文│金穗華［農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南京）］

豬冷凍精液可以長(zhǎng)期保存，能顯著提高種公豬利用率，擴(kuò)大其基因傳播范圍，同時(shí)也是豬遺傳資源生物技術(shù)靜態(tài)保存的主要方法之一。在豬冷凍精液生產(chǎn)過程中，選擇合適的冷凍保護(hù)劑對(duì)改善解凍后精子復(fù)蘇率、活力、頂體完整率、存活時(shí)間、畸形率等精液質(zhì)量指標(biāo)至關(guān)重要。

自制豬冷凍精液試劑簡(jiǎn)單方便，可以按照需要的數(shù)量隨時(shí)配制。自制試劑大多使用BTS（beltsville thawing solution）配方，該配方為EDTA 0.125克，檸檬酸三鈉0.6克，氯化鉀0.075克，碳酸氫鈉0.125克，葡萄糖3.7克，青霉素鈉0.06克，硫酸鏈霉素0.1克，純化水100毫升。應(yīng)用BTS配方生產(chǎn)的冷凍精液解凍后精子復(fù)蘇率達(dá)到50%左右，頂體完整率能達(dá)到40%。

國(guó)內(nèi)市面上效果較好、使用較多的豬冷凍精液保護(hù)劑為TYP-5田園奧瑞豬凍精試劑套裝。TYP-5田園奧瑞豬凍精試劑套裝2018年上市，性能穩(wěn)定高效，所生產(chǎn)的豬冷凍精液復(fù)蘇率達(dá)到70%～90%，頂體完整率60%～80%，廣泛應(yīng)用于豬冷凍精液商品化生產(chǎn)和地方品種豬冷凍精液保種。凍精試劑的正確使用方法和步驟至關(guān)重要，使用不當(dāng)可能導(dǎo)致精子“全軍覆沒”。

一、TYP-5豬冷凍精液試劑介紹

1.TYP-5豬冷凍精液試劑組成。TYP-5豬冷凍精液試劑套裝含有A、B、C、D、E五種精液冷凍不同階段的成分，分別為：A為預(yù)稀釋劑、B為冷凍冷藏基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液、C和D為冷凍輔助劑、E為解凍劑。B+蛋黃對(duì)應(yīng)為冷藏保護(hù)劑、B+C+D+蛋黃對(duì)應(yīng)為冷凍保護(hù)劑。其中，預(yù)稀釋劑和解凍劑為冷凍精液專用，有別于常溫豬精液稀釋粉（表1）。

表1 TYP-5豬冷凍精液試劑套裝組成表

二、TYP-5豬冷凍精液試劑使用方法

1.采精預(yù)稀釋。將豬凍精試劑A溶于1升雙蒸水中，充分混勻，預(yù)熱至37℃，將鮮采原精稀釋一倍。一袋豬凍精試劑A稀釋3～4頭份種公豬精液。同時(shí)，檢測(cè)原精質(zhì)量，記錄密度、體積、活率（運(yùn)動(dòng)精子率）、活力（前向運(yùn)動(dòng)精子率）和畸形率，用于凍精的精液活率應(yīng)在90%以上，活力在80%以上，畸形率在10%以下。（每袋豬凍精試劑A拆開后為成分不同、質(zhì)量也不相同的A1和A2兩小包，必須同時(shí)使用）。

2.將稀釋后的鮮精于室溫（25℃）靜置1小時(shí)，轉(zhuǎn)入17℃恒溫箱，平衡2～3小時(shí)，最長(zhǎng)不超過24小時(shí)。有條件的推薦使用程控平衡儀，可以程序化精準(zhǔn)控制降溫溫度、降溫時(shí)間、降溫速率等。

3.將一瓶豬凍精試劑B溶于400毫升雙蒸水中，充分溶解，制成基礎(chǔ)液，稀釋6～8頭份種公豬精液。

4.取新鮮雞蛋，去蛋清，將完整蛋黃置于滅菌無絨吸水紙上，將剩余蛋清吸凈，用注射器抽取蛋黃100毫升，加入配好的基礎(chǔ)液中，充分混勻，制成I液。

5.取I液276毫升，加入豬凍精試劑C（18毫升），豬凍精試劑D（6毫升），制成Ⅱ液300毫升。

6.將I液置于17℃、Ⅱ液置于4℃恒溫箱冷藏，待用。

7.鮮精充分平衡后，搖勻，防止精子假死，17℃條件下800～900克離心10～15分鐘，去掉上清液。離心前記錄離心瓶重W0（克），去上清后，離心瓶加精子重W1（克），估得精子體積V1（毫升）=W1-W0。

筆者提出了一種新型綜掘巷道新型超前支護(hù)設(shè)備，具有高度和寬度可伸縮調(diào)整、適應(yīng)不同巷道截面尺寸等功能，并利用特殊結(jié)構(gòu)處理的伸縮梁與頂梁，使得支架在展開時(shí)能夠與頂板良好接觸。同時(shí)論述了該裝備的關(guān)鍵組成部分，即超前支架的結(jié)構(gòu)及工作原理，并進(jìn)行了應(yīng)力分析，分析的結(jié)果為綜掘巷道超前支護(hù)提供了技術(shù)支撐。

8.用17℃的I液重懸浮精子，使精子密度達(dá)到20億/毫升。在離心較為徹底的情況下可以忽略上清中的精子，但若離心不徹底，上清精子較多，則總精子應(yīng)該減去上清中的部分，即加入I液的體積V2＝原精總精子數(shù)（億）-上清液體積（毫升） ×上清液精子密度（億/毫升）/20（億/毫升）-V1（毫升）。若精清分離不徹底，可能會(huì)使V2/V1過小，甚至出現(xiàn)負(fù)值，影響精液后續(xù)的降溫，此時(shí)應(yīng)調(diào)低凍精目標(biāo)密度，或者重新離心，使得V2/V1≥1。

9.I液重懸浮后的精子置于盛有17℃水的燒杯中，于4℃冰箱或低溫操作柜中降溫平衡，注意用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)溫度，使精液在2.5～3小時(shí)緩慢降溫至4～5℃，并在4～5℃平衡0.5～1小時(shí)。有條件的推薦使用程控平衡儀，可以程序化精準(zhǔn)控制降溫溫度、降溫時(shí)間、降溫速率等。

10.精液在4℃平衡后，加入Ⅱ液，稀釋一倍，其體積V3＝V1+V2?；靹蚝罅⒓丛诘蜏夭僮鞴裰羞M(jìn)行0.5毫升細(xì)管灌裝操作，并在細(xì)管托架上碼好。

11.在精液進(jìn)行0.5毫升細(xì)管灌裝的同時(shí)啟動(dòng)程序冷凍儀，將腔室溫度降至4～5℃。另一邊同時(shí)將兩個(gè)水浴鍋分別設(shè)置50℃和30℃（26～32℃），并按照需要量每20毫升雙蒸水溶解1克豬凍精試劑E，于30℃（26～32℃）水浴鍋預(yù)熱備用。

12.灌裝完畢后，迅速將碼好的細(xì)管精液放入冷凍儀中，設(shè)置豬冷凍精液降溫曲線，啟動(dòng)冷凍程序，待程序跑完后取出冷凍精液細(xì)管浸入液氮中。冷凍降溫速率控制在4℃至1℃為1.5℃/分鐘，1℃以后降溫速率達(dá)到-30℃/分鐘。如果使用熏蒸法手工制作，精液細(xì)管所在位置溫度控制在-120～-80℃。

三、TYP-5豬冷凍精液解凍劑使用方法

1.每頭豬至少取2支細(xì)管解凍進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)管在50℃解凍16秒，剪去細(xì)管兩端，將精液移入4毫升離心管中，用預(yù)熱好的解凍稀釋液稀釋。

2.冷凍精液在3 0℃（26～32℃）恢復(fù)15～20分鐘后在顯微鏡下檢測(cè)凍精解凍后質(zhì)量。同時(shí)，根據(jù)解凍情況決定精液是否留存。

3.將決定留存的精液裝入拇指管和紗布袋中，轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存，并做好標(biāo)記。標(biāo)記信息至少包括日期和豬號(hào)。

4.輸精時(shí)，解凍精液用配好的解凍稀釋液稀釋約10倍，在30分鐘內(nèi)進(jìn)行子宮深部輸精，建議一個(gè)輸精劑量的有效精子總數(shù)不低于同等條件下的鮮精有效精子總數(shù)。

四、TYP-5豬冷凍精液試劑保存

1.儲(chǔ)存環(huán)境最好為陰涼干燥，避免高溫和潮濕。長(zhǎng)期儲(chǔ)存2～8℃；短期儲(chǔ)存于室溫保存。

2.有效期。6個(gè)月。

五、TYP-5豬冷凍精液試劑使用注意事項(xiàng)

1.凍精試劑開封后盡快使用。

2.避免高溫和反復(fù)凍融。

3.使用新鮮雞蛋卵黃。

4.豬凍精試劑D冷藏會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶，使用前可用30～40℃溫水加熱使之重新溶解。

受非洲豬瘟疫情及新冠肺炎疫情影響，豬鮮精運(yùn)輸調(diào)配受阻和生物安全隱患影響到生豬生產(chǎn)的繁殖需求，豬冷凍精液長(zhǎng)期保存的特點(diǎn)恰好可以有效彌補(bǔ)繁殖的短板。目前，豬冷凍精液技術(shù)研究越來越多并逐步進(jìn)入商品化生產(chǎn)應(yīng)用階段，科學(xué)配制更優(yōu)化的冷凍精液試劑配方，提高精子抗氧化和抗凍耐凍能力，改善精子凍后活力質(zhì)量，有助于豬冷凍精液的推廣應(yīng)用，對(duì)加快恢復(fù)生豬生產(chǎn)、大力推動(dòng)養(yǎng)殖業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)具有重要意義和重大價(jià)值。