馬 英,劉 星,王玥琪,楊春壯

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦中風(fēng)是常見的急性腦血管病，一直是基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的重點、難點和熱點。臨床實踐證實頭針能夠改善中風(fēng)患者的神經(jīng)功能缺損，促進功能恢復(fù)，減輕腦水腫，且取穴精簡、操作簡便、不易誘發(fā)肌痙攣，是中醫(yī)治療缺血性中風(fēng)的常用且有效的方法[1]。本研究采用線栓法制作大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型，以電針百會穴透太陽穴為干預(yù)措施，觀測針刺后MCAO大鼠大腦海馬內(nèi)巢蛋白(Nestin)和神經(jīng)生長因子(NGF)表達的變化規(guī)律，從中樞神經(jīng)功能重建和再生角度，探尋針刺運動區(qū)治療缺血性中風(fēng)的機制。

1 材料

1.1 動物

所采用SPF級SD大鼠由牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心提供[實驗動物許可證號:SYXX(黑)2015-007]，體質(zhì)量200～350 g，雌雄各半。

1.2 主要試劑

兔抗Nestin多克隆抗體(BA1289)(博士德生物公司)；PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR引物由上海生物工程公司合成。

2 方法

2.1 動物分組

72只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和針刺組，每組各24只。

2.2 MCAO造模

參照馬英等相關(guān)研究[2]方法制作。先以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，頸前正中縱行切口，長約2.0～2.5 cm，鈍性分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈(CCA)，并穿一線備用。分離頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，結(jié)扎ECA，用微動脈夾夾閉ICA，在近CCA分叉處剪一“V”字型切口，將直徑為0.2～0.25 mm尼龍線頭端涂抹硅膠脂，沿CCA插入ICA，同時放開微動脈夾，輕輕牽拉使栓線進入顱腔，插入深度18～20 mm，稍遇阻力即停，造成MCA阻塞。將CCA上的備線扎緊。1 h后緩慢退出部分線栓進行再灌注。假手術(shù)組只做手術(shù)暴露頸部動脈，結(jié)扎CCA，但不予線栓。

2.3 針刺方法

按中國針灸學(xué)會實驗針灸委員會實驗動物穴位圖譜[3]，選取大鼠頭穴運動區(qū)，即“百會”穴透“太陽”穴，由頂骨正中向耳前方斜刺。用0.19 mm×10 mm毫針于術(shù)后大鼠清醒即開始行雙側(cè)針刺并接G6805-Ⅱ型電針治療儀(四川恒明科技開發(fā)有限公司)，斷續(xù)波，以大鼠安靜耐受微顫為度，每天針刺1次，留針30 min。模型組和假手術(shù)組略做捆綁，不作針刺處理。

2.4 橫木行走實驗

治療第3天、7天、14天后處死前分別進行。橫木是長80 cm、寬2.5 cm的方木，距離地面10 cm平放，使大鼠在橫木上行走[4]。

評分標準:0分:上即跌落；1分:可滯留但不能行走；2分:可行走，時有跌落；3分:可行走，但左側(cè)肢體不能主動向前移動；4分:行走時有多于50%行程的滑步；5分:行走時有少于50%行程的滑步；6分:行走時沒有滑步。

2.5 樣本采集

治療第3天、7天、14天后禁食過夜，各組動物分別隨機選取8只用10%水合氯醛腹腔麻醉后，斷頭取腦，迅速在冰盤上修取MCA供血區(qū)(右側(cè)缺血側(cè))的海馬。

2.6 Western blot法檢測Nestin蛋白表達

取海馬組織加入裂解液，按說明書提取總蛋白，測定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含脫脂奶粉的TBS室溫封閉2 h，加入Nestin抗體(兔抗大鼠Nestin抗體，1∶200) 4℃孵育過夜。用含Tween-20的 TBS洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶2 000) 室溫孵育1 h，重復(fù)洗滌3次，ECL液顯色，X片顯影、定影。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析測定Western blot條帶灰度值，結(jié)果以Nestin與內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。

2.7 實時定量RT-PCR檢測NGF mRNA基因表達

采用Trizol一步法試劑盒提取神經(jīng)組織細胞總RNA，鑒定總RNA純度、完整性，取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA。用于反應(yīng)的引物分別為：NGF，上游引物為5′-TCCACCCACCCAGTCTTCCA-3′，下游引物為5′-GCCTTCCTGCTGAGCACACA-3′；GAPDH，上游引物為5′-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′，下游引物為5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3。表達采用2-ΔΔCT方法計算，每個樣品獨立檢測3次，所得均值以GAPDH為內(nèi)參統(tǒng)計。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠橫木行走實驗評分

表1顯示，假手術(shù)組在第3、7、14天橫木行走實驗評分均為6分，表明神經(jīng)功能沒有出現(xiàn)缺損。與假手術(shù)組比較，模型組和針刺組評分均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且在第14天，針刺組比模型組評分提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠橫木行走實驗評分比較

3.2 各組大鼠海馬Nestin蛋白表達

圖1顯示，假手術(shù)組、模型組和針刺組均可見Nestin表達。

圖1 各組腦缺血大鼠Western blot法Nestin蛋白表達

圖2顯示，Nestin蛋白表達水平模型組與假手術(shù)組比較顯著降低(P<0.05);針刺組明顯高于模型組(P<0.01),且14 d達最高水平。

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖2 各組大鼠海馬Western blot法定量檢測Nestin蛋白表達

3.3 各組大鼠海馬NGF mRNA表達

圖3顯示，假手術(shù)組NGF mRNA表達在術(shù)后并無明顯區(qū)別，模型組自第7天提升量最為明顯，接近假手術(shù)組的水平，14 d表達下降。針刺組與模型組比較3 d、7 d、14 d都有顯著差異(P<0.01)。

注：與模型組比較，**P<0.01。圖3 各組大鼠海馬NGF mRNA的表達水平

4 討論

缺血性腦中風(fēng)屬中醫(yī)“風(fēng)”“癆”“鼓”“膈”四大難證之一[5]。迄今為止，腦中風(fēng)造成的神經(jīng)細胞損傷和死亡尚無確定的治療方法。因此，如何積極有效地促進腦缺血后受損腦組織的修復(fù)與神經(jīng)功能恢復(fù)是目前研究的重點、難點和熱點，也始終是人們追求的理想的治療境界。近現(xiàn)代中醫(yī)認為中風(fēng)的主要原因是肝陽化風(fēng)、氣血并逆、直沖犯腦[6-7]。“病變在腦，首取督脈”，督脈有溝通陰陽、總攝諸經(jīng)之能力，為治療缺血性腦中風(fēng)的首選。百會穴為督脈要穴。選取運動區(qū)即百會穴透太陽穴，在此處行焦氏頭針[8]有醒神開竅、安神定志、平肝熄風(fēng)的作用。運動區(qū)貫穿頭部頂、額、顳3區(qū)，形成百會-承靈-懸厘-太陽穴的一穴區(qū)貫穿多穴的特點，且跨越3條陽經(jīng)(督脈、足太陽膀胱經(jīng)、足少陽膽經(jīng))，從頭至足，縱貫全身，實可統(tǒng)調(diào)一身之陽氣。電針刺激后將產(chǎn)生的生物效應(yīng)傳送至大腦皮層，使穴位刺激點與病灶興奮點間相互聯(lián)系、相互作用，激活、加強休眠狀態(tài)下的腦細胞和受損腦神經(jīng)細胞的修復(fù)能力，促進腦組織的可塑性調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)血管舒縮功能，改善神經(jīng)功能障礙，增進功能恢復(fù)[9]。

肢端精細運動和協(xié)調(diào)功能損害是腦缺血損傷后的主要癥狀。利用橫木行走實驗可較好地檢測神經(jīng)功能障礙。本實驗結(jié)果顯示，模型組和針刺組的評分均顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)。模型組自第3天開始評分升高，第7天最高，第14天下降，提示MCAO大鼠神經(jīng)功能在一定時間段可有部分代償性自我修復(fù)能力，但這種能力持續(xù)短暫。與模型組比較，針刺組隨著治療時間的延長橫木實驗評分呈現(xiàn)明顯升高趨勢，針刺14 d差異具有差計學(xué)意義(P<0.01)，表明針刺運動區(qū)能明顯改善腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損的癥狀，進而降低缺血缺氧對組織的損傷，促進受損區(qū)的修復(fù)和功能重建，且治療效果隨著針刺時程的延長而提高。

巢蛋白(Nestin)亦稱神經(jīng)上皮干細胞蛋白，是一種Ⅵ型中間絲蛋白，在神經(jīng)前體細胞一過性表達，當(dāng)神經(jīng)前體細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元之后由其他的中間絲蛋白所取代，故與神經(jīng)細胞分化密切相關(guān)[10-11]，常作為NSCs(神經(jīng)干細胞)特異性的標記物。Nestin為 NSCs的自我更新所需[12]。本實驗結(jié)果表明假手術(shù)組、模型組和針刺組海馬組織內(nèi)均可見Nestin表達。腦缺血損傷發(fā)生初期，模型組中Nestin蛋白表達水平較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，這主要是因為大腦中動脈供血區(qū)組織破壞嚴重，難以恢復(fù)對損傷的有效修復(fù)，不能進一步激活機體的自我保護機制。已有研究表明，機體成年后，室管膜細胞基本處于“靜止”狀態(tài)，而一旦遭受損傷，則可應(yīng)激進入活躍的分化狀態(tài)。但這種內(nèi)源性神經(jīng)細胞的再生并不能很好修復(fù)缺血區(qū)損傷，加之誘導(dǎo)NSCs遷移與分化的微環(huán)境條件不具備，因此需要采取有效的干預(yù)措施來增強NSCs的增殖與分化并促進神經(jīng)功能的恢復(fù)[13]。本實驗經(jīng)電針刺激運動區(qū)后，針刺組中Nestin蛋白表達水平明顯高于模型組(P<0.01),且14 d組為表達最高。這表明電針運動區(qū)可激活內(nèi)源性NSCs，使其增殖和分化，幫助神經(jīng)元的再生和細胞骨架的重構(gòu)，促進神經(jīng)組織的重建和神經(jīng)功能的恢復(fù)。

NGF對調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的生發(fā)、分化、維持成熟神經(jīng)細胞生存以及對損傷神經(jīng)的修復(fù)具有重要意義及臨床價值[14-15]。本實驗假手術(shù)組NGF mRNA表達無明顯差異。模型組自第3天開始表達升高，第7天達到高峰，接近假手術(shù)組水平，到第14天表達下降。提示腦缺血損傷后可應(yīng)激性上調(diào)NGF表達水平，改善神經(jīng)組織的病理狀態(tài)，保護和修復(fù)受損神經(jīng)元，減輕神經(jīng)損害。但此內(nèi)源性修復(fù)機制上調(diào)NGF作用短暫、表達有限，難以對損傷神經(jīng)元產(chǎn)生全面持久保護，效應(yīng)有限。針刺組不同時間點NGF mRNA的表達均高于模型組(P<0.01)，說明電針運動區(qū)可有效提高MCAO大鼠海馬內(nèi)NGF mRNA持續(xù)性表達，穩(wěn)定神經(jīng)細胞存活的內(nèi)部微環(huán)境和營造適合神經(jīng)細胞生長的外部微環(huán)境，對受損神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用，并對遭受可逆性損傷的神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞進行修復(fù)，減緩腦缺血后神經(jīng)細胞的死亡從而改善相伴的神經(jīng)功能缺損癥狀[16]。

綜上所述，腦缺血損傷后腦NGF mRNA代償性增加的自我保護機制促進了神經(jīng)元和神經(jīng)細胞的修復(fù)，這種自我保護非常有限，而電針刺激運動區(qū)的介入可以有效促進NGF mRNA持續(xù)性表達，改善神經(jīng)細胞存活的內(nèi)、外部微環(huán)境，同時激活了處于“靜止”狀態(tài)的內(nèi)源性NSCs，使其增殖和分化，促進神經(jīng)組織的重建和神經(jīng)功能的恢復(fù)。