蔡新東　王致遠(yuǎn)　歐珠次仁　丁功濤　張海霞

血液蛋白分解菌的篩選及分離鑒定

蔡新東1王致遠(yuǎn)1歐珠次仁1丁功濤2張海霞2

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院甘肅蘭州730124；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅蘭州730030）

為了篩選得到能夠降解血液蛋白的微生物菌株，以甘南屠宰場的土壤為材料，將樣品稀釋涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和哥倫比亞血平板上，篩分出了一株可以降解血液蛋白的菌株，將其命名為NwMcc01910043。對該菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定、16SrDNA序列鑒定，并測定其蛋白酶活力。試驗結(jié)果顯示NwMcc01910043菌株為變形桿菌()，其蛋白酶活力為194.203U/mL。本試驗篩選鑒定出一株血液蛋白分解菌NwMcc01910043，為屠宰場處理廢棄血液蛋白提供了一定的理論基礎(chǔ)。

血液蛋白分解菌；篩選；分離；鑒定

我國的畜禽養(yǎng)殖量居世界第一，每年都有大量的畜禽被宰殺。據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)可知，2019年，我國的生豬的出欄量超過6.8億頭，占世界總產(chǎn)量近50 %；各類家禽出欄量超過130 億羽；牛出欄量超過5500 萬頭，羊出欄量超過2億頭[1]。畜禽血液是畜禽屠宰加工的主要副產(chǎn)物，我國每年畜禽屠宰所產(chǎn)生的血液總量可超過800 萬噸，這些血液中含有豐富的蛋白質(zhì)[2]。長期以來，由于屠宰分散、技術(shù)落后、血液有較重的血腥味、適口性差、易變質(zhì)不易保存等原因，只有少量畜禽血液被加工成食品，供人們食用，大量血液遭到丟棄[3]。這不僅浪費了資源，還污染了環(huán)境，不符合可持續(xù)發(fā)展理念。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，曾經(jīng)制約著血液利用的不利因素正在被解決[4]。采用微生物發(fā)酵法處理畜禽血液成本低，可以除去多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，還能生成利于消化吸收的代謝產(chǎn)物和益生菌，提高營養(yǎng)成分的利用率，是公認(rèn)的解決動物廢棄血液污染的一個方向[5,6]。本試驗以甘南合作市舟曲縣屠宰場的土壤為材料，篩選出一株血液蛋白分解菌NwMcc01910043 ，并鑒定該菌株和測定其蛋白酶活力，為屠宰場處理廢棄血液提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

樣品采集于甘南合作市舟曲縣屠宰場淤泥，地址為313 省道南100 米，坐標(biāo)（104.398644 ,33.770136 ）。

1.1.2 試劑

哥倫比亞血平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），酵母提取粉（OXOID），牛肉膏（青島海博），蛋白胨（青島海博），瓊脂粉（青島海博），干酪素（阿拉丁工業(yè)公司），氯化鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），氫氧化鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），革蘭染色試劑（博精索拉博科技有限公司），細(xì)菌生化鑒定管（杭州微生物試劑有限公司），福林酚試劑（分析純，博精索拉博科技有限公司），三氯乙酸（分析純，博精索拉博科技有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取粉5 g/L；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂15 g/L，血清30 g/L；

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及菌株的篩選

用無菌離心管收集屠宰場淤泥土壤，帶回實驗室，取出適量的樣品，用無菌水進行10-4～10-6梯度稀釋，將適量的土壤懸液涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，挑取透明水解圈最大的菌落進行復(fù)篩。

1.2.2 菌株的復(fù)篩

將初篩獲得的具有透明圈的菌株，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中進行擴繁，在37 ℃下、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌種以2 %的接種量接種到哥倫比亞血平板上進行培養(yǎng)，觀察后期生長的透明圈，透明圈直徑越大，產(chǎn)酶量越多且酶活力越高[7,8]。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將復(fù)篩獲得的菌株劃線接種于哥倫比亞血平板上，37 ℃下，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形狀、大小、顏色、邊緣、隆起、透明度等[9]。

1.2.4 革蘭氏染色鑒定

將分離得到的菌株劃線接種于血平板上，37 ℃下，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單個菌落進行革蘭氏染色，染色后鏡檢，觀察菌體細(xì)胞的形狀、大小及染色結(jié)果[10]。

1.2.5 生化反應(yīng)試驗鑒定

對斜面活化后的菌株進行生理生化反應(yīng)，主要從菌株對碳源利用、硝酸還原、淀粉水解、纖維素利用、明膠是否液化、硫化氫產(chǎn)生等方面來進行分析[11]，根據(jù)分析所得到的結(jié)果，對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》來進行屬種鑒定[12]。

1.2.6 16 SrDNA序列鑒定

制備PCR反應(yīng)模板DNA：取1 mL菌液放于1.5 mL離心管中，12 000 g離心2min，棄去上清液，沉淀中加入500 μL的無菌水制成菌懸液，將菌懸液99 ℃加熱10 min，-70 ℃冷擊20 min，循環(huán)3次，循環(huán)結(jié)束的菌液12000 g離心5min，取其上清液作為PCＲ擴增的模板[13]。16 SrDNA的通用引物為27 F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492 Ｒ(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×Mix12.5 μL，F(xiàn)引物2 μL，Ｒ引物2 μL，無菌去離子水7 μL，模板1.5 μL，將各組分按以上順序依次加入PCR反應(yīng)管中，混勻后用PCR擴增儀進行擴增[14]。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)束后，取出凝膠，在紫外線成像儀下觀察PCR產(chǎn)物在膠塊中的位置，參照DNAMarker確定各產(chǎn)物的分子大小。將正確擴增得到的PCR產(chǎn)物送到北京擎科生物技術(shù)有限公司進行DNA測序。將測序的結(jié)果序列輸入到NCBI網(wǎng)站進行NucleotideBLAST，然后使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 蛋白酶活力測定

粗酶液的制備：將單菌落接入LB培養(yǎng)基進行活化，于32 ℃的立式恒溫振蕩器中以180 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12 h?；罨Y(jié)束后，取2 mL菌液于離心機中以10 000 r/min的速度離心10 min，得到的上清液即為粗酶液。蛋白酶活力的測定：采用GB/T23527—2009 《蛋白酶制劑》法[15]。將1 mL粗酶液與1 mL底物（酪蛋白溶液）混合均勻，于40 ℃反應(yīng)10 min后加入2 mL的三氯乙酸來終止反應(yīng)，以12000 r/min的速度離心3 min。在1 mL上清液中加入5mLNa2CO3溶液以及1 mLFolin-酚試劑，混合均勻后于40 ℃保溫20 min，使用紫外-可見光分光光度計，在波長680 nm處測定OD值。同時進行空白試驗，離心管中先后注入粗酶液1 mL、三氯乙酸2 mL、20 g/L酪蛋白溶液1 mL。15 min后離心分離，以下操作均與試樣測定相同。蛋白酶活力的定義：在40 ℃，pH 7.5的條件下，每分鐘水解酪蛋白以產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量被定義為一種蛋白酶活性單位，按下式計算酶活力值[16]：

式中，X：樣品的蛋白酶活力；K：OD值為1時相當(dāng)?shù)睦野彼豳|(zhì)量(μg)；

A：樣品得OD值與空白的OD值之差；N：樣品的稀釋倍數(shù)；5：測定中吸取了全部濾液的1/5；10 ：整個過程反應(yīng)了10 min，以1min計。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

將從屠宰場廢棄血液存放地收集得到的土壤，稀釋涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，結(jié)果如圖1所示，產(chǎn)生透明水解圈；將初篩獲得的具有透明圈的菌株，經(jīng)分離純化后挑取單個菌落接種到哥倫比亞血平板上進行培養(yǎng)，結(jié)果如圖2所示，也產(chǎn)生透明水解圈。

圖1　NwMcc01910043 菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長狀況

圖2　NwMcc01910043 菌株在哥倫比亞血平板上的生長狀況

2.2 革蘭氏染色及形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選得到的菌種劃線接種于血平板上，然后將平板放在 37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后的菌落形態(tài)為不規(guī)則、黏稠、濕潤、白色，直徑為2.8 mm，透明水解圈的大小約6 mm。經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察到，分離得到的菌株為桿狀菌，菌體細(xì)胞呈藍(lán)紫色，初步鑒定為革蘭氏陽性菌（圖3）。

圖3　NwMcc01910043 菌株革蘭氏染色結(jié)果

2.3 生化反應(yīng)試驗

分離菌株生化反應(yīng)特性鑒定結(jié)果（表1）顯示，NwMcc01910043 菌株分解葡萄糖、尿素、DNA酶、枸橘酸鹽、蔗糖、硫化氫、鳥氨酸、賴氨酸。不分解蛋白胨水、乳糖、麥芽糖、衛(wèi)茅醇、甘露醇、木棉糖、還原硝酸鹽、苯丙氨酸。根據(jù)NwMCC01910043 的菌落形態(tài)、生理生化反應(yīng)以及革蘭氏染色結(jié)果，按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行初步分類，NwMCC01910043 菌株為變形桿菌。

表1　NwMCC01910043 菌株生化反應(yīng)試驗結(jié)果

注：“+”表示生化反應(yīng)結(jié)果為陽性；“-”表示生化反應(yīng)結(jié)果為陰性。

2.4 16 SrDNA序列鑒定

2.4.1 瓊脂糖凝膠電泳

電泳結(jié)果（圖4）顯示出NwMCC01910043 菌株的16 SrDNA序列PCR擴增產(chǎn)物條帶約為1500 bp。

2.4.2 菌株的16 SrDNA序列分析

將測序得到的16 SrDNA序列進入NCBI網(wǎng)站，與現(xiàn)存關(guān)系較近的序列進行NucleotideBLAST。其結(jié)果表明NwMcc01910043 菌株與變形桿菌親源關(guān)系最近，與其同源性高達(dá)99.69 %。將NwMcc0191004 菌株的16 SrDNA的核酸序列和BLAST結(jié)果中的17 個序列用比對軟件MEGA7.0進行多重比對，然后繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。

圖4　PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖5　基16 SrDNA基因序列建立的NwMCC01910043 菌株系統(tǒng)進化樹

2.5 蛋白酶活力的測定

由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）所得的方程式計算得出K值為99.38，將K值代入酶活測定公式可得：NwMCC01910042 菌株粗酶液的蛋白酶活力為194.203 U/mL。

圖6　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

畜禽血液制成的飼料存在“三差”問題，即氨基酸組成平衡差、可消化性差、適口性差[17]。通過微生物發(fā)酵可以降解大分子血液蛋白，使其水解成為利于動物吸收的小肽和氨基酸。與游離氨基酸或全蛋白相比，動物對二肽和三肽形式的蛋白質(zhì)吸收效率更高，并且二肽和三肽形式的蛋白質(zhì)可能會改善飲食成分的吸收[18,19]。WangLiang等[20]通過紫外線（UV）誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌CICC10265，并優(yōu)化了降解條件。在溫度為33.8 ℃，降解時間為69.36 h，pH值為7.0，接種量為7.2×107CFU/mL，轉(zhuǎn)速為250r/min的條件下，血粉水解度為62.18 ％。LiDeng-long等[21]選擇十二烷基吡喃葡萄糖苷作為表面活性劑，看表面活性劑對黑曲霉發(fā)酵雞血有何影響，結(jié)果顯示在發(fā)酵過程的第48 h以6.0 g/L的濃度添加十二烷基吡喃葡萄糖苷，檢測到104.5 mg·N/mL的氨基氮，638.3 mg·N/mL的非蛋白質(zhì)氮和766.3 mg·N/mL的可溶性氮，與對照組相比，分別增加了約0.7、3.7和3.8倍。YaoDawei等[22]通過屠宰場的污泥樣品中分離出一株短小芽孢桿菌NJM4。在初始pH值為8.67，接種量為4 ％，溫度為37°C，攪拌速度為200 rpm的條件下，短小芽孢桿菌NJM4可以在36 h內(nèi)將血紅蛋白降解達(dá)85 ％。俞煒洋等[23]研究發(fā)現(xiàn)，豬血發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)降解劑量、氨基酸含量顯著提高，并有部分蛋白質(zhì)降解成為小肽。陳宇等[24]采用復(fù)合菌株對豬血進行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)品血腥味很淡，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量達(dá)到了69 %，還含有多種游離氨基酸和微量元素。張濱等[25]采用多菌種發(fā)酵血液產(chǎn)品，得到的產(chǎn)物中可溶性蛋白含量達(dá)到20 %以上，還有濃郁的香氣。因此，通過微生物發(fā)酵血液生產(chǎn)利于動物吸收的小肽和氨基酸飼料，是目前解決動物廢棄血液污染的一個方向，該研究篩選出的菌株為動物副產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供一定的參考。

[1]方俊,盧向陽,馬美湖,等.利用微生物發(fā)酵豬血粉研究現(xiàn)狀[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004(9):93-95.

[2]汪正熙,王衛(wèi),張旭,等.畜禽血精深加工利用及其研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2020(6):67-71.

[3]楊葆春,靳義超,李全,等.動物血液資源的開發(fā)利用研究進展[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2011,41(5):44-46.

[4]郭秀云,張開臣,孟慶豐,等.飼用血粉加工工藝及其產(chǎn)品質(zhì)量研究進展[J].中國家禽,2019,41(19):50-54.

[5]杜昕,李誠,肖嵐,等.酶解牦牛血發(fā)酵液制備抗氧化肽工藝優(yōu)化[J].核農(nóng)學(xué)報,2017,31(2):325-333.

[6]魯云風(fēng),楊柯金,楊建偉,等.牛血發(fā)酵菌株發(fā)酵條件的正交設(shè)計優(yōu)化研究[J].飼料廣角,2010(14):27-28,38.

[7]康曉彤.羊肚菌菌種的分離與純化和形態(tài)鑒定[J].中國食用菌,2018,37(6):85-87.

[8]張韻,趙麗娜,曹琳,等.益生凝結(jié)芽孢桿菌的篩選及生物學(xué)特性研究[J].中國畜牧雜志,2017,53(1):109-114.

[9]胡廣衛(wèi),沈艷麗,趙全邦,等.青海部分地區(qū)蜱的形態(tài)學(xué)鑒定[J].今日畜牧獸醫(yī),2018,34(6):10-11.

[10]李彥華.革蘭氏染色原理[J].遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報,2006(S2):335-336.

[11]劉波,陶天申,葛慈斌,等.芽胞桿菌(第1卷):中國芽胞桿菌研究進展[M].北京:科學(xué)出版社,2015:34-69.

[12]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001:348-392.

[13]段德勇,汪雅琴,程天印.綿羊虱蠅形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2017,48(11):2181-2188.

[14]周雪雁,米瑪普尺,馬咸瑩,馬忠仁,丁功濤.1株血紅蛋白分解菌的分離鑒定及其蛋白酶活力測定[J].微生物學(xué)雜志,2020,40(02):66-71.

[15]柏曉輝,李長軍,肖玉蕓,等.木瓜果醋產(chǎn)品中木瓜蛋白酶活性維持研究[J].黃山學(xué)院學(xué)報,2018,20(03):56-59.

[16]沈萍,陳向東.微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,2018:43-47.

[17]鄭召君,張日俊.畜禽血液的開發(fā)與研究進展[J].飼料工業(yè),2014,35(17):65-70.

[18]Alfonso Clemente. Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition[J].Trends in Food ence & Technology,2000,11(7):254-262.

[19]Siemensma,AndréD,WeijerWJ,BakHJ.Theimportanceofpeptidelengthsinhypoallergenicinfantformulae[J]. TrendsinFoodence & Technology,1993,4(1):16-21.

[20]Wang L,Zhang B,Han J,et al.Optimization of hydrolysis condition of blood meal by Bacillus subtilis with response surface methodology[J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2015,104:112-117.

[21]Li D L,Wu B,Zhang X,et al.Enhancing hemoglobin peptide production from chicken blood fermentation by food-grade non-ionic surfactant[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry,2019,66(5).

[22]Yao D,Qu J,Chang P,et al.Production and characterization of alkaline protease from hemoglobin-degrading Bacillus pumilus NJM4 to produce fermented blood meal[J]. Journal of Food Science and Technology -Mysore-,2012,49(5):626-631.

[23]俞煒洋.厭氧固態(tài)法發(fā)酵豬血蛋白的研究[D].華僑大學(xué),2012.

[24]陳宇,付祖姣,莫湘濤,等.發(fā)酵血粉菌株的優(yōu)化選育[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003(5):32-36.

[25]張濱,馬美湖.豬血發(fā)酵飼料加工工藝研究[J].糧食與飼料工業(yè),2005(10):28-31.

Screening, Separation and Identification of Blood Protein Degrading Bacteria

Cai Xindong1，Wang Zhiyuan1，Ouzhu Ciren1，Ding Gongtao2，Zhang Haixia2

（1.College of Life Science and Engineering，Northwest Minzu University，Lanzhou，Gansu 730124；2. Biomedical Research Center，Northwest Minzu University，Lanzhou，Gansu 730030）

In order to screen out microbial strains capable of degrading blood proteins, the soil of Gannan slaughterhouse was used as a material, and the samples that were able to degrade blood proteins were screened out by diluting the samples on the basal medium and Columbia blood plate, the strain was named NwMcc01910043. The strain was tested for morphology, biochemical reaction, 16S rDNA sequence identification and its protease activity was determined. The test results showed that the NwMcc01910043 strain wasand its protease activity was 194.203U/mL. This experiment screened and identified a strain of blood protein decomposing bacteria NwMcc01910043, which provided a certain theoretical basis for the disposal of waste blood proteins in the slaughterhouse.

Blood protein degrading bacteria；Screening；Isolation；dentification

S476

A

2095-1205(2020)05-83-04

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.05.41

“科技助力經(jīng)濟2020”重點專項(SQ2020YFF0405583)；西北民族大學(xué)“雙一流”引導(dǎo)專項生物工程特色學(xué)科(10018703，1001070204)；西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費資金項目(31920190085)；教育部“創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目(IRT_17R88)；西北民族大學(xué)2020年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(202010742106)

蔡新東(1998- )，男，漢族，河南南陽人，在讀本科生，生物技術(shù)專業(yè)。

張海霞