高美琪，林鶴，于娜，劉兆泉，任利翔,*

1. 沈陽(yáng)化工研究院有限公司安全評(píng)價(jià)中心，沈陽(yáng) 110021 2. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016

環(huán)境中的各種化學(xué)物質(zhì)可通過(guò)不同途徑進(jìn)入人體。肝臟作為主要的代謝器官無(wú)疑最易受到損害。如何快速、準(zhǔn)確和多維度地進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)肝臟毒性篩選，對(duì)于化學(xué)品環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)防控具有重要意義。

化學(xué)物質(zhì)可通過(guò)多種作用機(jī)制誘導(dǎo)肝損傷[1-2]，主要包括：破壞鈣離子平衡和細(xì)胞膜損傷、膽汁淤積和膽小管損傷、激活經(jīng)肝藥酶代謝、激活自身免疫、激活細(xì)胞凋亡和線粒體損傷等[3]。事實(shí)上，這些機(jī)制不是完全孤立存在的，細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)對(duì)細(xì)胞的生存極為重要，鈣離子跨膜內(nèi)流會(huì)聚集在線粒體，引起線粒體膜電位降低，進(jìn)而產(chǎn)生大量氧自由基，最后導(dǎo)致線粒體和肝細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[4-5]。

高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時(shí)檢測(cè)被篩化合物對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量與基因、蛋白及其他細(xì)胞成分相關(guān)的信息，確定其生物活性和潛在毒性的過(guò)程。高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)彌補(bǔ)了毒理學(xué)篩選系統(tǒng)在通量、毒性機(jī)制檢測(cè)和潛在毒性揭示等方面的不足，為化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)研究提供了新的有效的技術(shù)。近年來(lái)，高內(nèi)涵能夠?qū)崟r(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體外肝細(xì)胞毒性的多個(gè)參數(shù)、毒理學(xué)相關(guān)機(jī)制，是評(píng)估候選化學(xué)物質(zhì)肝細(xì)胞毒性和預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)肝臟毒性的有效手段[6-7]。根據(jù)肝損傷的發(fā)生機(jī)制，高內(nèi)涵檢測(cè)的熒光探針主要包括：Hoechst 33342、DCFH-DA、MitoTrackerDeep Red FM、mBBr和DIOC6(3)等，它們分別用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞核的損傷、細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平、線粒體膜電位的情況、谷胱甘肽含量和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷程度等[8-9]。

人源肝癌細(xì)胞系HepG2具有正常肝細(xì)胞的很多功能和特點(diǎn)，保留了較完整的生物轉(zhuǎn)化酶體系，敏感性高，與原代肝細(xì)胞及HepRG細(xì)胞相比更為穩(wěn)定、成熟，被認(rèn)為是體外肝細(xì)胞篩選的理想模型之一。而L-02細(xì)胞是人正常肝細(xì)胞系，沒(méi)有癌變細(xì)胞的特征，功能表達(dá)完整，可以傳代培養(yǎng)，已經(jīng)大量應(yīng)用在體外肝毒性篩選過(guò)程中[10]。因此，本研究通過(guò)以HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞為對(duì)象，建立2種肝損傷體外篩選模型，并比較2種細(xì)胞預(yù)測(cè)肝損傷的能力，選出更有優(yōu)勢(shì)的體外篩選模型。

環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的肝損傷是不容忽視的問(wèn)題，且其篩選模型仍然是目前研究的熱點(diǎn)。大多數(shù)篩選模型只以單一參數(shù)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，缺乏準(zhǔn)確性。而目前還沒(méi)有合適的體外篩選模型和篩選方法能夠有效地篩選出具有肝損傷風(fēng)險(xiǎn)的化學(xué)物質(zhì)，所以建立適宜的肝損傷篩選模型尤為重要。本研究選取2種肝細(xì)胞、5種陽(yáng)性藥及3種陰性藥，首先用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)考察不同藥物對(duì)2種細(xì)胞體外的生長(zhǎng)抑制作用，并且采用高內(nèi)涵檢測(cè)法考察2種細(xì)胞預(yù)測(cè)肝損傷的能力，并采用實(shí)時(shí)定量PCR法比較了2種細(xì)胞的藥物代謝酶含量。理論上，可以通過(guò)比較2種細(xì)胞對(duì)陽(yáng)性藥的敏感性、預(yù)測(cè)肝損傷機(jī)制的準(zhǔn)確性以及人體肝藥酶水平的含量選出最適宜的細(xì)胞模型。希望通過(guò)這些研究，可以為環(huán)境中能夠?qū)е赂味拘曰瘜W(xué)成分的發(fā)現(xiàn)和篩選以及其肝損傷機(jī)制的確定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞系為HepG2人源肝癌細(xì)胞系和L-02人源正常肝細(xì)胞系，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要儀器與試劑

鹽酸胺碘酮(99.9%)、鹽酸四環(huán)素(97.5%)、利福平(99.9%)和地塞米松(99.7%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；雙氯芬酸鈉(99.0%)、他莫昔芬(99.0%)和DIOC6(3)(98.0%)熒光探針購(gòu)自aladdin公司；檸檬酸三鈉(99.0%)購(gòu)自西隴化工股份有限公司；抗壞血酸(99.0%)、二甲基亞砜(99.7%)、噻唑藍(lán)(98.0%)和mBBr(99.0%)熒光探針購(gòu)自Sigma公司；Hoechst 33342、DCFH-DA熒光探針和SYBR Green qPCR Mix(2×)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；MitoTrackerDeep Red FM熒光探針購(gòu)自Yeasen公司。

多功能酶標(biāo)儀(Synergy HT，美國(guó)Bio-Tek公司)，高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(CELLINSIGHT CX7，美國(guó)Thermo公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(C 1000TM Thermal Cycler，美國(guó)BIO-RAD公司)，超微量核酸蛋白測(cè)定儀(NANO DROP 2000C，美國(guó)Thermo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT法檢測(cè)不同肝毒性化學(xué)物質(zhì)對(duì)2種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以密度為6 000個(gè)·孔-1接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h。次日，每孔加入不同濃度的受試物溶液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使其最大濃度均為1 000 μmol·L-1(即鹽酸胺碘酮682 mg·L-1，鹽酸四環(huán)素444 mg·L-1，雙氯芬酸鈉296 mg·L-1，利福平823 mg·L-1，他莫昔芬372 mg·L-1，檸檬酸鈉294 mg·L-1，抗壞血酸176 mg·L-1，地塞米松392 mg·L-1)，并依次3倍向下稀釋4個(gè)濃度。然后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用MTT法檢測(cè)各孔吸光度，并計(jì)算各濃度受試物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，用SPSS 20.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.2 高內(nèi)涵檢測(cè)肝毒性機(jī)制相關(guān)參數(shù)的變化

以3種熒光探針的組合方式進(jìn)行高內(nèi)涵試驗(yàn)。分別為Hoechst 33342(藍(lán)色)/DCFH-DA(綠色)/MitoTrackerDeep Red FM(紅色)；Hoechst 33342(藍(lán)色)/DIOC6(3)(綠色)；mBBR(綠色)3種。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5 000 個(gè)·孔-1接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，次日，每孔加入不同濃度的受試物，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。肝毒性陽(yáng)性化學(xué)物質(zhì)(簡(jiǎn)稱陽(yáng)性物)鹽酸胺碘酮、雙氯芬酸鈉、利福平、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬作用的最大濃度均約為IC50值，依次以2倍濃度梯度向下再稀釋4個(gè)濃度。肝毒性陰性化學(xué)物質(zhì)(簡(jiǎn)稱陰性物)檸檬酸三鈉、抗壞血酸和地塞米松的給藥濃度與MTT法相同。然后，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h用于檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，棄去培養(yǎng)板內(nèi)的液體，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一次，棄去PBS后，在96孔板中每孔加入50 μL不同熒光探針混合液，37 ℃避光孵育20 min。孵育結(jié)束后棄去96孔板內(nèi)液體，用PBS清洗一次后每孔再加入50 μL PBS，將96孔板置于高內(nèi)涵儀器中掃板檢測(cè)，得到每個(gè)孔不同參數(shù)的平均熒光強(qiáng)度值，并根據(jù)各個(gè)參數(shù)陰性物與空白對(duì)照組平均熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算出陰性閾。

其中，對(duì)于呈劑量依賴性增加的指標(biāo)，忽略陰性閾的下限，按式(1)計(jì)算陰性閾：

陰性閾=熒光強(qiáng)度比值的平均值+熒光強(qiáng)度

比值的標(biāo)準(zhǔn)差

(1)

對(duì)于呈劑量依賴性減少的指標(biāo)，忽略陰性閾的上限，按式(2)計(jì)算陰性閾：

陰性閾=熒光強(qiáng)度比值的平均值-熒光強(qiáng)度

比值的標(biāo)準(zhǔn)差

(2)

各機(jī)制參數(shù)的精確度、靈敏度和準(zhǔn)確度計(jì)算方法為：

精確度 = (TP + TN)/(TP + TN + FP + FN)

(3)

靈敏度 = TP/(TP + FN)

(4)

特異度 = TN/(TN + FP)

(5)

式中：TP表示與陽(yáng)性物已知肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)變化為陽(yáng)性的個(gè)數(shù)；FP表示與陽(yáng)性物已知肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)變化為陰性的個(gè)數(shù)；TN表示與陰性物已知肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)變化為陰性的個(gè)數(shù)；FN表示與陰性物已知肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)變化為陽(yáng)性的個(gè)數(shù)。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞肝毒性化學(xué)成分的代謝酶mRNA的相對(duì)表達(dá)含量

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以20萬(wàn)個(gè)·孔-1接種于6孔板中，24 h后從CO2培養(yǎng)箱中取出，胰酶消化后離心收集細(xì)胞于離心筒中，用1 mL PBS重懸后轉(zhuǎn)移至無(wú)酶的1.5 mL EP管中，3 000 r·min-1離心10 min后棄去上清。參照說(shuō)明書(shū)操作步驟提取總RNA，核酸測(cè)定儀在波長(zhǎng)260 nm和280 nm測(cè)定吸光度A260和A280，以上述總RNA為模板，參照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的cDNA于-20 ℃保存。

參照說(shuō)明書(shū)設(shè)定PCR程序，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)管。根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算出每個(gè)目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。本研究所用到的引物序列如表1所示。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析與數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)源于至少3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，并表示為mean ± SD，精確度、靈敏度和特異度實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同肝毒性化學(xué)成分對(duì)2種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

通過(guò)MTT法評(píng)價(jià)了8種化合物對(duì)2種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(表2)。結(jié)果表明，5種陽(yáng)性物對(duì)2種細(xì)胞均呈現(xiàn)出不同程度的體外生長(zhǎng)抑制作用，且L-02細(xì)胞的IC50值均不同程度地小于HepG2細(xì)胞。而陰性物并無(wú)抑制作用或者僅有輕度的抑制作用。

2.2 高內(nèi)涵檢測(cè)不同肝毒性的化學(xué)成分對(duì)2種細(xì)胞肝損傷機(jī)制相關(guān)參數(shù)的影響

各陽(yáng)性物以IC50近似值為最大給藥濃度作用于2種細(xì)胞時(shí)，6種與肝毒性機(jī)制相關(guān)的參數(shù)均出現(xiàn)不同程度的變化。高內(nèi)涵檢測(cè)結(jié)果顯示，雙氯芬酸鈉、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬作用于HepG2細(xì)胞時(shí)，均可引起活性氧的大量產(chǎn)生、線粒體膜電位的降低和谷胱甘肽含量的減少。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)一定程度的損傷，細(xì)胞核DNA含量增加，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、固縮，細(xì)胞可能發(fā)生凋亡。而鹽酸胺碘酮作用于HepG2細(xì)胞時(shí)線粒體膜電位沒(méi)有明顯降低，利福平作用于HepG2細(xì)胞時(shí)谷胱甘肽含量沒(méi)有明顯變化。與此同時(shí)，雙氯芬酸鈉、利福平和他莫昔芬作用于L-02細(xì)胞時(shí)，也可引起活性氧的大量產(chǎn)生、線粒體膜電位的降低和谷胱甘肽的減少。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)一定程度的損傷，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、固縮，細(xì)胞可能發(fā)生凋亡。而鹽酸胺碘酮作用于L-02細(xì)胞時(shí)除線粒體膜電位沒(méi)有明顯降低外，細(xì)胞核也沒(méi)有發(fā)生變化，鹽酸四環(huán)素作用于L-02細(xì)胞時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沒(méi)有出現(xiàn)明顯損傷(圖1)。

此外，我們根據(jù)各機(jī)制參數(shù)的陰性閾，得到了陽(yáng)性物每個(gè)機(jī)制參數(shù)的最小中毒濃度(minimum toxic concentration, MTC)，即最初設(shè)置的5個(gè)濃度中超過(guò)陰性域的最小濃度(表3和表4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各陽(yáng)性物作用于2種細(xì)胞時(shí)，MTC結(jié)果與高內(nèi)涵圖片反映出的結(jié)果基本一致。而陰性物作用于2種細(xì)胞時(shí)，各機(jī)制參數(shù)均無(wú)明顯變化。

表1 PCR試驗(yàn)所用的引物序列Table 1 Primers used in real-time PCR

表2 化合物對(duì)2種肝細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)(均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)Table 2 The 50% inhibiting concentration (IC50) of different chemicals in two cell lines (mean ± SD, n=3)

圖1 化合物處理肝細(xì)胞系后的高內(nèi)涵(HCS)分析圖像注：ROS表示活性氧，MMP表示線粒體膜電位，ER表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，GSH表示谷胱甘肽；nuclei-藍(lán)/ROS-綠/MMP-紅，nuclei-藍(lán)/ER-綠，GSH-綠；對(duì)于HepG2細(xì)胞，胺碘酮50 μmol·L-1(34 mg·L-1)，雙氯芬酸鈉150 μmol·L-1(44 mg·L-1)，利福平200 μmol·L-1(165 mg·L-1)，四環(huán)素150 μmol·L-1(67 mg·L-1)，他莫昔芬50 μmol·L-1(19 mg·L-1)；對(duì)于L-02細(xì)胞，胺碘酮20 μmol·L-1(14 mg·L-1)，雙氯芬酸鈉150 μmol·L-1(44 mg·L-1)，利福平150 μmol·L-1(123 mg·L-1)，四環(huán)素150 μmol·L-1(67 mg·L-1)，他莫昔芬20 μmol·L-1(7 mg·L-1)；比例尺為50 μm。Fig. 1 The high content screening (HCS) images were obtained from the same well of cell line treated with five chemicals by using different filters to detectNote: ROS stands for reactive oxygen species; MMP stands for mitochondrial membrane potential; ER stands for endoplasmic reticulum; GSH stands for glutathione; nuclei-blue/ROS-green/MMP-red, nuclei-blue/ER-green, GSH-green; HepG2 cells treated with amiodarone 50 μmol·L-1 (34 mg·L-1), diciofenac sodium 150 μmol·L-1(44 mg·L-1), rifampicin 200 μmol·L-1(165 mg·L-1), tetracycline 150 μmol·L-1 (67 mg·L-1), tomoxifen 50 μmol·L-1(19 mg·L-1); L-02 cells treated with amiodarone 20 μmol·L-1(14 mg·L-1), diciofenac sodium 150 μmol·L-1(44 mg·L-1), rifampicin 150 μmol·L-1(123 mg·L-1), tetracycline 150 μmol·L-1(67 mg·L-1), tomoxifen 20 μmol·L-1(7 mg·L-1); Scale bar = 50 μm.

2.3 不同肝細(xì)胞模型預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷能力的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度均存在顯著性差異，且L-02細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度均顯著高于HepG2細(xì)胞(表5)。這表明L-02細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的能力更強(qiáng)。

表3 高內(nèi)涵檢測(cè)中受試化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的最小毒性濃度(MTC)Table 3 Minimum toxic concentration (MTC) of tested chemicals in HepG2 cells in HCS test

表4 高內(nèi)涵檢測(cè)中受試化合物對(duì)L-02細(xì)胞的MICTable 4 MIC of tested chemicals in L-02 cells in HCS test

表5 2種肝細(xì)胞系在高內(nèi)涵檢測(cè)中的預(yù)測(cè)能力Table 5 Predictive ability of two liver cell lines detected with HCS

2.4 2種肝細(xì)胞的藥物代謝酶mRNA表達(dá)含量比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞相比，L-02細(xì)胞各個(gè)肝毒性化學(xué)成分代謝酶的mRNA表達(dá)水平均顯著增加。其中，L-02細(xì)胞Ⅱ相肝毒性化學(xué)成分代謝酶UGT1A1和GSTA1/2的mRNA表達(dá)含量增加最為顯著，分別約為HepG2細(xì)胞的12倍和9倍。這表明，L-02細(xì)胞相對(duì)于HepG2細(xì)胞高表達(dá)肝毒性化學(xué)成分代謝相關(guān)的酶類，可能與體內(nèi)肝臟代謝水平更加接近(圖2)。

圖2 L-02與HepG2細(xì)胞中代謝酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量(均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)注：*P<0.05、**P<0.01表示與HepG2相比差異顯著。Fig. 2 The relative mRNA expression of metabolizing enzyme in L-02 cells and HepG2 cells (mean ± SD, n=3)Note: *, ** indicate significance at P<0.05 and P<0.01 compared with HepG2 cells.

3 討論(Discussion)

Livertox Database數(shù)據(jù)庫(kù)詳細(xì)介紹了能夠?qū)е赂味拘运幬锏乃幚砘钚?，其在使用時(shí)與肝損傷發(fā)生的因果關(guān)系、導(dǎo)致肝損傷發(fā)生的頻率和肝損傷的機(jī)制及類型等。而本研究所選的陽(yáng)性藥(鹽酸胺碘酮、雙氯芬酸鈉、利福平、鹽酸四環(huán)素和他莫昔芬)均為L(zhǎng)ivertox Database里藥物列表中明確會(huì)導(dǎo)致藥物性肝損傷的藥物，陰性藥(檸檬酸三鈉、抗壞血酸和地塞米松)均為臨床上沒(méi)有與肝損傷相關(guān)的任何報(bào)道的藥物，上述8種藥物分別作為工具化合物用于評(píng)價(jià)篩選體系[11-12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)陰性物作用于2種細(xì)胞時(shí)，2種細(xì)胞均呈現(xiàn)出較低程度的生長(zhǎng)抑制。而當(dāng)陽(yáng)性物作用于2種細(xì)胞時(shí)，2種細(xì)胞均受到不同程度較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。L-02細(xì)胞對(duì)陽(yáng)性物的敏感程度均大于HepG2細(xì)胞，且鹽酸胺碘酮和他莫昔芬這2種陽(yáng)性物作用時(shí)更加明顯，L-02細(xì)胞的敏感性約為HepG2細(xì)胞的2倍以上。本研究的MTT實(shí)驗(yàn)中，3種陰性藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，IC50均>1 000 μmol·L-1，而5種陽(yáng)性藥作用于2種細(xì)胞時(shí)的IC50值與已有文獻(xiàn)報(bào)道雖不完全一致，但均相差不大且在同一數(shù)量級(jí)，此外本研究中的MTT法實(shí)驗(yàn)均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，標(biāo)準(zhǔn)差較小，因此，本研究的MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果是準(zhǔn)確的[10]。根據(jù)MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以初步判斷L-02細(xì)胞可能比HepG2細(xì)胞對(duì)能夠?qū)е赂味拘曰瘜W(xué)成分性肝損傷的化學(xué)成分更敏感。

為了進(jìn)一步比較2種細(xì)胞的預(yù)測(cè)能力，采用了高內(nèi)涵檢測(cè)的方法。大量研究表明，在高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)參數(shù)變化超過(guò)陰性域時(shí)的給藥濃度小于該肝毒性化合物最大血藥濃度(Cmax)的100倍時(shí)，可以認(rèn)為其具有肝毒性[13]。根據(jù)MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)得的各個(gè)陽(yáng)性物的IC50值均在其Cmax的100倍以內(nèi)，因此，在此濃度范圍內(nèi)能夠正確篩出陽(yáng)性物的機(jī)制參數(shù)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)陰性物作用于2種細(xì)胞時(shí)，各參數(shù)的變化情況均小于空白組的20%，根據(jù)陰性物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出了各個(gè)機(jī)制相關(guān)參數(shù)的陰性域，即在陰性域范圍內(nèi)變化為陰性，而在陰性域范圍外變化為陽(yáng)性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)5種陽(yáng)性物作用于2種細(xì)胞時(shí)，除個(gè)別參數(shù)外，各機(jī)制參數(shù)變化時(shí)，整體來(lái)看L-02細(xì)胞的最小中毒濃度較小，說(shuō)明L-02細(xì)胞對(duì)肝毒性機(jī)制的變化更加敏感[14]。為了能更準(zhǔn)確和更直觀地比較2種細(xì)胞模型對(duì)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的預(yù)測(cè)能力，根據(jù)高內(nèi)涵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算并比較了2種細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的精確度、靈敏度和特異度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L-02細(xì)胞的精確度、敏感度和特異度均顯著高于HepG2細(xì)胞，這表明L-02細(xì)胞預(yù)測(cè)肝毒性化學(xué)成分性肝損傷的能力更強(qiáng)。高內(nèi)涵試驗(yàn)可以多端點(diǎn)且準(zhǔn)確地檢測(cè)出肝損傷的機(jī)制。在今后的研究中，筆者會(huì)通過(guò)陽(yáng)性藥和陰性藥的高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定肝損傷的評(píng)分和判定標(biāo)準(zhǔn)，以用來(lái)大規(guī)模篩選出環(huán)境中能夠?qū)е赂螕p傷的化學(xué)物質(zhì)。

肝藥酶的含量也是比較2種細(xì)胞與生理水平接近程度的有效方法，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法評(píng)價(jià)了2種細(xì)胞的肝毒性化學(xué)成分代謝酶在mRNA水平的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L-02細(xì)胞肝毒性化學(xué)成分代謝酶的mRNA表達(dá)水平均不同程度地顯著高于HepG2細(xì)胞。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種細(xì)胞均能正確區(qū)分出能夠?qū)е赂螕p傷的化學(xué)物質(zhì)，且L-02細(xì)胞對(duì)能夠?qū)е赂螕p傷化學(xué)物質(zhì)的敏感性優(yōu)于HepG2細(xì)胞。與HepG2細(xì)胞相比，L-02細(xì)胞預(yù)測(cè)藥物性肝損傷的準(zhǔn)確度、敏感度和特異度更高，且L-02細(xì)胞的肝藥酶含量高于HepG2細(xì)胞。高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)與MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明L-02細(xì)胞更適合作為肝損傷篩選模型，因其能夠?qū)崿F(xiàn)多端點(diǎn)、快速和高通量篩選，所以可以使用單一的高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)作為肝損傷的篩選方法。因此，L-02細(xì)胞結(jié)合高內(nèi)涵可作為預(yù)測(cè)藥物性肝損傷的最佳模型。