葉 晶，李 靜，張?jiān)烂?，黃 萍，王 倩，高志明,2，楊 楠,2,*，NISHINARI Katsuyoshi,2，方亞鵬,2

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品科學(xué)學(xué)院，菲利普斯膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.湖北工業(yè)大學(xué)，湖北省食品膠體國(guó)際合作基地，湖北 武漢 430068）

蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，具有兩親性，因此可以作為乳化劑穩(wěn)定油-水界面。蛋白質(zhì)分子具有多級(jí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熱加工時(shí)，穩(wěn)定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子鍵、疏水相互作用、范德華力以及肽鏈內(nèi)的二硫鍵等分子內(nèi)相互作用會(huì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水基團(tuán)暴露，蛋白分子間發(fā)生聚集，形成聚集體[1-2]。近年來(lái)，關(guān)于蛋白質(zhì)聚集體形成條件和形成機(jī)制受到人們的關(guān)注。如Schmitt等在pH 7條件下85 ℃加熱15 min制備了乳清分離蛋白的蠕蟲狀聚集體，而在pH 6條件下制得更為致密的球狀聚集體[3]。Akkermans等在pH 2條件下，90 ℃加熱β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-lg）5 h后得到纖維狀聚集體[4]。

由于尺寸效應(yīng)及表面結(jié)構(gòu)的差異，蛋白聚集體的界面活性、黏彈性、乳化特性等可能優(yōu)于天然蛋白質(zhì)。如Liu Fu等研究由大豆分離蛋白納米顆粒穩(wěn)定的乳液表現(xiàn)出良好的抗聚結(jié)和穩(wěn)定性[5]。Gao Zhimin等研究發(fā)現(xiàn)β-lg纖維聚集體增強(qiáng)了界面上蛋白分子間的相互作用，能有效提高界面活性[6]。另一方面，蛋白聚集體作為乳化劑在油-水界面形成的蛋白膜結(jié)構(gòu)和流變學(xué)特性會(huì)影響脂肪消化特性。蛋白膜的交聯(lián)程度和黏彈性會(huì)影響小分子乳化劑如膽鹽對(duì)界面蛋白的取代，即當(dāng)油-水界面形成了強(qiáng)烈交聯(lián)蛋白質(zhì)膜時(shí)，小分子可能很難對(duì)其發(fā)生取代，從而影響脂肪的消化[7]。Patino等總結(jié)了關(guān)于β-酪蛋白、酪蛋白酸鹽和β-lg在氣-水界面的吸附行為和被單甘酯的取代行為，發(fā)現(xiàn)不同的蛋白質(zhì)顯示出不同的界面結(jié)構(gòu)，從而影響消化結(jié)果[8]。但是目前對(duì)蛋白聚集體對(duì)脂肪消化的影響研究鮮有報(bào)道。

對(duì)于蛋白膜結(jié)構(gòu)和流變學(xué)特性的研究方法主要包括原子力顯微鏡、界面剪切流變學(xué)、界面膨脹流變學(xué)等。如Morris課題組對(duì)小分子表面活性劑取代界面處蛋白進(jìn)行了大量的研究，利用原子力顯微鏡研究β-酪蛋白和β-lg界面在氣-水界面被吐溫20取代[9]，十二烷基硫酸鈉對(duì)β-lg取代[10]，以及通過模擬生理環(huán)境，研究膽鹽對(duì)界面處β-lg的取代過程和結(jié)構(gòu)變化[11]。Wang Lijun等利用Du Noüy環(huán)流變?cè)O(shè)備研究發(fā)現(xiàn)蠶絲蛋白在氣-水界面形成的蛋白膜比油-水界面更脆弱，且蛋白質(zhì)的界面模量可能受到溶劑極性的強(qiáng)烈影響[12]。Cicuta等利用相互成直角的Wilhelmy板測(cè)定β-lg和β-酪蛋白在空氣-水界面處的表面壓力和總黏彈性[13]。Seta等利用界面張力儀測(cè)定β-lg在不同界面的膨脹流變學(xué)信息，發(fā)現(xiàn)β-lg在氣-水界面的黏彈性大于在向日葵油-水界面的黏彈性[14]。但由于界面蛋白吸附是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，形成的蛋白膜結(jié)構(gòu)較弱且不均一，上述傳統(tǒng)研究方法或很難實(shí)現(xiàn)原位測(cè)量，或難以給出局部信息。而微流變學(xué)作為一種新興的技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)原位測(cè)量，并具有高敏感度[15]。Lee等利用粒子追蹤微流變學(xué)技術(shù)研究了β-lg在油-水及氣-水界面上的吸附及成膜過程，給出了這一過程更詳細(xì)的信息[16-17]。Jordens等利用粒子追蹤手段研究了具有較高長(zhǎng)徑比的β-lg纖維在低pH值（pH 2、3）下的界面性質(zhì)，揭示了纖維狀聚集體形成高彈性界面的特征[18]。但到目前為止，利用界面微流變學(xué)系統(tǒng)研究不同蛋白聚集體界面行為的工作較少，并且聚集體對(duì)消化影響的研究更鮮見。本實(shí)驗(yàn)主要利用示蹤粒子微流變學(xué)，結(jié)合膨脹流變學(xué)方法，研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的β-lg及其聚集體在中性pH值條件下的油-水界面吸附和被膽鹽小分子替代的行為，旨在通過對(duì)比納米顆粒聚集體（β-lg NP）和纖維狀聚集體（β-lg F）的界面吸附和替代過程，揭示蛋白聚集體的界面活性和抵抗膽鹽取代能力，進(jìn)而闡明蛋白質(zhì)聚集體對(duì)乳化和乳液脂肪消化可能產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-lg（純度90%、分子質(zhì)量為18.4 kDa） 美國(guó)Davis公司；癸烷（純度99%） 上海麥克林公司；膽鹽（純度90%以上） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；直徑為（1.0±0.2）μm的熒光微球 美國(guó)賽默飛公司；NOA61型紫外固化膠 美國(guó)Thorlabs公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-2100型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本電子株式會(huì)社；IX72型熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Teclis Tracker型界面流變儀 法國(guó)Lyon公司；907 Titrino型全自動(dòng)電位滴定儀瑞士萬(wàn)通有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白聚集體的制備

將β-lg粉末溶解于超純水中分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和2%的蛋白溶液，在4 ℃條件下過夜溶解，待用。在pH 5.8下，將1%的β-lg溶液于85 ℃加熱15 min后，冰浴冷卻[19]。冷卻后經(jīng)50 kDa透析袋透析72 h，得到蛋白溶液進(jìn)行凍干，制得β-lg NP。在pH 2條件下，將2%的β-lg溶液，經(jīng)攪拌后于80 ℃加熱16 h后，冰浴冷卻[20]。冷卻后通過100 kDa透析袋透析72 h后凍干，制得β-lg F。低pH值制備纖維聚集體過程中，通常認(rèn)為蛋白先解聚形成分子質(zhì)量更小的多肽，多肽再進(jìn)一步聚集形成纖維體。利用透析方法可以將在此過程中產(chǎn)生的未發(fā)生轉(zhuǎn)化的肽段去除。

以下實(shí)驗(yàn)中，如未指明，則β-lg及其凍干后聚集體樣品均用pH 7的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進(jìn)行分散溶解。

1.3.2 透射電子顯微鏡表征

分別將β-lg粉末和制備的β-lg NP、β-lg F溶液及凍干后聚集體樣品，溶解于pH 7的PBS中至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%。利用TEM觀察其形貌。β-lg F的長(zhǎng)徑比則由Fiber Application程序統(tǒng)計(jì)TEM圖所得[21]。

1.3.3 粒子追蹤微流變學(xué)分析

蛋白吸附階段實(shí)驗(yàn)中所用樣品槽參照文獻(xiàn)[16]制作，其具有相同內(nèi)徑（12 mm）的特氟龍環(huán)（高度為2.5 mm）嵌于金屬鋁環(huán)上部（高度為4 mm），以在高度為1.5 mm處形成一個(gè)平穩(wěn)的油-水界面。金屬環(huán)底部與載玻片黏合密封。在實(shí)驗(yàn)過程中，上部用蓋玻片和絕緣硅脂密封，防止樣品揮發(fā)。

將直徑為1 μm的熒光聚苯乙烯微球分散在體積比為7∶3的水-異丙醇溶液中，體積分?jǐn)?shù)約為0.005%。熒光微球的激發(fā)波長(zhǎng)542 nm、發(fā)射波長(zhǎng)612 nm。β-lg、β-lg NP和β-lg F溶液由pH 7的PBS配制，質(zhì)量濃度分別為25、110、220 μg/mL。

在蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)中：將適量蛋白溶液注入環(huán)內(nèi)，使液面在特氟龍環(huán)與金屬環(huán)交接處；再向界面上緩慢添加6 μL含有熒光粒子的分散液；最后再向界面上添加約200 μL的癸烷。在環(huán)上蓋上蓋玻片，并用絕緣硅脂進(jìn)行密封。利用IX72熒光顯微鏡對(duì)界面上熒光粒子的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行觀察。在40 倍物鏡下，控制視野中有50～200 個(gè)熒光微粒，保證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)性且示蹤粒子之間沒有相互作用[22]。

在膽鹽取代界面蛋白實(shí)驗(yàn)中：為添加膽鹽，對(duì)樣品槽進(jìn)行改進(jìn)，在內(nèi)環(huán)外加一個(gè)金屬鋁環(huán)，并在內(nèi)環(huán)底部墊上玻璃隔片，形成液體通道，使內(nèi)環(huán)外環(huán)體相液體聯(lián)通。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)完成吸附后，膽鹽溶液注射至外環(huán)底部，再通過通道擴(kuò)散至界面，與蛋白膜發(fā)生相互作用。由于較高膽鹽質(zhì)量濃度會(huì)引起界面處較大波動(dòng)，對(duì)微流變數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生較大影響，所以膽鹽終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。另外，低質(zhì)量濃度膽鹽可以減慢膽鹽取代界面蛋白的過程，利于觀察。

數(shù)據(jù)采集：槽內(nèi)樣品界面穩(wěn)定后，熒光粒子的運(yùn)動(dòng)由CMOS高速相機(jī)采集記錄，拍攝幀速率為15 張/s，拍攝時(shí)長(zhǎng)為30 s，實(shí)驗(yàn)溫度為（25±2）℃。被記錄下來(lái)的圖像用Matlab程序進(jìn)行處理及數(shù)據(jù)分析[23]。通過分析圖片中的光學(xué)中心確定熒光粒子位置，對(duì)比多張連續(xù)圖片，從而得到界面上示蹤粒子隨時(shí)間的二維運(yùn)動(dòng)軌跡及均方位移（mean squared displacement，MSD）（用Δr2（τ）表示，單位為μm2），具體算法參見式（1）[24]。

式中：x、y分別為示蹤粒子在不同時(shí)間圖片中的位置；t為實(shí)際時(shí)間/s；τ為間隔時(shí)間/s。示蹤粒子的整體漂移通過計(jì)算粒子的平均速率消去。＜>表示對(duì)所有粒子的遲滯時(shí)間平均值。本實(shí)驗(yàn)中0.06 s＜τ＜30 s。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了固定不動(dòng)粒子的MSD以得到儀器的誤差，約為0.001 μm2。

1.3.4 界面流變學(xué)測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)的界面流變學(xué)測(cè)定選用懸滴法，利用界面流變儀分別測(cè)定了癸烷-水界面上蛋白吸附過程中界面壓π變化（π＝γ0-γ，γ0和γ分別為無(wú)蛋白和有蛋白吸附時(shí)油-水界面張力）以及膨脹模量E（E＝Δγ/（ΔA/A0），Δγ為懸滴界面張力變化，A0為懸滴初始表面積，ΔA為懸滴表面積變化）。本實(shí)驗(yàn)中體相為蛋白或蛋白聚集體溶液，油相為癸烷。實(shí)驗(yàn)采用振蕩模式，實(shí)驗(yàn)中控制油滴體積為14 μL，控制油滴表面積，振幅變化（ΔA/A0）為10%，振蕩頻率為0.05 Hz。實(shí)驗(yàn)溫度為（25±2）℃。

1.3.5 乳液脂肪體外消化模型

利用Tris-HCl緩沖溶液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蛋白溶液。取一定量蛋白溶液，添加中鏈甘油三酯，使蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，中鏈甘油三酯終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、20%。利用高速剪切機(jī)進(jìn)行乳化（20 000 r/min、2 min），制備得到不同含油量的蛋白乳液。

通過模擬體外小腸環(huán)境進(jìn)行乳液脂肪消化研究。乳液用pH 7.0的Tris-HCl緩沖液稀釋，使油相終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，微調(diào)pH值至7.0。取31 mL，37 ℃水浴振蕩30 min，添加1.5 mL NaCl（5.625 mg/mL）、1 mL CaCl2（83.25 mg/mL）、2 mL膽鹽（93.75 mg/mL）、2 mL胰脂肪酶（30 mg/mL）（以上溶液均用Tris-HCl緩沖液配制）。最終模擬腸液體積為37.5 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0。利用pH-stat全自動(dòng)電位滴定儀進(jìn)行體外消化實(shí)驗(yàn)，按式（2）計(jì)算游離脂肪酸的釋放率，從而評(píng)價(jià)小腸中脂肪消化的程度[25]。

式中：VNaOH為中和游離脂肪酸所消耗的NaOH體積/L；cNaOH為所用的NaOH的濃度/（mol/L）；Mlipid為中鏈甘油三酯摩爾質(zhì)量（500 g/mol）；mlipid為消化液中脂肪的總質(zhì)量（150 mg）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本實(shí)驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果采用3 次測(cè)量取平均值的方法，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 8.0、MATLAB 2016、Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白聚集體形貌

蛋白質(zhì)溶液在加熱過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，這一過程導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間可發(fā)生相互作用，形成低聚物。當(dāng)?shù)途垠w濃度超過一定濃度時(shí)，形成相對(duì)分散的初級(jí)聚集體。蛋白濃度越小、pH值越高，形成初級(jí)聚集體的粒徑越小。如在pH 6時(shí)，可形成水力學(xué)半徑約為150 nm近似球體的β-lg初級(jí)聚集物[3]。通過前期實(shí)驗(yàn)對(duì)不同pH值下的熱處理蛋白質(zhì)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)pH 5.8條件下得到的納米顆粒大小最為均一，且粒度較小，因此后期實(shí)驗(yàn)均使用在pH 5.8下制得納米顆粒聚集體。圖1A1、B1分別為β-lg及β-lg NP凍干后樣品復(fù)溶的TEM結(jié)果。結(jié)合水合粒徑分布圖（圖1A2、B2），可知β-lg為球狀，粒徑為（4.3±1.0）nm；而β-lg NP粒徑在（160±10）nm左右，且單分散性良好，與文獻(xiàn)[26]報(bào)道一致。

在低pH值下，對(duì)蛋白分子進(jìn)行熱處理，一般認(rèn)為蛋白分子先水解為多肽，多肽再形成不同的次級(jí)結(jié)構(gòu)（β-折疊），這些次級(jí)結(jié)構(gòu)通過分子間相互作用組裝形成纖維狀聚集體[20]。所以可以通過控制pH值和溫度來(lái)制備纖維狀聚集體。圖1C1、D1為β-lg F凍干前后TEM圖，利用Fiber App軟件對(duì)β-lg F凍干前后的纖維長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1C2、D2所示，凍干前，纖維長(zhǎng)度分布為1 400～2 500 nm；而凍干后長(zhǎng)度分布在100～700 nm之間，與凍干前相比，纖維長(zhǎng)度明顯減小。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是凍干及其過程中的物理處理使蛋白質(zhì)變得脆而易斷導(dǎo)致[27]。通過前期實(shí)驗(yàn)對(duì)表面疏水性和表面電性測(cè)定[28]，發(fā)現(xiàn)凍干前后表面性質(zhì)無(wú)明顯差異，因此為精確控制蛋白溶液濃度，本實(shí)驗(yàn)中所用聚集體均為凍干后樣品。

圖 1 TEM圖及粒徑分布Fig. 1 Transmission electron microscope images and particle size distribution

2.2 蛋白聚集體的界面吸附

2.2.1 示蹤粒子微流變學(xué)分析結(jié)果

在界面流變學(xué)研究中，在無(wú)蛋白的液-液界面上，示蹤粒子在界面上的擴(kuò)散系數(shù)D可以由改進(jìn)的Stokes-Einstein方程（式（3））來(lái)描述[23]。

式中：kB為玻爾茲曼常數(shù)/（J/K）；T為絕對(duì)溫度/℃；η1和η1分別為上相和下相的黏度/（mPa·s）；R為粒子半徑/m；θ為粒子在油-水界面相對(duì)下相的接觸角/（°）；f（θ表示擴(kuò)散系數(shù)取決于上下兩相的黏度比和示蹤粒子在界面上的接觸角θ。實(shí)驗(yàn)中所用癸烷的黏度約為0.92 mPa·s，而所用蛋白緩沖液的黏度約為0.95 mPa·s，因此上相和下相對(duì)于粒子在界面上的黏度貢獻(xiàn)可以認(rèn)為相互抵消。同時(shí)根據(jù)前人測(cè)量的結(jié)果，聚苯乙烯熒光微球在癸烷-水界面上的接觸角為90°[22]，因此式中θ的影響被消除，公式（3）化簡(jiǎn)為標(biāo)準(zhǔn)的Stokes-Einstein方程（式（4））。

式中：η為蛋白溶液的黏度/（mPa·s）。此時(shí)界面示蹤粒子的運(yùn)動(dòng)為布朗擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，MSD可以從式（5）獲得。

式中：τ表示擴(kuò)散間隔時(shí)間/s。因此可以根據(jù)示蹤粒子的運(yùn)動(dòng)計(jì)算得到無(wú)蛋白界面的擴(kuò)散系數(shù)，從而得到下相黏度。采用1.3.3節(jié)的裝置和加樣方式測(cè)量了癸烷-水界面上示蹤粒子的運(yùn)動(dòng)，得到擴(kuò)散系數(shù)D0為0.566 μm2/s，相應(yīng)的水相的黏度為0.771 mPa·s。測(cè)得的黏度略高于25 ℃純水黏度，可能是由于粒子示蹤實(shí)驗(yàn)中激光使得樣品略加熱。測(cè)量值在誤差范圍內(nèi)，證明了方法的可行性。

圖 2 質(zhì)量濃度均為110 μg/mL的不同形態(tài)蛋白聚集體在油-水界面吸附過程中示蹤粒子的MSD曲線Fig. 2 MSD of tracer particles at the decane-water interface during the adsorption of proteins or protein aggregates at a concentration of 110 μg/mL

圖2為110 μg/mL的β-lg、β-lg NP、β-lg F在油-水界面吸附過程中示蹤粒子的MSD曲線?？梢钥闯?，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，各樣品MSD減小。對(duì)于不同流動(dòng)行為，MSD與時(shí)間可以表示為冪指數(shù)關(guān)系，即＜Δr2（t）>＝4Dτa，a為冪指數(shù)。在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)中，MSD與時(shí)間關(guān)系曲線的斜率即為a。如果a等于1，即MSD隨時(shí)間線性變化，說明粒子在牛頓流體中運(yùn)動(dòng)，處于自由擴(kuò)散；如果a＜1，表明粒子在具有黏彈性的物質(zhì)中運(yùn)動(dòng)，處于亞擴(kuò)散狀態(tài)。當(dāng)a趨近于0時(shí)，粒子被束縛在黏彈性較強(qiáng)的物質(zhì)中，此時(shí)粒子的運(yùn)動(dòng)被嚴(yán)重限制，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，MSD幾乎是一個(gè)常數(shù)。本實(shí)驗(yàn)計(jì)算了不同質(zhì)量濃度的β-lg、β-lg NP、β-lg F在不同吸附時(shí)間時(shí)油-水界面上示蹤粒子MSD對(duì)時(shí)間的冪指數(shù)a（圖3）。

由圖3可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)不同蛋白，a均減小，但不同形態(tài)蛋白降低快慢不同。如圖3A所示，25 μg/mL下，對(duì)于β-lg界面，10 min時(shí)，a約為0.95左右，到50 min時(shí)，a約為0.75左右，示蹤粒子運(yùn)動(dòng)被一定程度的限制；但對(duì)β-lg F界面，10 min時(shí)，a約為0.85，與β-lg接近，但50 min時(shí)，a約為0，示蹤粒子運(yùn)動(dòng)被強(qiáng)烈限制；而對(duì)于β-lg NP界面，5 min時(shí)，a已經(jīng)下降為0.56左右，30 min時(shí)a約為0。說明β-lg NP界面上示蹤粒子的運(yùn)動(dòng)在蛋白吸附的初期就被限制，界面很快形成。這些結(jié)果說明不同形態(tài)的蛋白聚集體向界面擴(kuò)散的速度不同，聚集體吸附速度快于β-lg，且β-lg NP最快。110 μg/mL和220 μg/mL蛋白聚集體同樣顯示出類似規(guī)律（圖3B、C）。對(duì)于同一種蛋白，蛋白質(zhì)量濃度越高，界面上示蹤粒子的a下降越快，運(yùn)動(dòng)被限制得越明顯，如β-lg在220 μg/mL下，40 min時(shí)，a為0，說明粒子運(yùn)動(dòng)被完全限制。通過公式可以計(jì)算出當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在油-水界面吸附成膜后蛋白膜的彈性模量（Gf）[17]。根據(jù)總MSD最后出現(xiàn)的平臺(tái)值，計(jì)算得到220 μg/mLβ-lg的Gf為6.4×10-5mN/m（25、110 μg/mLβ-lg均未出現(xiàn)MSD平臺(tái)值），以及25、110、220 μg/mL的β-lgNP的Gf分別為7.7×10-5、8.2×10-5、8.5×10-5mN/m，β-lg F的Gf分別為1.3×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mN/m。

圖 3 蛋白聚集體在油-水界面吸附過程中對(duì)數(shù)坐標(biāo)中MSD斜率a隨時(shí)間的變化Fig. 3 Change in the MSD’s slope in logarithmic coordinates during the adsorption process

2.2.2 界面膨脹流變學(xué)分析結(jié)果

圖 4 不同質(zhì)量濃度不同形態(tài)蛋白向界面吸附的界面壓及膨脹模量Fig. 4 Change in surface pressure with time and change in dilation module with surface pressure during protein adsorption

圖4為不同質(zhì)量濃度β-lg及聚集體β-lg NP和β-lg F向界面擴(kuò)散過程中，界面壓（π）及界面膨脹模量（E）的變化?？梢钥闯鲈谒疾斓? 個(gè)質(zhì)量濃度下，界面壓均隨時(shí)間延長(zhǎng)快速增加，說明蛋白均向界面擴(kuò)散。但不同質(zhì)量濃度不同形態(tài)蛋白界面壓強(qiáng)和膨脹模量變化不同。圖5A、B分別為不同質(zhì)量濃度的3 種形態(tài)蛋白的平衡后界面壓及膨脹模量數(shù)值。從圖5A可以看出，對(duì)于同種蛋白，隨著質(zhì)量濃度的增加，平衡后的界面壓均增大；對(duì)于在相同質(zhì)量濃度下的不同蛋白，β-lg F的界面壓最大，其次是β-lg NP。從圖5B可以看出，隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，界面蛋白膜的膨脹模量即黏彈性也隨之增加；在相同質(zhì)量濃度下，β-lg F的界面膜黏彈性最大，其次是β-lg NP，而β-lg的模量最小。

圖 5 不同質(zhì)量濃度不同形態(tài)蛋白平衡后界面壓值及平衡后膨脹模量Fig. 5 Surface pressure values and dilation modulus after adsorption equilibrium for different β-lg protein aggregates at different concentrations

2.3 膽鹽對(duì)界面蛋白的取代

2.3.1 示蹤粒子微流變學(xué)結(jié)果

圖 6 不同質(zhì)量濃度蛋白及聚集體被膽鹽取代過程中界面上示蹤粒子整體平均MSD隨時(shí)間的變化Fig. 6 MSDs of tracer particles at the decane-water interface during displacement of proteins by bile salts

圖6分別為β-lg、β-lg NP、β-lg F在25、110、220 μg/mL下被膽鹽取代過程中界面上示蹤粒子整體平均MSD。在每個(gè)質(zhì)量濃度下，隨著膽鹽取代時(shí)間的延長(zhǎng)，MSD及其斜率a均逐漸增加，說明示蹤粒子的運(yùn)動(dòng)限制逐漸緩解，原因可能是膽鹽逐漸取代界面處蛋白，界面蛋白膜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸打開。對(duì)于同一種蛋白，隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，MSD的斜率a變化減慢：如膽鹽取代25 μg/mL的β-lg達(dá)到55 min時(shí)，a接近1；而膽鹽取代110 μg/mLβ-lg達(dá)到60 min時(shí)，a約等于0.87；膽鹽取代220 μg/mLβ-lg達(dá)到65 min時(shí)，a僅約等于0.56。這說明隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，膽鹽取代界面蛋白的程度降低，蛋白界面膜仍保持一定的結(jié)構(gòu)，示蹤粒子的運(yùn)動(dòng)仍受到限制。

圖6B1～B3為β-lg NP被膽鹽取代的過程?？梢钥闯?，雖然膽鹽對(duì)25 μg/mLβ-lg NP進(jìn)行取代后，MSD的斜率a隨著膽鹽取代時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變大，但相比于β-lg的a??；而110 μg/mL及220 μg/mL下，a變化不明顯，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過程中均接近0，說明膽鹽取代過程慢，甚至被抑制。

圖6 C1～C3是β-l g F 被膽鹽取代的過程。在25 μg/mL下，MSD的a隨取代時(shí)間延長(zhǎng)而增大，最終斜率也為1，但是MSD較β-lg小一個(gè)量級(jí)。隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，MSD的斜率a變化減慢，但最終斜率比β-lg的更小。

由上述結(jié)果可以看出，蛋白聚集體形成的界面比β-lg更難被膽鹽取代，其中β-lg NP抗膽鹽取代能力最強(qiáng)。原因可能是膽鹽與蛋白及其聚集體在pH 7條件下都帶負(fù)電荷，其中β-lg NP電荷量最大。當(dāng)膽鹽吸附至界面時(shí)，β-lg與β-lg NP蛋白分子之間存在較強(qiáng)的靜電相互斥力，這也有可能減緩膽鹽向界面吸附的速度。另外，球形顆粒狀物質(zhì)在界面有較高的能壘[29]，因此從界面脫附很困難，這也抑制了膽鹽的取代。

2.3.2 界面膨脹流變學(xué)分析結(jié)果

圖7為不同質(zhì)量濃度的β-lg、β-lg NP、β-lg F被膽鹽取代后油-水界面壓（π）的增加量（Δπ）及界面膨脹模量的減少量（ΔE）。圖7A、B中，隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，對(duì)不同蛋白界面均有Δπ降低，ΔE減小；對(duì)比β-lg、β-lg NP、β-lg F，發(fā)現(xiàn)相同質(zhì)量濃度下β-lg NP的Δπ最大，ΔE最小，而β-lg的ΔE最大的是β-lg。說明在相同的膽鹽質(zhì)量濃度下，隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，膽鹽取代能力降低。綜上，β-lg NP抵抗膽鹽取代能力最強(qiáng)，其次是β-lg F，β-lg最弱。產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是因?yàn)榫奂w疏水性較強(qiáng)形成的界面膜強(qiáng)度較大，抵抗膽鹽取代能力較β-lg強(qiáng)。β-lg NP抵抗膽鹽取代能力最強(qiáng)是因?yàn)棣?lg NP被取代需要更大的自由能（ΔG）。經(jīng)計(jì)算，得到β-lg NP的ΔG大約為830 kJ，β-lg F的ΔG大約為658 kJ[30]。

圖 7 不同濃度蛋白被膽鹽取代過程中界面壓的增加量和膨脹模量的減少量Fig. 7 Increase in interfacial pressure and decrease in dilation modulus for different β-lg protein aggregates during bile salt displacement process

2.4 不同聚集形態(tài)蛋白質(zhì)乳液的消化動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

圖 8 不同聚集形態(tài)蛋白質(zhì)乳液脂肪消化過程中脂肪酸釋放率變化Fig. 8 Free fatty acid release rate from emulsions stabilized by different β-lg protein aggregates during in vitro digestion

圖8A、B、C分別為1%、5%、10%含油量條件下，不同形態(tài)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液在模擬腸道消化過程中脂肪酸的釋放率。從圖8中均可以看出，在模擬脂肪消化中，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種蛋白質(zhì)乳液的脂肪酸釋放率逐漸增大。在相同含油量條件下，β-lg聚集體乳液體系脂肪消化速率低于天然蛋白乳液，其中β-lg NP乳液的脂肪消化速率最低。在脂肪消化過程中，膽鹽與界面處蛋白質(zhì)相結(jié)合，降低膽鹽活動(dòng)能力，進(jìn)而影響脂肪消化速率。所以可以看出，在相同含油量的條件下，抗膽鹽取代能力依次為β-lg NP＞β-lg F＞β-lg，與微流變實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)通過對(duì)不同形態(tài)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液的穩(wěn)定性分析（結(jié)果此處未展示），發(fā)現(xiàn)蛋白聚集體乳液的穩(wěn)定性較天然蛋白更強(qiáng)，這與微流變測(cè)得的模量和界面流變學(xué)測(cè)得的模量大小趨勢(shì)也一致。

3 結(jié) 論

蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)吸附過程的瞬時(shí)信息捕捉存在一定困難，本實(shí)驗(yàn)利用示蹤粒子微流變學(xué)觀察到3 種形態(tài)蛋白質(zhì)在油-水界面的實(shí)時(shí)微觀流變信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）3 種形態(tài)的蛋白質(zhì)均可以向界面吸附，形成具有一定黏彈性的界面膜，且吸附成膜是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程；2）蛋白聚集體呈現(xiàn)出較強(qiáng)的界面活性，其在油-水界面吸附過程比β-lg快，β-lg NP吸附速度最快；3）蛋白聚集體形成的界面蛋白膜具有更強(qiáng)的黏彈性；4）β-lg NP抵抗膽鹽取代能力最強(qiáng)，其次是β-lg F，β-lg最弱。微觀流變學(xué)觀察到的結(jié)果與膨脹流變學(xué)以及體外消化結(jié)果一致，說明了蛋白質(zhì)聚集體在界面活性以及控制油脂消化方面的優(yōu)勢(shì)。