牟埈輝，王巧俠，羅 彤，趙 俊，賽音朝克圖，李志剛△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065)

抑郁癥是一種以持續(xù)情緒低落為主要癥狀的精神情感障礙性疾病，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和高自殺率的特點[1]，給社會、個人和家庭帶來巨大的損失和負擔(dān)，近年來，抑郁癥的發(fā)病逐漸呈年輕化趨勢。目前為止，抑郁癥的發(fā)病機制尚未明確，有效治療率較低，近年來研究發(fā)現(xiàn)針刺療法能緩解抑郁癥患者焦慮、失眠、飲食和消化等方面的癥狀[2-3]，且這種療法安全無副作用，能對病人有整體調(diào)節(jié)的作用。

關(guān)于抑郁癥發(fā)病機制的假說很多，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子假說BDNF被認(rèn)為與抑郁癥的發(fā)生以及抗抑郁的治療有極其重要的作用。既往關(guān)于BDNF的研究很多，研究其發(fā)生作用的通路較為分散，且研究主要集中在腦區(qū)的海馬組織，對中縫核的研究較少，本實驗通過觀察中縫核組織中P11、tPA和BDNF的表達情況來對比觀察電針對抑郁癥的治療作用，并試說明電針調(diào)控P11、tPA和BDNF發(fā)揮抗抑郁作用可能的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級SD雄性大鼠購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]，體質(zhì)量170～190 g，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物室，空氣流通，相對濕度60%，12 h晝夜循環(huán)光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進行體質(zhì)量測量和糖水實驗評價行為學(xué)，選取符合條件的大鼠32只，應(yīng)用隨機數(shù)字表將大鼠分為正常組(C)、模型組(D)、藥物組(M)和電針組(EA)4組，每組8只。C組大鼠群養(yǎng)，正常飼養(yǎng)28 d，不接受任何刺激。其余各組大鼠均單籠孤養(yǎng)并結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性刺激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)的方法進行抑郁造模。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 實驗試劑 鹽酸氟西汀膠囊(禮來蘇州制藥有限公司)；針具：0.30 mm×13 mm華佗牌無菌針灸針;PCR引物[生工生物工程(上海)有限公司];Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司);Real-time PCR擴增試劑盒(北京中原領(lǐng)先科技有限公司);DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega);BDNF抗體(美國，Novus Biologicals，NBP1-46750);p11抗體(美國Novus Biologicals，NBP1-89370);tPA抗體(美國，Abcam，ab18987);CY3標(biāo)記驢抗山羊IgG(武漢塞維爾生物科技有限公司，GB21404)。

1.2.2 儀器 HL202韓式電針儀:Real-Time PCR儀(美國 ABI 7500);激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus,FV1000-LX81);4℃低溫高速離心機(美國Thermo)。

1.3 模型制備

正常組動物不接受任何刺激和治療，自由飲水，群養(yǎng)。其他3組均采用改良的慢性應(yīng)激模型結(jié)合孤養(yǎng)，具體方法為：予7種不同的刺激，每日隨機采取1種，但同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)且每種刺激至少3次；刺激方式分別為4 ℃冷水游泳5 min、晝夜顛倒24 h、禁食24 h、夾尾3 min、禁水24 h、籠位傾斜45° 24 h、潮濕環(huán)境24 h，共28 d。

1.4 實驗干預(yù)

1.4.1 C組 動物群養(yǎng)，自由飲水進食，不接受任何刺激。

1.4.2 D組 大鼠孤養(yǎng)，接受28 d慢性應(yīng)激造模處理。

1.4.3 EA組 在應(yīng)激1 h后進行電針干預(yù)，參照《實驗針灸學(xué)》[4]，平刺百會、印堂穴，深度均為0.5～1 cm，連接電針，電流1 mA，強度以大鼠頭部微顫為宜，電針頻率為2 Hz,每次留針30 min，1次/d，其他操作同模型組。

1.4.4 M組 在應(yīng)激1 h后進行藥物干預(yù)，將氟西汀用0.9%生理鹽水配成1 mg/mL溶液，按2 mg/kg灌胃給藥，1次/d，連續(xù)28 d，其他操作同模型組。

1.5 取材

實驗的第28天，用20%烏拉坦(0.7 mL/100 g)對大鼠進行腹腔注射麻醉，迅速斷頭后，在超凈臺冰塊上分離出中縫核組織，每組中的2只置于4%多聚甲醛中，其他置于滅菌的凍存管并放于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 體質(zhì)量檢測 在實驗前1 d和第28天分別進行體質(zhì)量檢測，計算并比較各組大鼠的體質(zhì)量變化。

1.6.2 糖水消耗實驗 實驗前第1天和第28天,各組大鼠在禁水24 h后按1 g/40 mL給予1%蔗糖水，并測定1 d內(nèi)大鼠蔗糖水的消耗量。

1.6.3 免疫熒光染色 中縫核組織經(jīng)4%多聚甲醛4 ℃固定12 h，將固定組織取出自來水沖洗，脫水浸蠟，包埋，放入石蠟切片機切片，厚度為5～6 μm，切片置于-20 ℃保存，烤片后脫蠟復(fù)水，微波爐抗原修復(fù)20 min。染色步驟：切片熱修復(fù)后，恢復(fù)至室溫，PBS洗3次，每次5 min；滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，甩掉多余封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的一抗(BDNF為1∶500；p11為1∶200；tPA為1∶200)，將切片放入濕盒內(nèi)，4 ℃過夜；次日PBS(PH=7.4)沖洗3次，每次5 min；滴加熒光標(biāo)記的二抗，室溫30 min,PBS(PH=7.4)沖洗3次，每次5 min；DAPI封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察3個指標(biāo)在中縫核中的表達情況。

1.6.4 逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 將組織從液氮中取出，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮進行快速研磨，破碎標(biāo)本，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測RNA濃度。采用美國Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green法設(shè)計引物，P11受體的上游引物為5′-ATGGAGCATGCCATGGAAAC-3′，下游引物為5′-AACCCAGGGAACTCCCTTTC-3′，tPA受體的上游引物為5′-AGAGTGTGAGCTTTCTGGCT-3′，下游引物為5′-TGGACGGATACAGTCTGACG-3′，BDNF受體的上游引物為5′-TGCTGGATGAGGACCAGAAG-3′，下游引物為5′-TTCCTCCAGCAGAAAGAGCA-3′。Real-Time PCR反應(yīng)程序為：①預(yù)變性：50 ℃孵化2 min，94 ℃預(yù)變性10 min；②PCR反應(yīng)：94 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，45個循環(huán)；③溶解曲線生成：94 ℃預(yù)變性1 min，55 ℃退火1 min，55 ℃退火10 s，并以每循環(huán)增加0.5 ℃的溫度進行80個循環(huán)；反應(yīng)完成后軟件自動計算出每個標(biāo)本的循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct值)。用相對定量2-ΔΔCT法分析結(jié)果，mqookoop用各個樣本的目的基因的Ct值﹣各個樣本的看家基因(GAPDH)的Ct值，得到delta Ct；用delta Ct-對照組的大概均值，得到delta delta Ct(-ΔΔCT)。用2-ΔΔCT計算各個樣本目的基因的表達變化。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量檢測比較

應(yīng)激處理前，各組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。應(yīng)激處理第28天，各組大鼠的體質(zhì)量均有所增加，其中D組大鼠的體質(zhì)量顯著低于C組(P<0.01)，M組和EA組大鼠的體質(zhì)量顯著高于D組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化的比較

2.2 各組糖水消耗百分比比較

應(yīng)激處理前，各組大鼠的糖水消耗百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。應(yīng)激處理的第28天，D組大鼠的糖水消耗百分比要顯著低于C組(P<0.01);M組和EA組的大鼠糖水消耗百分比顯著高于D組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠糖水消耗百分比實驗

2.3 各組免疫熒光染色結(jié)果

免疫熒光染色結(jié)果見于封三彩圖1～3，為了對比電針治療抑郁癥的療效，選取了D組和EA組的對比圖。實驗結(jié)果顯示D組P11、tPA、BDNF 3個指標(biāo)的陽性染色的細胞和染色強度明顯低于C組，而M組和EA組3個指標(biāo)在中縫核中的表達程度高于D組，這與PCR結(jié)果一致。

2.4 各組PCR結(jié)果

經(jīng)28 d的實驗干預(yù)后，經(jīng)應(yīng)激處理的各組大鼠中縫核組織中的BDNF、P11、tPA mRNA含量有不同程度的降低，其中D組較C組明顯降低(P<0.05)，M組和EA組顯著高于模型組(P<0.05)。而經(jīng)電針和藥物治療后的大鼠海馬組織中3種物質(zhì)mRNA的含量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但仍低于正常組。見表3。

表3 各組大鼠中縫核組織中BDNF、P11、tPA mRNA含量比較

3 討論

隨著電子技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于抑郁癥的影像學(xué)研究也日趨豐富，大量研究表明，大腦前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核群是與情感、情緒和應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切的腦區(qū)，其中海馬和中縫核群有相互的纖維和功能聯(lián)系。關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機制有很多假說，其中近年來關(guān)于細胞因子假說的研究較多。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)具有保護神經(jīng)元、促進神經(jīng)元分化、增殖和再生的作用，并且與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)，大量的研究證明各種原因?qū)е履X內(nèi)BDNF減少都會導(dǎo)致抑郁，BNDF的含量與抑郁癥的嚴(yán)重程度呈負相關(guān)[5]。而且抗抑郁的藥物是通過增加腦內(nèi)BDNF的含量來提高突觸的可塑性和促進神經(jīng)元的生存來實現(xiàn)治療抑郁癥的效果的[6]。P11蛋白(又稱S100A10)是S100EF手形蛋白家族的一員，在與抑郁癥相關(guān)的腦區(qū)內(nèi)廣泛表達，如海馬、中縫核等腦區(qū)[7]，參與胞吞、胞吐及細胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，能調(diào)節(jié)抑郁樣行為，并對抗抑郁藥物的起效有重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)抑郁模型小鼠腦內(nèi)的P11的含量很低[9]，P11基因敲除后的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的抑郁行為，且服用抗抑郁藥物無效[10-12]，而P11過表達后能顯著改善小鼠的抑郁行為，產(chǎn)生抗抑郁作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)抑郁模型小鼠外周血白細胞P11 mRNA表達下降，在經(jīng)抗抑郁治療8周后其表達上調(diào)[13]。而P11過表達后能顯著改善小鼠的抑郁行為產(chǎn)生抗抑郁作用[9]。組織纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, tPA)是腦內(nèi)主要的纖溶酶原激活物，tPA在大腦皮質(zhì)內(nèi)廣泛表達于海馬、中縫核等不同腦區(qū)，與學(xué)習(xí)、記憶、精神緊張、突出可塑性和成癮相關(guān)[14]。研究表明P11蛋白的C端氨基酸與tPA結(jié)合后啟動并激發(fā)tPA的活性，tPA敲除后會產(chǎn)生抑郁樣行為，而tPA過表達則會引起B(yǎng)DNF的表達上升[15]。因此本研究選擇BDNF、P11和tPA作為檢測指標(biāo)，進一步探討慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的中縫核腦區(qū)，電針治療抑郁癥的可能機制及療效。

大量研究證明，針刺對慢性應(yīng)激模型大鼠的療效顯著，百會、印堂是抑郁癥治療的主要穴位[16]，能平肝潛陽、醒腦開竅、鎮(zhèn)靜安神，共奏調(diào)和陰陽之效。電針和傳統(tǒng)針刺均有改善抑郁癥狀的特點，但對于首發(fā)性抑郁，電針見效時間更短、效果更快[17]。研究表明對百會、印堂電針治療后能提高抑郁大鼠腦內(nèi)BDNF的含量[18-19]，能改善抑郁大鼠的行為學(xué)[20]，對大鼠的體質(zhì)量有良性調(diào)整作用[21]，在改善抑郁方面起效快、持續(xù)效應(yīng)時間更長[22]

而PCR的結(jié)果顯示模型組大鼠BDNF、P11、tPA的mRNA表達顯著低于正常組，而經(jīng)電針和藥物治療后大鼠的表達量要明顯高于模型組。免疫熒光染色的結(jié)果與PCR結(jié)果相一致，在中縫核群里均有三者的表達，且陽性表達程度與PCR結(jié)果相一致。在實驗開始的前1 d和實驗的第28天分別對大鼠的體質(zhì)量和行為學(xué)進行觀察，體質(zhì)量顯示模型組大鼠的體質(zhì)量較正常組明顯下降，而經(jīng)藥物和電針治療后的大鼠體質(zhì)量較模型組有不同程度的升高。而在糖水偏好實驗中可以看到模型組大鼠糖水消耗百分比較正常組顯著減少，表現(xiàn)出明顯抑郁癥“快感缺失”癥狀。說明電針影響抑郁癥的發(fā)生和治療抑郁癥的機制可能是通過P11-tPA-BDNF通路來發(fā)揮作用的。

與藥物治療抑郁癥相比，電針干預(yù)后的各個指標(biāo)雖在表達量上略高于藥物，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，后續(xù)研究中可以考慮適當(dāng)增加樣本量來研究差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。