王 晶，樊亞東，王立新，王 麗*

（1.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192； 2.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617）

抗纖丸是天津市第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，由血府逐瘀湯加減化裁而來，具有活血化瘀和扶正祛邪之功，臨床用于治療慢性活動性肝炎、肝纖維化及肝硬化已近50年。自上世紀90年代開始，課題組經(jīng)過多年的藥理和臨床研究證實［1，2］，抗纖丸具有減輕肝細胞炎癥反應、調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子、降解各型膠原基質(zhì)等多種抗肝纖維化的作用，藥用價值和安全性較為肯定。

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導致肝臟中細胞外基質(zhì)的過度積累，纖維性瘢痕形成的病理過程。早期肝纖維化經(jīng)過及時干預治療，可減緩或防止進展為肝硬化甚至肝癌［3］。目前大量研究表明：相較于化學藥物，中藥具有多靶點、多途徑、

多層次的藥理作用優(yōu)勢，能夠整體系統(tǒng)地抑制肝纖維化的進展［4］。中藥復方抗纖丸成分復雜，針對其治療肝纖維化的活性成分、作用靶點和作用途徑仍不明確，尚待深入。網(wǎng)絡(luò)藥理學基于網(wǎng)絡(luò)生物學和多向藥理學，尤其適合揭示中醫(yī)藥的復雜作用機制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，初步探索和闡述抗纖丸治療肝纖維化的藥理學機制，為其在臨床的使用提供理論依據(jù)，為進一步的藥物研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫和分析軟件 中藥分子作用機制網(wǎng)絡(luò)分析工具（Batman-TCM）（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/） 數(shù)據(jù)庫；OMIM 疾病數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org）；Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://www.Drugbank.ca/）；Uniport數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）；網(wǎng)絡(luò)圖像可視化軟件Cytosca pe3.4.0軟件（https://cytoscape.org/）;Metascape網(wǎng)絡(luò)分析平臺（metascape.org/gp/index）；BioGPS數(shù)據(jù)庫（http://biogps.org/）；Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）。

1.2 方法

1.2.1 抗纖丸化學成分與靶點挖掘 通過Batman-TCM數(shù)據(jù)庫挖掘抗纖丸（當歸、川芎、赤芍、鱉甲、川楝子、黃芩、太子參、白花蛇舌草、黃芪、五味子、冬蟲夏草和甘草）單味中藥的化學成分。設(shè)置化合物靶點預測的閾值（score cutoff＞20）篩選抗纖丸單味藥的潛在蛋白靶點。

1.2.2 肝纖維化相關(guān)靶點獲取 以“hepatic fibrosis”和“l(fā)iver fibrosis”為檢索詞，分別通過OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫獲取肝纖維化相關(guān)靶點。使用Uniport數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，對蛋白進行名稱規(guī)范轉(zhuǎn)化操作。

1.2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選將“1.2.1”和“1.2.2”項中得到的靶點進行比對，篩選重復靶點，并導入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。選取分值＞0.9分的高置信度區(qū)間，并根據(jù)自由度值（一個節(jié)點在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中與該點直接作用的節(jié)點的數(shù)目，自由度越大則其參與的生物功能越多）篩選關(guān)鍵靶點。

1.2.4 抗纖丸中藥-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將抗纖丸單味藥、化合物成分、關(guān)鍵作用靶點信息導入Cytoscape 3.4.0軟件繪制中藥-成分、成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖。采用Merge功能最終建立中藥-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 基因功能與通路分析 為進一步研究抗纖丸治療肝纖維化的作用情況，使用Metascape平臺對肝纖維化和抗纖丸相關(guān)靶點進行總體分析。將抗纖丸治療肝纖維化的關(guān)鍵作用靶點，進行KEGG代謝通路富集分析和GO生物過程富集分析。同時將關(guān)鍵作用靶點分別導入BioGPS和Genecards數(shù)據(jù)庫中獲得組織分布和亞細胞分布相關(guān)信息，并作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 抗纖丸作用化合物及靶點 檢索數(shù)據(jù)庫得到抗纖丸化合物及相關(guān)靶點數(shù)，見表1。刪除重復數(shù)據(jù)，獲得抗纖丸作用化合物共577個，涉及相關(guān)作用靶點1 788個。

2.2 肝纖維化相關(guān)靶點 在OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫中分別找到肝纖維化相關(guān)靶點536和297個，去除重復基因，共得到632個疾病靶點。

2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選 將抗纖丸作用靶點與肝纖維化靶點進行比較，查找抗纖丸治療疾病的作用靶點共計194個。為篩選出關(guān)鍵作用靶點，將194個蛋白導入SERING平臺進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化，見圖1。根據(jù)自由度篩選得到55個關(guān)鍵作用靶點，見表2。

表1 抗纖丸化合物成分和靶點情況

表2 55個關(guān)鍵作用靶點自由度

圖1 抗纖丸作用靶點蛋白互作關(guān)系

2.4 構(gòu)建抗纖丸中藥-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò) 將抗纖丸12味中藥、涉及的213個化合物成分和55個關(guān)鍵靶點信息導入Cytoscape軟件繪制中藥-成分、成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖。采用Merge功能合并網(wǎng)絡(luò)，對單味中藥、成分和靶點進行標識。如圖2所示，共涉及280個節(jié)點和564條邊。節(jié)點表示單味中藥、成分和疾病靶點，邊表示三者彼此間的關(guān)聯(lián)。其中六邊形節(jié)點表示單味中藥，三角形節(jié)點表示化合物成分，圓形節(jié)點表示關(guān)鍵靶點。

圖2 抗纖丸中藥-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 基因功能與通路分析 將1 788個抗纖丸治療相關(guān)靶點和632個肝纖維化相關(guān)靶點分別導入Metascape平臺，使用最新版本數(shù)據(jù)庫（最后更新時間為2019-09-14）轉(zhuǎn)化為相應的H.sapiens種類的基因。外圈大半圓為抗纖丸治療相關(guān)靶點，外圈小半圓為肝纖維化靶點。內(nèi)圈用深色的連線將兩者重疊的基因進行連接，并用內(nèi)圈深色部分標識，淺色曲線連接屬于同一豐富本體術(shù)語的基因，見圖3。使用KEGG pathway、GO Biological Processes、Reactome gene Sets、Canonical Pathways、CORUM對55個關(guān)鍵作用靶點進行通路富集分析。對排名前20名的通路途徑進行展示，“靶點數(shù)”表示提供的列表中具有參與特定通路的基因數(shù)量；P值由累積超幾何分布計算而得，P值越小，表示這個通路中富集的差異基因越多，“Log10（P）”是log以10為底的值。“Log10（q）”是log以10為底的多測試調(diào)整后的P值，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示:抗纖丸治療肝纖維化可能與活性氧代謝過程調(diào)控、炎癥反應調(diào)控、轉(zhuǎn)移酶活性正調(diào)控、脂質(zhì)代謝過程調(diào)控、平滑肌細胞增殖的調(diào)控和膠質(zhì)細胞再生等密切相關(guān)。

圖3 抗纖丸和肝纖維化相關(guān)靶點重疊概況

表3 抗纖丸治療肝纖維化相關(guān)靶點富集通路

2.6 關(guān)鍵作用靶點組織分布和亞細胞分布 將55個抗纖丸治療肝纖維化的關(guān)鍵作用靶點導入BioGPS數(shù)據(jù)庫，獲得其組織分布信息。為保證結(jié)果的可靠性，值保留每個基因表達量較高的前5位組織，將組織分布信息導入Cytoscape軟件構(gòu)建組織-靶點網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4-A。其中菱形節(jié)點表示組織，節(jié)點表示度值大小，V型節(jié)點表示靶點。結(jié)果顯示，關(guān)鍵作用靶點主要分布于肝臟（liver，度值=33）、心肌細胞（cardiac myocytes,度值=18）、心臟（heart，度值=16）、全血（whole blood，度值=13）、CD56+自然殺傷細胞和胚胎肝（CD56+NK cells、fetal liver，度值=12）、CD33+髓細胞、CD14+單核細胞、平滑肌、CD34+細胞 （CD33+myeloid、CD14+monocytes、smooth muscle、CD34+，度值=10）、脂肪組織（adipocyte，度值=8）。此外，眾多免疫細胞和免疫器官如：BDCA4+樹突細胞、CD8+T細胞、721 B淋巴細胞和CD19+B細胞也在治療中發(fā)揮一定作用。這些結(jié)果能夠為抗纖丸治療作用的藥理學分子研究提供指導。將上述55個關(guān)鍵作用靶點導入Genecards數(shù)據(jù)庫，獲取和保留confidence大于5的各靶點亞細胞分布信息。采用Cytoscape軟件構(gòu)建亞細胞-靶點網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4-B。其中圓形節(jié)點代表靶點，三角形節(jié)點代表亞細胞結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，靶點更多分布于細胞膜（plasma membrane，度值=29）、細胞外基質(zhì)（extracellular，度值=27）、細胞核（nucleus，度值=20）、細胞基質(zhì)（cytosol，度值=15）。此外，結(jié)果也提示高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核內(nèi)體、細胞骨架、線粒體以及溶酶體可能為藥物作用的重要細胞結(jié)構(gòu)。

圖4 抗纖丸關(guān)鍵作用靶點組織分布（A）關(guān)鍵作用靶點亞細胞分布（B）圖

3 討論

中醫(yī)學無肝纖維化病名記載，根據(jù)其病理變化和臨床表現(xiàn)，可歸屬于“脅痛”、“積聚”范疇?；静C為正虛邪盛，邪毒久積，氣滯血瘀，肝絡(luò)受損，依據(jù)病患體質(zhì)可出現(xiàn)不同臨床表現(xiàn)。肝纖維化本質(zhì)是“虛損生積”，肝臟性質(zhì)損傷，陰精虧損，無以化氣，導致氣血不行，血凝成積［5，6］。根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論，抗纖丸方中當歸、川芎、赤芍活血化瘀，鱉甲滋陰軟堅共為君；黃芪扶正益氣，冬蟲夏草益肺腎補精髓，五味子收斂固澀益氣生津，太子參健脾生津四者共為臣；川楝子疏肝通絡(luò)為佐；黃芩、白花蛇舌草清熱解毒，甘草調(diào)和諸藥為使；十二味中藥調(diào)理肝脾腎三臟，活血化瘀，軟堅散結(jié)以達益氣扶正祛邪之功效。

活化的肝星狀細胞（hepatic stellate cell,HSC）是生成纖維組織的關(guān)鍵細胞，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。不同病因刺激造成肝臟慢性損傷,肝細胞凋亡、壞死或壞死性凋亡,導致肝臟炎癥。肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、Kupffer細胞和淋巴細胞可通過釋放細胞內(nèi)容物、細胞因子和活性氧簇等，刺激靜止的肝星狀細胞活化，導致肝臟細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度增生與沉積，形成肝竇和纖維間隔的毛細血管化，并伴有間隔內(nèi)的血管增生，最終發(fā)生肝纖維化［7］。目前治療肝纖維化的主要策略主要有：治療原發(fā)病、改善肝實質(zhì)細胞損傷與凋亡、調(diào)節(jié)ECM合成與降解、干細胞移植和基因治療等［8］。

網(wǎng)絡(luò)分析顯示：抗纖丸可能通過調(diào)控氧化應激（GO:2000377）、肝臟炎癥反應（GO:0040017、GO：0050900、GO：0050727、GO：0001816、GO:0045785）、脂質(zhì)代謝（GO：0062012、GO：0019216、GO:1905952、GO：0048660、GO：0042063）發(fā)揮治療肝纖維化的作用。臨床和實驗研究表明［3］，氧化應激通過產(chǎn)生活性氧ROS介導纖維化進展。DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化破壞誘導肝細胞壞死及凋亡，放大炎癥反應，促使纖維化發(fā)生。肝臟的慢性炎癥包括：白細胞的浸潤和巨噬細胞的活化等，誘導肝細胞的壞死和凋亡，壞死的肝細胞刺激Kupffer細胞分泌炎癥介質(zhì)，直接啟動HSC的激活［9］。而HSC的激活又可促進自然殺傷細胞、T細胞、樹突細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞的表達，形成炎癥和纖維化之間的惡性循環(huán)，促進纖維化進展［10］。川芎的主要活性成分川芎嗪可抑制HSC增殖，促進其凋亡，通過參與Hedgehog通路發(fā)揮抗纖維化作用［11］。此外川芎嗪還可通過NLRP3炎癥小體途徑減輕炎癥，抑制HSC中炎癥細胞因子表達［12，13］。鱉甲提取物可通過TGF-β1/Smad NF-κB信號通路抑制 HSC 激活［14］。

脂肪細胞因子由脂肪組織分泌，其中瘦素是循環(huán)脂肪形成激素，具有促進纖維發(fā)生的作用。而脂聯(lián)素作為血漿中最豐富的脂肪因子，其表達與AMPK和PPARγ調(diào)控有關(guān)，對肝臟具有一定的保護作用［3］。五味子提取物聯(lián)苯雙酯可調(diào)控HSC中PPARγ表達，抑制細胞增殖，促進其凋亡［15］。脂聯(lián)素可促進基質(zhì)金屬蛋白酶的活化，進而發(fā)揮抗纖維化的作用。當歸、川芎等藥材的水溶性提取物阿魏酸鈉可通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶，抑制膠原分泌，控制肝纖維化發(fā)展［16］。

中藥黃芩中的黃酮類化合物黃芩苷可抑制脂類代謝、炎癥和纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮抗纖維化的作用［17］。

抗纖丸治療的關(guān)鍵組織靶點多分布于肝臟（胚胎肝）、心臟（心肌細胞）、血液、平滑肌、脂肪組織以及相關(guān)免疫細胞，包括CD56+自然殺傷細胞、CD33+髓細胞、CD14+單核細胞、CD34+細胞、BDCA4+樹突細胞、CD8+T細胞、721 B淋巴細胞和CD19+B細胞等。這些結(jié)果與抗纖丸可能發(fā)揮抗炎、改善血液循環(huán)、抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等生物學功能的基礎(chǔ)相符。亞細胞分布研究表明55個關(guān)鍵作用靶點傾向分布于細胞膜上，其中高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核內(nèi)體、細胞骨架、線粒體以及溶酶體可能為藥物作用的重要細胞結(jié)構(gòu)。這些組織分布和亞細胞結(jié)構(gòu)的梳理研究，為抗纖丸治療肝纖維化的藥理學分子研究提供指導。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法揭示抗纖丸治療肝纖維化的多靶點、多通路的復雜機制。結(jié)果顯示抗纖丸可能通過調(diào)控氧化應激、肝臟炎癥反應和脂質(zhì)代謝，發(fā)揮重要的治療作用。拓寬了抗纖丸在治療肝纖維化方面的視角，也為中藥復方治療肝纖維化提供了機制研究方面的思路。