鄒進晶 查干 王有娜 索濤 吳小軍

哮喘是多種免疫活性細胞和細胞因子參與的一種慢性非特異性氣道炎癥性疾病[1-2]。既往研究結(jié)果顯示，輔助性T細胞(Th)1/Th2和Th17/調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)反應(yīng)失衡是哮喘免疫失衡的主要機制，然而其作用通路還不足以完全解釋哮喘患者癥狀的持續(xù)存在[3-4]。白藜蘆醇(RES)是植物在環(huán)境惡化及受到病原攻擊時產(chǎn)生的一種植物抗毒素。既往研究表明，RES在哮喘[5]、慢性阻塞性肺疾病[6]、急性肺損傷[7]及肺間質(zhì)性病變[8]等呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種晚期炎癥因子，已有研究證實其在維持哮喘氣道炎癥中發(fā)揮作用[9]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9通過促進細胞外基質(zhì)(ECM)沉積和氣道平滑肌細胞增殖、遷移，參與哮喘的氣道重塑過程[10]。我們通過檢測RES對哮喘小鼠模型氣道炎癥反應(yīng)及肺組織HMGB1和MMP-9表達的影響，探討其影響哮喘氣道炎癥的機制，為支氣管哮喘患者的治療提供新思路和理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：6～8周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠36只，體重約20 g，購于武漢大學(xué)動物實驗中心。雞卵清蛋白(OVA)購于Sigma公司；免疫組化一抗購于美國Gene Tex公司；二抗及顯色劑購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購于Transgene公司；Trizol總RNA提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生科有限公司；ECL發(fā)光液購于美國Thermo Scientific公司。實驗儀器包括超聲霧化器、實時定量PCR儀(ABI7500型)、光學(xué)顯微鏡等。

2.方法

(1)動物分組和哮喘小鼠模型制作：將36只C57BL/6雌性小鼠隨機分為對照組、哮喘組及RES干預(yù)組，每組各12只。哮喘小鼠模型制作：①致敏:于第1天、第14天予每只小鼠分別腹腔注射致敏液0.2 ml(1 mg/ml OVA 0.1 ml與10 mg/ml佐劑液態(tài)鋁0.1 ml混合制備)；②激發(fā):于第21～27天將小鼠置于密閉容器(20 cm×40 cm×50 cm)中，以10 mg/ml的OVA溶液10 ml霧化吸入，每天1次，每次30 min；同時，RES干預(yù)組小鼠于激發(fā)前1 h，采用100 mg/kg的RES腹腔注射進行干預(yù)；對照組和哮喘組小鼠腹腔注射等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)。末次激發(fā)24 h后處死動物，進行標(biāo)本采集。

(2)肺組織標(biāo)本制備：第28天斷椎處死各組小鼠，并立即予PBS進行肺泡灌洗，收集1ml肺泡灌洗液于EP管中，迅速取新鮮右肺組織置于1.5 ml的EP管中，置于-80 ℃冰箱貯存。將取出的左肺組織置于4%甲醛溶液中，石蠟包埋固定切片后，行蘇木素-伊紅(HE)染色、過碘酸-雪夫(PAS)染色及免疫組化染色。

(3)HE染色、PAS染色及免疫組化染色：每只小鼠分別隨機選取3張肺組織石蠟切片行HE和PAS染色。評分方法：兩位獨立的觀察者在200倍顯微鏡下對支氣管壁炎癥細胞浸潤及杯狀細胞的增殖情況進行半定量評分，每張切片至少觀察4個視野，評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：支氣管壁及血管周圍無炎癥細胞浸潤；1分：支氣管壁及血管周圍有散在炎癥細胞浸潤；2分：支氣管壁及血管周圍有1～5層炎癥細胞浸潤；3分：支氣管壁及血管周圍有>5層炎癥細胞浸潤。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析氣道上皮杯狀細胞的數(shù)量及基底膜周徑標(biāo)準(zhǔn)化的PAS+杯狀細胞面積(Apas+/Pbm)。每張石蠟切片也均進行免疫組化染色，觀察炎癥細胞中HMGB1和MMP-9蛋白的表達，采用積分光密度(IOD)反映目標(biāo)蛋白的表達水平。

(4)肺組織HMGB1和MMP-9 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測：采用Trizol法提取右肺組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA，并設(shè)計目的基因引物。HMGB1序列上游引物:5’-AAAGAAGTTCAAGGACCCC-3’，下游引物:5’-GCTCTGTAGGCAGCAATAT-3’,產(chǎn)物長度234 bp；MMP-9序列上游引物:5’-GCGTGTCTGGAGATTCGACT-3’,下游引物:5’-TTTGGAAACTCACACGCCAG-3’，產(chǎn)物長度167 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3’,下游引物:5’-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3’，產(chǎn)物長度229 bp;PCR反應(yīng)體系(20 μl)：模板cDNA 4 μl，PCR上、下游引物(100 μM)各0.4 μl，預(yù)混緩沖液(SYBR Greenn/Flourescein qPCR Master)10 μl，雙蒸水(ddH2O)5.2 μl。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次,記錄每次測定的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，得出的數(shù)據(jù)采用2-△△Ct進行分析。

(5)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中HMGB1和MMP-9蛋白水平檢測：將保存在-80 ℃冰箱中的BALF取出，于冰上復(fù)融后在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測HMGB1和MMP-9蛋白水平。

結(jié) 果

1.3組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較：對照組小鼠肺組織HE染色下見支氣管結(jié)構(gòu)排列規(guī)律，未見炎癥胞浸潤(圖1A)；PAS染色下見支氣管上皮細胞中幾乎無杯狀細胞(PAS+細胞)和黏液分泌(圖1B)。哮喘組小鼠肺組織HE染色下見氣道壁明顯增厚，肺泡融合，支氣管壁和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主(圖1C)；PAS染色下見支氣管上皮細胞中杯狀細胞(PAS+細胞)增殖及黏液分泌明顯增多(圖1D)。與哮喘組比較,RES干預(yù)組小鼠肺組織HE染色下見氣道壁明顯變薄、肺泡融合明顯減少，支氣管壁和血管周圍炎癥細胞明顯減少(圖1E)；PAS染色下見支氣管上皮細胞中杯狀細胞(PAS+細胞)數(shù)量和黏液分泌明顯減少(圖1F)。對照組、哮喘組和RES干預(yù)組小數(shù)肺組織炎癥病理學(xué)評分分別為0.33±0.18、2.68±0.39、1.51±0.54，Apas+/Pbm分別為0.41±0.44、6.01±1.28、3.54±1.59。RES干預(yù)組小鼠肺組織炎癥病理學(xué)評分和Apas+/Pbm均明顯低于哮喘組(P<0.05)。

2.3組小鼠肺組織中HMGB1和MMP-9蛋白免疫組化及mRNA檢測結(jié)果比較：對照組小鼠肺組織中HMGB1和MMP-9蛋白及mRNA的表達較少，而哮喘組小鼠肺組織中的表達明顯增多，但RES干預(yù)組HMGB1和MMP-9蛋白及mRNA的表達水平均明顯低于哮喘組(P<0.05)。見圖2和表1。

表1 3組小鼠肺組織中HMGB1和MMP-9 mRNA及蛋白表達水平比較

3.3組小鼠BALF中炎癥細胞計數(shù)、HMGB1及MMP-9蛋白表達水平比較：哮喘組小鼠BALF中炎癥細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞計數(shù)、巨噬細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、HMGB1及MMP-9表達水平均高于對照組(P<0.05)；RES干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞計數(shù)、巨噬細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、HMGB1及MMP-9表達水平均低于哮喘組(P<0.05)。見表2。

圖1 3組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較(×200，A:對照組，HE染色；B：對照組，PAS染色；C:哮喘組，HE染色；D:哮喘組，PAS染色；E：RES干預(yù)組，HE染色；F：RES干預(yù)組，PAS染色)

圖2 3組小鼠肺組織中HMGB1和MMP-9蛋白免疫組化結(jié)果(×200，A、D:對照組；B、E:哮喘組；C、F:RES干預(yù)組)

表2 3組小鼠BALF中炎癥細胞計數(shù)、HMGB1及MMP-9蛋白表達水平比較

討 論

既往研究結(jié)果顯示，RES可減輕慢性哮喘小鼠氣道炎癥，并改善其氣道重塑、降低氣道高反應(yīng)性、改善肺功能[11]。Lee等[12]的研究表明，RES干預(yù)哮喘小鼠模型組血清和BALF中Th2相關(guān)細胞因子分泌明顯減少，氣道炎癥細胞數(shù)量及氣道黏液分泌明顯減少。本研究結(jié)果顯示，與哮喘組比較，RES干預(yù)組小鼠支氣管壁明顯變薄，支氣管壁及血管周圍炎癥細胞也明顯減少，BALF中炎癥細胞、支氣管上皮杯狀細胞數(shù)量及分泌的黏液也明顯減少。因此，從肺組織炎癥病理學(xué)評分和Apas+/Pbm角度而言，RES明顯減輕哮喘小鼠氣道炎癥，但其具體機制尚未明確。

HMGB1廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi)，當(dāng)機體免疫炎癥反應(yīng)被激活時，細胞內(nèi)的HMGB1釋放到細胞外[13]。Ma等[14]的研究表明，細胞外HMGB1參與Th2為主導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)哮喘小鼠模型BALF中炎癥細胞數(shù)量明顯增加，同時細胞外HMGB1水平與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且該研究還認(rèn)為HMGB1是激素抵抗型哮喘的潛在病因之一。Hou等[15]的研究也表明，哮喘患者肺活檢標(biāo)本及誘導(dǎo)痰液中HMGB1水平明顯升高，且與BALF中性粒細胞數(shù)量呈正相關(guān)，與肺功能呈負相關(guān)。有研究表明，給予抗HMGB1功能性抗體干預(yù)后哮喘小鼠模型HMGB1的表達明顯減少，哮喘癥狀明顯減輕[16]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，哮喘組小鼠BALF中HMGB1蛋白及肺組織中HMGB1蛋白和mRNA表達水平明顯升高；而RES干預(yù)組小鼠BALF中HMGB1蛋白及肺組織中HMGB1蛋白和mRNA表達水平明顯低于哮喘組。因此，我們推測RES可能通過降低HMGB1的表達抑制哮喘氣道炎癥的發(fā)生。

MMP-9是與哮喘氣道重塑關(guān)系最密切的MMPs成員。Royce等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，RES可通過抑制上皮下膠原沉積減輕慢性哮喘小鼠氣道重塑。本研究結(jié)果顯示，與哮喘組比較，RES干預(yù)組小鼠BALF中MMP-9蛋白及肺組織中MMP-9蛋白和mRNA表達水平明顯低于哮喘組。因此，我們推測RES可能通過調(diào)節(jié)MMP-9表達抑制哮喘小鼠氣道重塑。

綜上所述，RES可減輕哮喘小鼠氣道炎癥和氣道重塑，其可能機制為通過調(diào)節(jié)HMGB1和MMP-9的表達。