Method)和修正的斯皮爾曼-卡伯法(Trimmed Spearman-Karber Method)統(tǒng)計(jì)EC50。

對(duì)大型溞慢性毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)，先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)(Shapiro-Wilk test檢驗(yàn))、方差齊性檢驗(yàn)(Levene’s test檢驗(yàn))。在數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且等方差性前提條件下，使用方差分析檢驗(yàn)顯著性差異，并用多重比較檢驗(yàn)(Dunnet’t test)分析處理不同濃度間的差異顯著性。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或存在不等方差性時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test)分析其顯著性差異。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果(Results)

2.1 敵草隆和辣椒素分析方法驗(yàn)證結(jié)果

以吸收峰面積為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖1所示。敵草隆在0.126～50.3 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值存在極好的線性關(guān)系，線性方程為y= 53.6x+ 7.5998 (R2= 0.9998)，LOD為0.0330 mg·L-1，LOQ為0.110 mg·L-1。辣椒素在0.245～49.0 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值的線性關(guān)系極好，線性方程為y= 22.8x+ 1.8293 (R2= 0.9999)，LOD為0.0665 mg·L-1，LOQ為0.222 mg·L-1。

精密度分析結(jié)果表明，2.52 mg·L-1的敵草隆標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)得的平均峰面積為140.42，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.23%；4.90 mg·L-1的辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)得的平均峰面積為116.69，RSD為0.34%，說明2個(gè)分析方法的精密度良好。

回收率分析結(jié)果表明，加標(biāo)1.01、1.26和2.52 mg·L-1的敵草隆樣品的平均回收率分別為92.2%、96.2%和102%；加標(biāo)0.490、1.23和2.45 mg·L-1的辣椒素樣品的平均回收率分別為89.2%、92.9%和97.3%，說明2個(gè)分析方法的回收率良好(表2)。

表2 敵草隆和辣椒素回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery test for diuron and capsaicin

2.2 敵草隆和辣椒素在實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和暴露濃度的表征

正式實(shí)驗(yàn)中，敵草隆的實(shí)測(cè)濃度在48 h內(nèi)能始終維持在設(shè)置濃度的±20%范圍內(nèi)，與預(yù)實(shí)驗(yàn)的情況一致，可直接以設(shè)置濃度表示敵草隆的暴露濃度。

由于辣椒素具有快速生物降解性，在其慢性毒性正式實(shí)驗(yàn)中，可能是加入濃縮的藻液加速了其降解，在24 h內(nèi)其部分實(shí)測(cè)濃度低于初始濃度的80%，因此，需以實(shí)測(cè)濃度的時(shí)間-加權(quán)平均值表示其暴露濃度[21]。急性毒性正式實(shí)驗(yàn)中，32.0%、42.5%、56.5%、75.2%和100% SS實(shí)驗(yàn)組的時(shí)間-加權(quán)平均值分別為4.52、6.01、8.08、10.9和14.6 mg·L-1；慢性毒性正式實(shí)驗(yàn)中，15%、20.3%、27.4%、37%和50% SS實(shí)驗(yàn)組的時(shí)間-加權(quán)平均值分別為1.95、2.65、4.33、5.83和8.06 mg·L-1。

圖1 敵草隆和辣椒素的分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve for analysis of diuron and capsaicin

2.3 對(duì)大型溞的急性毒性

急性毒性實(shí)驗(yàn)中，溶液的pH在7.62～8.22范圍內(nèi)，溶解氧濃度在4.7～8.3 mg·L-1之間，始終滿足不低于3 mg·L-1的實(shí)驗(yàn)有效性要求。2組實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組大型溞表觀均正常，無活動(dòng)抑制和死亡現(xiàn)象。大型溞暴露于不同濃度的實(shí)驗(yàn)溶液后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在不同濃度組中表現(xiàn)出不同程度的活動(dòng)抑制，濃度-效應(yīng)相關(guān)性顯著。

敵草隆對(duì)大型溞的24 h和48 h EC50分別為>30 mg·L-1和17.1 mg·L-1；辣椒素對(duì)大型溞的24 h和48 h EC50分別為13.3 mg·L-1和12.4 mg·L-1，如表3所示?？梢?，大型溞對(duì)辣椒素的毒性響應(yīng)較快，但到48 h時(shí)，兩者所呈現(xiàn)的急性毒性水平相當(dāng)。根據(jù)《化學(xué)品分類和標(biāo)簽規(guī)范 第28部分：對(duì)水生環(huán)境的危害》(GB 30000.28—2013)[8]的急性分類標(biāo)準(zhǔn)，敵草隆和辣椒素對(duì)大型溞都屬于急性水生危害的類別3。

表3 敵草隆和辣椒素對(duì)大型溞急性毒性效應(yīng)Table 3 Acute toxicity of diuron and capsaicin to Daphnia magna

2.4 對(duì)大型溞的慢性毒性

敵草隆和辣椒素的慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組親溞的死亡率均為0%，所產(chǎn)存活幼溞數(shù)量的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分別為179±7(變異系數(shù)為3.9%)和158±14(變異系數(shù)為8.3%)，均>60，滿足OECD 211對(duì)實(shí)驗(yàn)有效性的要求，變異系數(shù)均<25%，表明實(shí)驗(yàn)運(yùn)行的質(zhì)量良好。實(shí)驗(yàn)溶液的pH在7.80～8.81范圍內(nèi)，溶解氧濃度在7.5～9.1 mg·L-1范圍內(nèi)，水溫在19. 5～20.8 ℃之間，水質(zhì)總硬度為260～270 mg·L-1(以CaCO3計(jì))，光照強(qiáng)度范圍在1 010～1 375 lux。

2.4.1 敵草隆的慢性毒性

各項(xiàng)毒性指標(biāo)結(jié)果如表4所示。1.02、1.80、3.19、5.65和10.0 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的親溞死亡率分別為0%、0%、0%、0%和20%，經(jīng)Cochran-Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)，顯示濃度與親溞死亡率之間有緊密的相關(guān)性，表明敵草隆具有一定的慢性致死效應(yīng)。

表4 敵草隆對(duì)大型溞慢性毒性實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)毒性指標(biāo)結(jié)果匯總Table 4 Summary of all endpoints observed in the chronic test of diuron to Daphnia magna

敵草隆對(duì)大型溞的初次生殖時(shí)間、總生殖胎數(shù)、體長(zhǎng)和產(chǎn)存活幼溞數(shù)量都存在不同程度的毒性效應(yīng)。與空白對(duì)照組相比，1.80、5.65和10.0 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組能顯著延遲(P<0.05)大型溞的初次生殖時(shí)間，LOEC為1.80 mg·L-1，NOEC為1.02 mg·L-1；10.0 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組親溞始終未產(chǎn)幼溞，數(shù)量為0(P<0.05)，LOEC為10.0 mg·L-1，NOEC為5.65 mg·L-1；5.65 mg·L-1和10.0 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組存活親溞的體長(zhǎng)顯著縮短(P<0.05)，LOEC為5.65 mg·L-1，NOEC為3.19 mg·L-1；所有濃度實(shí)驗(yàn)組所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量均顯著性減少(P<0.05)，NOEC為<1.02 mg·L-1。

產(chǎn)幼溞數(shù)量的減少是所有毒性效應(yīng)中最敏感的指標(biāo)。以大型溞繁殖抑制率計(jì)算EC10為0.830 mg·L-1，95%置信區(qū)間為0.696～5.67 mg·L-1；EC50為7.52 mg·L-1，95%置信區(qū)間為7.45～7.59 mg·L-1。

2.4.2 辣椒素的慢性毒性

各項(xiàng)毒性指標(biāo)結(jié)果如表5所示。1.95、2.65、4.33、5.83和8.06 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的親溞死亡率分別為0%、0%、10%、10%和30%，經(jīng)Cochran-Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)，顯示濃度與親溞死亡率之間有緊密的相關(guān)性，表明辣椒素具有一定的慢性致死效應(yīng)。

表5 辣椒素對(duì)大型溞慢性毒性實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)毒性指標(biāo)結(jié)果匯總Table 5 Summary of all endpoints observed in the chronic test of capsaicin to Daphnia magna

辣椒素對(duì)大型溞的初次生殖時(shí)間、總生殖胎數(shù)、體長(zhǎng)和產(chǎn)存活幼溞數(shù)量都存在不同程度的毒性效應(yīng)。與空白對(duì)照組相比，8.06 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組能顯著延遲(P<0.05)大型溞的初次生殖時(shí)間，LOEC為8.06 mg·L-1，NOEC為5.83 mg·L-1；5.83 mg·L-1和8.06 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組親溞的總生殖胎數(shù)會(huì)顯著減少(P<0.05)，LOEC為5.83 mg·L-1，NOEC為4.33 mg·L-1；4.33、5.83和8.06 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組存活親溞的體長(zhǎng)會(huì)顯著縮短(P<0.05)，LOEC為4.33 mg·L-1，NOEC為2.65 mg·L-1；所有濃度實(shí)驗(yàn)組所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量均顯著性減少(P<0.05)，NOEC為<1.95 mg·L-1。

產(chǎn)幼溞數(shù)量的減少是所有毒性效應(yīng)中最敏感的指標(biāo)。以大型溞繁殖抑制率計(jì)算EC10為1.63 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.10～2.22 mg·L-1；EC50為5.31 mg·L-1，95%置信區(qū)間為4.74～5.74 mg·L-1。

3 討論(Discussion)

敵草隆和辣椒素對(duì)大型溞急性活動(dòng)抑制的48 h-EC50分別為17.1 mg·L-1和12.4 mg·L-1，對(duì)溞類毒性都屬于急性類別3[8]。根據(jù)Wang等[9]的研究，可知辣椒素對(duì)羊角月牙藻的EC50為5.114 mg·L-1，對(duì)斑馬魚LC50為5.98 mg·L-1，說明在藻、溞和魚3個(gè)營(yíng)養(yǎng)水平的生物中，藻類和魚類對(duì)辣椒素的急性毒性更為敏感。有文獻(xiàn)報(bào)道，敵草隆對(duì)月牙藻的96 h-IC50為10.4 μg·L-1[5]，對(duì)近具刺鏈帶藻的72 h-IC50為46.3 μg·L-1[6]，對(duì)蚤狀溞繁殖抑制的7 d-LOEC為7.7 mg·L-1，NOEC為4.0 mg·L-1[4]，對(duì)黑頭呆魚幼魚的10 d-LC50為27.1 mg·L-1[4]，顯示在3個(gè)營(yíng)養(yǎng)水平中，藻類是對(duì)敵草隆最為敏感的物種，與劉亞楠等[1]得出的結(jié)論一致。

大型溞慢性毒性指標(biāo)對(duì)敵草隆和辣椒素的敏感性不完全一致。對(duì)于敵草隆，各指標(biāo)敏感性強(qiáng)弱依次為：幼溞數(shù)量>初次生殖時(shí)間>體長(zhǎng)>總生殖胎數(shù)；對(duì)于辣椒素，各指標(biāo)敏感性強(qiáng)弱依次為：幼溞數(shù)量>體長(zhǎng)>總生殖胎數(shù)>初次生殖時(shí)間；可見，在所有毒性指標(biāo)中產(chǎn)幼溞數(shù)量始終是最敏感的毒性指標(biāo)。蔡小宇等[22]研究壬基酚聚氧乙烯醚對(duì)大型溞的慢性毒性時(shí)，發(fā)現(xiàn)總生殖胎數(shù)是最敏感的毒性指標(biāo)；李娜等[23]研究多氯聯(lián)苯(PCB28)對(duì)大型溞的慢性毒性時(shí)，發(fā)現(xiàn)第一次產(chǎn)卵時(shí)間最為敏感。這可能是由于不同化學(xué)物質(zhì)在生物體內(nèi)的代謝途徑不同，從而導(dǎo)致毒性的癥狀表現(xiàn)不同。

本研究中，敵草隆對(duì)大型溞繁殖抑制的21 d-NOEC<1.02 mg·L-1，低于Nebeker和Schuytema[4]研究得出的對(duì)蚤狀溞的7 d-NOEC(4.0 mg·L-1)，表明敵草隆在低濃度下長(zhǎng)期暴露，仍會(huì)對(duì)水生生物造成危害。Mansano等[24]在研究敵草隆對(duì)新熱帶區(qū)溞類(Ceriodaphniasilvestrii)的慢性毒性中，發(fā)現(xiàn)低濃度(250～2 000 μg·L-1)敵草隆能刺激溞類繁殖，當(dāng)濃度達(dá)到6 000 μg·L-1時(shí)才會(huì)顯著地(P<0.05)抑制繁殖，抑制繁殖的8 d-NOEC為4 000 μg·L-1，8 d-LOEC為6 000 μg·L-1，這與本研究結(jié)果有較大的差異，可能是暴露時(shí)間不同或物種差異造成的。ECx是根據(jù)在暴露時(shí)間內(nèi)的濃度-效應(yīng)曲線，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)計(jì)算獲得的引起x%受試生物產(chǎn)生毒性響應(yīng)的毒物濃度；而NOEC則是假定存在的一個(gè)濃度(或劑量)閾值，毒物低于此閾值即觀察不到顯著毒性效應(yīng)，但是并非所有化學(xué)物質(zhì)的所有毒性終點(diǎn)都存在上述閾值[25]，且不同實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置獲得的該閾值存在差異。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多研究者主張用ECx(如EC10)替代NOEC，用于化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[8,26]。本研究中，基于所產(chǎn)存活幼溞的數(shù)量，計(jì)算敵草隆對(duì)大型溞繁殖抑制的21 d-EC10為0.830 mg·L-1，辣椒素對(duì)大型溞繁殖抑制的21 d-EC10為1.63 mg·L-1。根據(jù)《化學(xué)品分類和標(biāo)簽規(guī)范 第28部分：對(duì)水生環(huán)境的危害》(GB 30000.28—2013)對(duì)慢性毒性的分類標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)考慮到敵草隆在環(huán)境中具有持久性，認(rèn)為敵草隆具有長(zhǎng)期的水生危害，屬于慢性類別2；而對(duì)于辣椒素，由于其具有快速生物降解性，可判定其沒有長(zhǎng)期水生危害，體現(xiàn)了環(huán)境友好性，與Wang等[9]和Oliveira等[15]得出的辣椒素生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)論一致。

OECD 211推薦作為大型溞食物的藻種為小球藻(Chlorellasp.)、羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)和近具刺鏈帶藻(Desmodesmussubspicatus)。本研究中，敵草隆的慢性毒性實(shí)驗(yàn)中以斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)為食物，不屬于推薦藻種種類，但也能滿足大型溞生長(zhǎng)和繁殖的營(yíng)養(yǎng)需求，空白對(duì)照組親溞產(chǎn)存活幼溞數(shù)量的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差為179±7，與熊勤犁等[27]研究中的161±19相近，均能滿足試驗(yàn)有效的要求。