張文燕，曹曉云，郭福慶

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

抑菌劑是指抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)，有時也稱防腐劑［1］。抑菌劑一般被添加到多劑量無菌產(chǎn)品中，目的是用來抑制和/或者殺死在多次使用時不經(jīng)意污染到樣品中的微生物。抑菌劑通過干擾微生物的生長、繁殖和新陳代謝過程發(fā)揮抑菌作用［2］。抑菌效力檢查法系用于測定無菌及非無菌制劑的抑菌活性，用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑濃度的確定［1］。

酒石酸溴莫尼定一般的制劑為滴眼劑，使用濃度為0.2%，主要用于治療開角型青光眼，為新型高度選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑［3］。法國G公司生產(chǎn)的酒石酸溴莫尼定凝膠是一種通過抑制面部血管擴(kuò)張來減少酒糟鼻紅斑的外用凝膠，用于大于18歲患者酒糟鼻引起的面部紅斑的皮膚外用治療。酒石酸溴莫尼定用作皮膚用藥尚屬首次。不同于口服制劑，凝膠劑多為多劑量包裝，在使用過程中均不可避免地接觸手等其他外來物，為了防止使用者污染，多數(shù)制劑中都添加適宜的抑菌劑。

2015版《中國藥典》四部制劑通則的0114凝膠劑中有如下規(guī)定：“根據(jù)需要可加入保濕劑、抑菌劑、抗氧

劑、乳化劑、增稠劑和透皮促進(jìn)劑等。除另有規(guī)定外，在制劑確定處方時，該處方的抑菌效力應(yīng)符合抑菌效力檢查法（通則1121）的規(guī)定”［1］。因此對加入抑菌劑的酒石酸溴莫尼定凝膠進(jìn)行抑菌效力的檢測，是其質(zhì)量控制中不可或缺的一環(huán)。本研究對該樣品進(jìn)行抑菌效力檢查，以判定其抑菌效力是否達(dá)標(biāo)及抑菌劑添加的合理性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BINDERKB720恒溫培養(yǎng)箱（德國BINDER）；SANYO MIR-254恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋株式會社）；SANYO MIR-554恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋株式會社）；SG-403A TX-INT生物安全柜（美國Baker）；SQP精密電子天平（德國賽多利斯）；Lab dancer漩渦混合器（德國IKA）；Yamato 810C高壓滅菌鍋（日本Yamato株式會社）；離心機(jī)（Eppendorf centrifuge 5810R）。

1.2 培養(yǎng)基及稀釋劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA（批號160214）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB（批號160316）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA（批號170316）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基SDB（批號20170429）均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（批號20170111）、聚山梨酯 20（批號 20170117）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚山梨酯80（批號2017-3-24）購自上海市試劑一廠；卵磷脂（批號WXBC2028V）購自SIGMA公司。以上市售脫水培養(yǎng)基均按標(biāo)簽說明配制并高壓滅菌后備用。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC （B）26 003]；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]；大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]；白色念珠菌（Candida albicans)[CMCC（F）98 001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]。

1.4 試驗(yàn)樣品 酒石酸溴莫尼定凝膠3批（批號為106978、107579和106977），法國G公司生產(chǎn)。本品為皮膚給藥制劑，規(guī)格為0.33%（以溴莫尼定計），包裝規(guī)格為30 g/支。添加的防腐劑為對羥基苯甲酸甲酯（0.1%W/W）和苯氧乙醇（0.4%W/W）。

2 方法

2.1 計數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.1.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)24 h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，22.5℃培養(yǎng)48 h。取上述4種菌的新鮮培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，22.5℃培養(yǎng)7 d后，加入4 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

2.1.2 計數(shù)方法適用性試驗(yàn) 按照《中國藥典》2015年版四部通則1105“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2.1 細(xì)菌計數(shù) ①試驗(yàn)組：取本品10 g，加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至 100 ml，制成 1∶10 供試液，取 1∶10 供試液 9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量＜100 cfu/ml的供試液，混勻，取1 ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。銅綠假單胞菌和大腸埃希菌同法操作。

②菌液對照組：取適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液加0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10 ml，混勻，制成菌含量＜100 cfu/ml的菌懸液，吸取1 ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。銅綠假單胞菌和大腸埃希菌同法操作。

③供試品對照組：取試驗(yàn)組項(xiàng)下1∶10供試液1 ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。

④稀釋劑對照組：取適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至10 ml，混勻，制成菌含量＜100 cfu/ml的菌懸液，吸取1 ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。銅綠假單胞菌和大腸埃希菌同法操作。

2.1.2.2 真菌計數(shù) ①試驗(yàn)組：取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml白色念珠菌菌液，制成菌含量＜100 cfu/ml的供試液，混勻，取1 ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。黑曲霉同法操作。②菌液對照組：取適量濃度的0.1 ml白色念珠菌菌液加0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10 ml，制成菌含量＜100 cfu/ml的菌懸液，吸取1 ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。黑曲霉同法操作。③供試品對照組：取需氧菌試驗(yàn)組項(xiàng)下1∶10供試液1 ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。④稀釋劑對照組：取適量濃度的0.1 ml白色念珠菌菌液加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至10 ml，混勻，制成菌含量＜100 cfu/ml的菌懸液，吸取1 ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。黑曲霉同法操作。

2.1.2.3 回收率計算 計數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的回收率不得低于70%［1］。公式：回收率=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液對照組的平均菌落數(shù)×100%［1］。

2.2 供試品抑菌效力測定

2.2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)24 h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，22.5℃培養(yǎng)48 h。8 000 r/min離心5 min收集菌體，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋并制成每1 ml含菌數(shù)約為108cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，22.5℃培養(yǎng)7 d后，加入4 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，然后用適宜方法吸出孢子懸液至無菌離心管內(nèi)，8 000 r/min離心5 min收集孢子，加入適量的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含孢子數(shù)108cfu的孢子懸液。

2.2.2 接種菌液菌數(shù)測定 接種的菌液需進(jìn)行菌數(shù)測定，用0.9%無菌氯化鈉溶液分別將每個供試菌液（每1 ml含菌數(shù)約108cfu）進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取10-5、10-6和10-7三個稀釋級的稀釋液1 ml至平皿中，每個稀釋級菌液平行制備2個平皿，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，依法測定菌數(shù)。

2.2.3 供試品接種 本品每個包裝容器的裝量足夠試驗(yàn)用（規(guī)格為30 g），但包裝容器以及供試品的性狀不便于無菌操作技術(shù)接入試驗(yàn)菌液、混合及取樣等，因此將供試品轉(zhuǎn)移至上口直徑60 mm、下口直徑50 mm、高70 mm的無菌容器（見圖1）進(jìn)行試驗(yàn)。因轉(zhuǎn)移出的樣品量均大于27 g，但不足30 g，故以27 g的樣品量進(jìn)行試驗(yàn)。取包裝完整的供試品5份，分別轉(zhuǎn)移27 g供試品至5個上述無菌容器中，每一容器接種一種試驗(yàn)菌，1 g供試品中接菌量為105～106cfu，接種菌液的體積為供試品體積的1%，即0.27 ml，用“L”型涂布棒充分?jǐn)嚢杌旌?，使供試品中的試?yàn)菌均勻分布，置22.5℃避光貯存。

圖1 抑菌效力試驗(yàn)使用的無菌容器

2.2.4 存活菌數(shù)測定 本品為皮膚給藥制劑，根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則1121“抑菌效力檢查法”的規(guī)定，本品至少應(yīng)達(dá)到皮膚給藥制劑的抑菌效力評價B標(biāo)準(zhǔn)（見表1）。為了探究該樣品是否也可以達(dá)到A標(biāo)準(zhǔn)，在A標(biāo)準(zhǔn)和B標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的間隔時間均對樣品進(jìn)行了存活菌數(shù)測定。

表1 皮膚給藥制劑抑菌效力評價標(biāo)準(zhǔn)

存活菌數(shù)測定方法照《中國藥典》2015年版四部通則1105“非無菌產(chǎn)品微生物限度：微生物計數(shù)法”進(jìn)行。

第2日，無菌操作下，分別從加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的3個容器中各取供試品1 g，加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至10 ml，制成1∶10供試液，將供試液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-5稀釋級，每個稀釋級取1 ml至平皿中，平行制備2個平皿，采用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，第7日，菌數(shù)測定操作同第2日。

第14日，無菌操作下，分別從5個容器中各取供試品1 g，加含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至10 ml，制成1∶10供試液，將供試液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-5稀釋級，每個稀釋級取1 ml至平皿中，平行制備2個平皿，細(xì)菌計數(shù)采用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，真菌計數(shù)采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。第28日，菌數(shù)測定操作同第14日。

根據(jù)存活菌數(shù)測定結(jié)果，計算1 g供試品各試驗(yàn)菌所加的菌數(shù)及各間隔時間的菌數(shù)，并換算成lg值。根據(jù)皮膚給藥制劑的抑菌效力評價A標(biāo)準(zhǔn)和B標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。對3批樣品的方法進(jìn)行抑菌效力檢查。

3 結(jié)果及分析

3.1 計數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果 5株菌的回收率均大于70%，故可用含4%聚山梨酯20和0.5%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基來制備1∶10供試液，并采用常規(guī)法對該產(chǎn)品進(jìn)行菌數(shù)測定。見表2。

表2 計數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3.2 3批樣品抑菌效力測定結(jié)果 每個菌的濃度都是可以達(dá)到試驗(yàn)要求的，見表3。

在第2日時，3批樣品在人為污染金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌后，試驗(yàn)組和菌液組相比，樣品中菌數(shù)下降值均大于2 lg；第7日時，3個批號樣品的試驗(yàn)組和菌液組相比，下降值均大于3 lg。第14日時，3批樣品細(xì)菌數(shù)均為0，菌數(shù)下降lg值均大于3 lg；真菌數(shù)下降值均大于2 lg。

第28日時，3批樣品細(xì)菌數(shù)與第14日相比減少菌數(shù)lg值為0，無增加。白色念珠菌菌數(shù)，批號106978樣品與第14日相比減少菌數(shù)lg值為0.56，無增加；批號107579樣品與第14日相比減少菌數(shù)lg值為0，無增加；批號106977樣品與第14日相比減少菌數(shù)lg值為0.56，無增加。3批樣品黑曲霉菌數(shù)與第14日相比減少菌數(shù)lg值為0，無增加。見表4-表6。

本品為皮膚給藥制劑，根據(jù)《中國藥典》要求，至少應(yīng)達(dá)到“B”的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)上述結(jié)果，3批酒石酸溴莫尼定凝膠樣品均達(dá)到“A”的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。采用2015年版《中國藥典》通則1121“抑菌效力檢查法”項(xiàng)下方法可有效地判定酒石酸溴莫尼定凝膠的抑菌效力是否達(dá)標(biāo)。

表3 接種試驗(yàn)菌的每1 ml菌液計數(shù)結(jié)果 cfu

表4 抑菌效力結(jié)果（批號106978）

表5 抑菌效力結(jié)果（批號107579）

表6 抑菌效力結(jié)果（批號106977）

4 討論

在一般的抑菌效力檢查以及文獻(xiàn)報道中，滴眼劑、注射劑等液體制劑的報道居多，皮膚用藥的非水制劑很少。在滴眼劑、注射劑這些液體制劑的抑菌效力檢查時，一般試驗(yàn)菌均可以接種于供試品原包裝容器中進(jìn)行試驗(yàn)，而本試驗(yàn)中，樣品為凝膠劑，供試品需轉(zhuǎn)移至無菌容器中再加入試驗(yàn)菌進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)多方試驗(yàn)，最終采用上口直徑60 mm、下口直徑50 mm、高70 mm的無菌容器。通過“L”型涂布棒充分進(jìn)行攪拌，使樣品和試驗(yàn)菌充分混合。本研究為同種類型的藥品進(jìn)行抑菌效力試驗(yàn)提供參考。

對于一種抑菌劑來說，由于同時兼具抑菌作用和毒性作用兩個方面，其在制劑中的處方量顯得尤為關(guān)鍵［4］。制劑中抑菌劑的添加原則為“最低有效”，即在保證足夠抑菌能力的前提下越少添加越好。可見抑菌劑的種類和添加量是維持“毒性-活性”平衡的關(guān)鍵［5］。對羥基苯甲酸酯類（parabens）又名尼泊金酯類，其抗菌譜廣，具有在空氣中穩(wěn)定、對酸堿穩(wěn)定、低毒和價格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用做食品、藥品和化妝品等的防腐劑［6］。苯氧乙醇為無致敏性的殺菌劑，對革蘭陽性細(xì)菌作用強(qiáng)，抗真菌時常需與其他尼泊金類聯(lián)合應(yīng)用［7］，作為防腐劑在歐盟化妝品中規(guī)定最大使用濃度為1%［EUCosmetic Regulations（76/768/EEC）］，本制劑中苯氧乙醇用量為0.4%（W/W）。

有研究表明，化妝品中添加的防腐劑往往是引起人們皮膚過敏反應(yīng)最為常見的過敏原［8］。人體對各種防腐劑的過敏率大概為10%,主要與過敏體質(zhì)和防腐劑有關(guān)［9，10］。FDA對常見抑菌劑含量規(guī)定中明確作為抑菌劑，對羥基苯甲酸甲酯最大用量為0.05%［11］。雖然是藥品，但酒石酸溴莫尼定凝膠和化妝品也有一定的相似之處，都是涂抹在皮膚表面，本品種中對羥基苯甲酸甲酯的含量為0.1%（W/W），其含量超出了規(guī)定，則引起皮膚過敏反應(yīng)風(fēng)險的幾率也可能相應(yīng)地增加。

根據(jù)本文的試驗(yàn)結(jié)果，該含量的抑菌劑可以使酒石酸溴莫尼定凝膠的抑菌效力達(dá)到《中國藥典》規(guī)定的“A”標(biāo)準(zhǔn)，是否也可以采用0.05%的添加量有待研究。