王瑞靜，劉 楊，田 野，李瑞明

（天士力控股集團(tuán)有限公司天士力研究院，天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410）

復(fù)方中藥連夏消痞顆粒是由法半夏、黃芩等8味中藥材制成的中藥復(fù)方制劑，具有健脾和胃、消除脹滿之功效，本方辛開苦降，寒熱并用，陰陽并調(diào)，主治脾胃不和寒熱錯(cuò)雜之癥。本試驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)［1-6］，采用HPLC法測定連夏消痞顆粒中黃芩苷的含量，方法簡便快速，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，為提升產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260系列高效液相色譜儀，配置紫外檢測器。電子分析天平：梅特勒XS205DU型 KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore）。

1.2 試藥 黃芩苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110715-201821，純度95.4%），甲醇為色譜純（MERCK），其余試劑均為分析純，水為二純水。連夏消痞顆粒批號(hào) 20190501，20181107，20181109，為本公司制備的中試樣品。連夏消痞顆粒缺黃芩陰性樣品，批號(hào)20180414（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDBC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（47∶53），流速 1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量 10 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品42.17 mg（純度為 95.4%），置 100 ml量瓶中，加甲醇適量使全部溶解，并用甲醇定容，搖勻，得濃度為0.402 3 mg/ml的對(duì)照品母液；精密吸取上述對(duì)照品母液5 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再取上述溶液5 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.100 6 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取連夏消痞顆粒約0.2 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入50 ml甲醇，邊加邊振搖，使供試品分散，稱重，超聲（40 kHz，500 W）30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得連夏消痞顆粒供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的配制 取缺黃芩陰性顆粒樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄液相色譜圖，見圖1。陰性對(duì)照在黃芩苷相同保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。

圖1 對(duì)照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考查 精密稱取黃芩苷對(duì)照品42.17 mg（純度為95.4%），置100 ml量瓶中，加甲醇適量使全部溶解，并用甲醇定容，搖勻，得濃度為0.402 3 mg/ml的對(duì)照品母液；取母液稀釋得濃度分別為0.402 3、0.201 2、0.100 6、0.050 3、0.025 1 和 0.012 6 mg/ml的溶液，分別精密吸取上述溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=4×106X+24 569（r=1），表明黃芩苷在0.0126～4.023 mg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，測定峰面積，計(jì)算精密度，結(jié)果RSD為0.25%，表明該儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，和“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別精密吸取各溶液10 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在 0、2、4、6、12 和 24 h進(jìn)樣，共測定6次，測定峰面積，計(jì)算結(jié)果，對(duì)照品和供試品峰面積的RSD分別為0.92%和0.29%，結(jié)果表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)20190501）樣品6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，并計(jì)算其RSD為0.41%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取顆粒（批號(hào)20190501）6份，含量按2.72%計(jì)，每份0.1 g，精密量取0.402 3 mg/ml的黃芩苷對(duì)照品溶液7 ml，分別加入到6份樣品中，按供試樣品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果加樣回收率均值為102.37%，RSD為1.30%。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測定 取3批連夏消痞顆粒中試樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相配比 色譜條件的選擇系參照《中國藥典》2015版一部黃芩藥材中黃芩苷的含量測定方法：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）為流動(dòng)相；檢測波長為 280 mn，在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)又對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行深入考查，分別選擇甲醇-0.1%磷酸（47∶53）、甲醇-0.4%磷酸（47∶53）和甲醇-0.5%磷酸（47∶53）不同比例的磷酸水，最終選取最優(yōu)比例甲醇-0.4%磷酸（47∶53）為流動(dòng)相，結(jié)果黃芩苷與其他峰分離度均大于2，分離效果良好，保留時(shí)間適宜，重現(xiàn)性好。

3.2 供試品溶液制備方法 供試品溶液制備方法以黃芩苷的提取率為指標(biāo)，分別考查了提取方法（超聲提取和加熱回流提取）、提取溶劑（甲醇、70%乙醇和70%甲醇）、提取溶劑倍數(shù)和提取時(shí)間，結(jié)果采用甲醇超聲處理30 min可以將黃芩苷提取完全，故選擇該法作為供試品溶液制備方法。

3.3 流速的考查 為了考查不同流速對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，本文選擇0.8、1.0和1.2 ml/min進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同流速下測得的樣品含量差異不大，RSD為1.13%。

3.4 檢測波長的考查 為了考查不同檢測波長對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，本文選擇了277、280和283 nm進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同波長下測得的樣品含量差異不大，RSD為0.02%。

3.5 柱溫考查 為了考查不同柱溫對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，本文選擇了25、30和35℃進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同柱溫下測得的樣品含量差異不大，RSD為0.97%。

3.6 色譜柱考查 為了考查不同品牌不同型號(hào)的色譜柱對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，本文選擇了Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18、DIKMA Inspire C18兩種品牌3種型號(hào)的色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同色譜柱測得的樣品含量差異不大，RSD為0.68%。

本研究建立的黃芩苷檢驗(yàn)方法，操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為復(fù)方中藥連夏消痞顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。