夏 雨，范榮波，易華西,張 冬，梁晶晶，蔡玉勇，張?zhí)m威**

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東 煙臺(tái) 265100；3.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東 青島 266000)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)又稱(chēng)南美白對(duì)蝦、白對(duì)蝦，因其高產(chǎn)量、廣鹽性、良好的適應(yīng)能力與良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值被廣泛養(yǎng)殖。益生菌的定義是能夠改善腸道菌群生態(tài)平衡，對(duì)宿主有益的活微生物制劑[1]。益生菌具有拮抗病原菌、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫等特點(diǎn)而最初應(yīng)用在豬和牛等陸生動(dòng)物的飼料添加劑中[2]。益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用最早始于30多年前，但是受到重視卻是在21世紀(jì)之后[3]。

在過(guò)去的30多年，有一些菌株已經(jīng)被鑒定認(rèn)為是益生菌并在在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有一些應(yīng)用，Noor Uddin等評(píng)估了在越南對(duì)蝦養(yǎng)殖中常用的7種益生菌產(chǎn)品中的細(xì)菌種類(lèi)含量，其中以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)為主[4]，芽孢桿菌和乳酸菌是使用最為廣泛的益生菌[5]。對(duì)于益生菌的篩選，其對(duì)致病菌的抑制能力與對(duì)腸黏膜的黏附能力是潛在益生菌重要的預(yù)篩指標(biāo)[2]。Tepaamorndech等通過(guò)對(duì)多株弧菌致病菌的抑制作用篩選出B.aryabhattaiTBRC8450，將其添加到飼料中發(fā)現(xiàn)其可以提高對(duì)哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)的抵抗能力并減少凡納濱對(duì)蝦腸道弧菌的豐度[6]，Zokaeifar等發(fā)現(xiàn)對(duì)哈維氏弧菌和副溶血弧菌(V.parahemolyticus)有抑制作用的枯草芽孢桿菌L10和枯草芽孢桿菌G1能提高凡納濱對(duì)蝦胃腸道中的芽孢桿菌數(shù)量并減少弧菌數(shù)量，并提高其生長(zhǎng)表現(xiàn)與對(duì)病原菌的抵抗能力[7]。凡納濱對(duì)蝦生活鹽度較廣，其在鹽度5～50下均可存活[8]，而有些益生菌在高鹽度下并不能存活，因而將鹽度也作為一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。與一些在水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制疾病方法的單一機(jī)制模式不同，益生菌可以從多方面給宿主帶來(lái)好處，這在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中存在著巨大的潛力[9]。

水產(chǎn)品的健康狀況依賴(lài)于或受制于直接生存環(huán)境，因?yàn)樗鼈兣c各種各樣的微生物密切接觸，包括可以在動(dòng)物外部和內(nèi)表層定植的致病菌和條件致病菌，而腸道菌群形成一個(gè)天然的防御屏障，對(duì)腸道上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝起著保護(hù)作用，因此，建立正?；虮Ｗo(hù)性微生物群是排除潛在的入侵者和維持機(jī)體健康狀態(tài)的關(guān)鍵因素[10-11]。Luis-Villasenor等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的混合物可提高白對(duì)蝦存活率和促進(jìn)幼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育，還可提高幼蝦腸道菌群的多樣性和均勻度，幫助保持對(duì)蝦腸道內(nèi)菌群的平衡[12]。

為從實(shí)驗(yàn)室前期研究的潛在益生菌中篩選出對(duì)凡納濱對(duì)蝦有益生功能的菌株，本研究從對(duì)凡納濱對(duì)蝦常見(jiàn)致病菌的抑制作用、對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸黏液的黏附能力和對(duì)鹽度的耐受性三方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，并探討其對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源與活化

22株乳酸菌由哈爾濱工業(yè)大學(xué)乳科學(xué)與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，鼠李糖乳桿菌LGG購(gòu)于美國(guó)ATCC；致病菌菌哈維氏弧菌(CGMCC NO.1.1601)和副溶血弧菌(CGMCC NO.1.1997)購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。

乳酸菌用含20%甘油的MRS在-80 ℃下保存，用MRS液體培養(yǎng)基在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)20 h活化，接種量為2%，活化第二代后用于實(shí)驗(yàn)。

弧菌用含20%甘油的2216E液體培養(yǎng)基在-80 ℃下保存，用2216E液體培養(yǎng)基在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)20 h活化，接種量為2%，活化第二代后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 潛在益生菌代謝產(chǎn)物的抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.1 無(wú)菌上清液抑菌活性的測(cè)定 將培養(yǎng)好的細(xì)菌懸液在8 000 r/min離心5 min得到上清液，取上清液后用0.22 μm濾膜過(guò)濾以除去殘留的菌體和其他雜質(zhì)，得到無(wú)菌上清液并用pH計(jì)測(cè)定其pH。采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行具有抑菌活性的細(xì)菌篩選實(shí)驗(yàn)。將1.5%瓊脂培養(yǎng)基傾倒在無(wú)菌培養(yǎng)皿(按每平皿10 mL)中待其凝固，水平放置以形成平面，凝固后在其上放置牛津杯。

制備2216E半固體培養(yǎng)基(即瓊脂濃度為0.6%的2216E培養(yǎng)基)15 mL，冷卻至40 ℃左右加入8 μL指示菌倒入含牛津杯的瓊脂平皿上，待其凝固后取出牛津杯，在孔洞中加入150 μL無(wú)菌上清液，靜置擴(kuò)散2 h后置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，觀察加入無(wú)菌上清液的孔洞周?chē)袩o(wú)抑菌圈的形成，并抑菌圈的大小來(lái)初步判斷抑菌活性的強(qiáng)弱，每株菌做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)[13]。

1.2.2 排除有機(jī)酸的發(fā)酵上清液實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)好的細(xì)菌懸液在8 000 r/min離心5 min，取上清液后用5 mol/L的NaOH調(diào)pH至6.0后用0.22 μm濾膜過(guò)濾以除去殘留的菌體和其他雜質(zhì)，得到排除有機(jī)酸后的無(wú)菌上清液備用。然后按照1.2.1中方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，觀察排除有機(jī)酸后無(wú)菌上清液的抑菌效果，每株菌做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 潛在益生菌對(duì)南美白對(duì)蝦腸黏液的黏附

1.3.1 對(duì)蝦腸道粗黏液的獲取 小心刮取凡納濱對(duì)蝦腸道黏液置于預(yù)冷的PBS緩沖液(每1.5 L含 十二水磷酸氫二鈉4.32 g、氯化鈉12.0 g、氯化鉀0.3 g、磷酸二氫鉀0.3 g)中，于 4 ℃，12 000 r/min條件下離心10 min后取上清以去除不溶解物質(zhì)。凡納濱對(duì)蝦腸道粗黏液蛋白濃度用Bradford 的方法進(jìn)行測(cè)定后用PBS緩沖液將終濃度調(diào)至1 mg/mL[2]。

1.3.2 細(xì)菌的熒光標(biāo)記 將 CFDA-SE 用二甲基亞砜溶解配制成1 mmol/L的母液，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾后分裝，避光儲(chǔ)存于-20 ℃待用。

將細(xì)菌培養(yǎng)液于4 ℃，8 000 r/min 條件下離心5 min 后去除上清液，用無(wú)菌 PBS 緩沖液將沉淀洗滌3次后懸浮于 PBS緩沖液中，最終細(xì)菌濃度調(diào)至109CFU/mL。于1 mL 細(xì)菌菌懸液添加20 μL CFDA-SE 母液混勻，37 ℃避光孵育 15 min 后于4 ℃，8 000 r/min 條件下離心 5 min去除上清液，用無(wú)菌PBS 緩沖液將沉淀洗滌3次去除多余的染液。細(xì)菌重懸于無(wú)菌 PBS，采用流式細(xì)胞儀在 488 nm 條件下分析其標(biāo)記率[2]。

1.3.3 細(xì)菌對(duì)腸黏液的黏附 在無(wú)菌96 孔板中添加 100 μL 對(duì)蝦粗黏液后于4 ℃過(guò)夜固定，用無(wú)菌 PBS 緩沖液洗滌3次96 孔板，除去未固定的黏液。將 100 μL經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的細(xì)菌分別添加至固定過(guò)黏液的孔中，37 ℃孵育 1 h。用 PBS 沖洗96孔板 3次，去除未固定的細(xì)菌后用100 μL 0.05%胰蛋白酶室溫處理 10 min。將 100 μL 預(yù)冷的無(wú)菌BHI(Brain-heart infusion)添加至96孔板中以終止胰蛋白酶反應(yīng)后收集樣品，用熒光分光光度計(jì)測(cè)其熒光值，測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)518 nm，狹縫寬度 2.5 nm。黏附率用黏附菌與初始菌的熒光強(qiáng)度比值表示，每株菌測(cè)定3個(gè)平行[2]。

1.4 潛在益生菌在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)

將活化后的細(xì)菌分別接種到添加有不同鹽分的MRS中，即在添加0%～5%的氯化鈉的MRS肉湯中接種2%活化好的乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)20 h后，以MRS培養(yǎng)基為空白，用酶標(biāo)儀測(cè)乳酸菌菌懸液的OD600來(lái)評(píng)估鹽度對(duì)細(xì)生長(zhǎng)的影響，每株菌做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)[14]。

1.5 菌株的16 S測(cè)序鑒定

將菌株進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將得到的拼接序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果中選擇同源性較高的菌株的16S rDNA序列作為參比用MEGA7來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，將其鑒定到種水平。

1.6 潛在益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響

1.6.1 飼料的準(zhǔn)備 通過(guò)對(duì)抑菌活性、對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道的黏附性以及對(duì)鹽度耐受性等體外實(shí)驗(yàn)，選出性能較好菌株，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h后，于4 000 r/min離心 15 min 后用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，并重懸于無(wú)菌生理鹽水中使得乳酸菌的濃度為1×109CFU/mL，按照1∶1∶1的比例混合后備用。

將處理好的潛在益生菌加入到商業(yè)飼料中混勻，最終使每克基礎(chǔ)飼料中含有1×108CFU 益生菌，空白對(duì)照組用等量無(wú)菌生理鹽水與飼料混合。配制完成的飼料在室溫自然晾干后于4 ℃儲(chǔ)存，飼料每周配制一次[2]。

1.6.2 凡納濱對(duì)蝦的分組與飼養(yǎng) 凡納濱對(duì)蝦由威海許家村養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，運(yùn)送至根源生物公司水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行養(yǎng)殖。將凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)平均分配于12個(gè)50 L(39 cm×39 cm×33 cm)的水族箱中暫養(yǎng)馴化10 d，暫養(yǎng)結(jié)束后將所有對(duì)蝦混合，挑選大小一致的對(duì)蝦稱(chēng)重隨機(jī)分組，此時(shí)對(duì)蝦均重約為2.13 g，分為2組，每組3個(gè)平行，分別為植物乳桿菌組(P組)和空白對(duì)照組(B組)。所有對(duì)蝦均飼養(yǎng)于鹽度24的人工海水中，溫度為(26±1)℃,每日飼喂對(duì)蝦5%體重的基礎(chǔ)飼料，持續(xù)通氣，循環(huán)水飼養(yǎng)，及時(shí)排污換水，飼養(yǎng)4周。

1.6.3 凡納濱對(duì)蝦腸道的收集及測(cè)序 飼養(yǎng)結(jié)束后將對(duì)蝦饑餓處理一天，用無(wú)菌手術(shù)剪將腸道取出，每個(gè)養(yǎng)殖缸取9尾對(duì)蝦腸道合并，每個(gè)處理3個(gè)平行,用液氮速凍后于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

將樣品送至上海銳翌公司進(jìn)行檢測(cè)，使用QIAamp PowerFecal DNA Kit DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取DNA，使用通用引物341F和806R 進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)閂3～V4區(qū)，在通用引物的5’端加上適合Illumina Miseq PE250測(cè)序的index序列和接頭序列。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit高保真酶進(jìn)行PCR。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物。使用Qubit進(jìn)行文庫(kù)定量，并根據(jù)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用Illumina Miseq PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

將得到的基因序列利用Usearch在0.97相似度下進(jìn)行聚類(lèi)，對(duì)聚類(lèi)后的序列進(jìn)行嵌合體過(guò)濾后，得到用于物種分類(lèi)的OTU ( Operational Taxonomic Units，操作分類(lèi)單元)，然后進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)α多樣性分析，并對(duì)不同處理組的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，分析組間差異菌群，研究腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，用SPSS 22.0進(jìn)行單因素ANOVA分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 潛在益生菌對(duì)致病菌的抑制效果

將實(shí)驗(yàn)室前期貯藏的23株乳酸菌，經(jīng)培養(yǎng)取無(wú)菌發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，這23株乳酸菌對(duì)2株弧菌均有明顯抑菌效果，其酸堿度和抑菌圈直徑(包含牛津杯形成的孔洞直徑7.8 mm)見(jiàn)表1。

表1 乳酸菌無(wú)菌發(fā)酵上清液酸堿度及其對(duì)弧菌的抑菌效果Table 1 The pH of supernatant of lactic acid bacteria and its antibacterial effect on Vibrio

其中YRL863和KTZ對(duì)2株弧菌的抑菌效果顯著較高，其次是YRL577、SB27和KTP(C-2)對(duì)2株弧菌的抑菌效果也明顯較好，T1對(duì)2株弧菌的抑菌效果顯著較低，其余菌株對(duì)2株弧菌的抑菌效果各有差異，而23株乳酸菌的無(wú)菌發(fā)酵上清液的pH最高的為T(mén)1，最低的為Q7。并且經(jīng)過(guò)排酸實(shí)驗(yàn)后，此23株乳酸菌均無(wú)明顯抑菌圈產(chǎn)生，表明這23株乳酸菌的抑菌活性物質(zhì)均為有機(jī)酸。

2.2 乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸黏液的黏附率

取對(duì)哈維氏弧菌和副溶血弧菌有抑菌效果的乳酸菌，研究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸黏液的黏附性，結(jié)果見(jiàn)表2。23株乳酸菌的黏附率在1.581%～7.292%之間，其中D-嗜酸乳桿菌、YRL45和KTP(C-2)的黏附性最好，其次是QL、YRL577、K14的黏附性較好，而T1的黏附性最差。

表2 乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸黏液的黏附率Table 2 Adhesion rate of lactic acid bacteria to intestinal mucus of L.vannamei

2.3 乳酸菌對(duì)鹽度耐受性效果

將黏附性最好的6株乳酸菌進(jìn)行鹽度耐受性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。其中D-嗜酸乳桿菌對(duì)鹽度比較敏感，當(dāng)NaCl添加量大于1%時(shí)，其OD600值急劇下降，當(dāng)培養(yǎng)基NaCl添加量大于4%時(shí)，其幾乎不生長(zhǎng)；K14和YRL577對(duì)鹽度的耐受性較好，當(dāng)NaCl添加量超過(guò)2%時(shí)，其OD600下降變快，當(dāng)NaCl添加量到5%時(shí)，相較于未添加NaCl時(shí)，K14和YRL577還能生長(zhǎng)，但是其OD600值下降很多，表明其生長(zhǎng)狀態(tài)受到較大影響；其中KTP(C-2)、YRL45和QL對(duì)鹽度的耐受性最好，當(dāng)NaCl添加量不超過(guò)5%時(shí)，其OD600呈緩慢下降趨勢(shì)，一直到添加5% NaCl時(shí)，但是這3株乳酸菌仍有良好的生長(zhǎng)狀況，并且其發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液仍為酸性。

圖1 鹽度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of salinity on the growth of lactic acid bacteria

將在不同鹽度下生長(zhǎng)的KTP(C-2)、YRL45和QL這3株乳酸菌無(wú)菌發(fā)酵液進(jìn)行對(duì)副溶血弧菌和哈維氏弧菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，其抑菌直徑見(jiàn)表3，結(jié)果中抑菌圈的直徑包括牛津杯孔的直徑7.8 mm。

通過(guò)對(duì)鹽度耐受性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KTP(C-2)、YRL45和QL對(duì)鹽度的耐受性最好，并且其在不同鹽度下的無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)哈維氏弧菌和副溶血弧菌仍舊存在明顯的抑菌效果。

2.4 菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果

將KTP(C-2)、YRL45和QL的16S rDNA拼接序列在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這3株菌均為植物乳桿菌，QL與L.plantarumstrain SRCM103303的相似性達(dá)到99.81%，YRL45與L.plantarumstrain SRCM103300相似性達(dá)到99.45%，KTP(C-2)與L.plantarumstrain HBUAS52072相似性達(dá)到了99.93%。用MEGA7.0軟件進(jìn)行核酸比對(duì)，用比鄰法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 YRL45、QL和KTP(C-2)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of YRL45,QL and KTP(C-2)

2.5 乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的α多樣性分析 本實(shí)驗(yàn)利用QIIME 軟件計(jì)算樣品的Alpha多樣性指數(shù)的值，分別從Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析。凡納濱對(duì)蝦腸道菌群OTU數(shù)和α多樣性見(jiàn)表4，不同樣本OTU韋恩圖見(jiàn)圖3。

表4結(jié)果顯示，植物乳桿菌組抽平處理后的OTU數(shù)量比對(duì)照組多，而chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)較低，但是其標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，說(shuō)明相同處理的平行樣本間差異略大，4個(gè)指數(shù)在2個(gè)處理組之間均沒(méi)有顯著差異。

表4 不同處理組凡納濱對(duì)蝦腸道菌群多樣性指數(shù)Table 4 Intestinal flora diversity index of L.Vannamei in different treatment groups

圖3中Venn圖顯示，P組和B組共有的OTU數(shù)有226個(gè)，其共有OTU在門(mén)水平上分類(lèi)的豐度最高的6類(lèi)從大到小依此為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)和放線菌門(mén)，其中P組獨(dú)有的OTU有41個(gè)，占總OTU數(shù)的15.36%，高于B組獨(dú)有的10.67%。由此可知，植物乳桿菌(L.plantarumYRL45、L.plantarumQL、L.plantarumKTP(C-2))干預(yù)后，凡納濱對(duì)蝦腸道菌群獨(dú)有物種較多，α多樣性有所降低，但無(wú)顯著影響。

圖3 不同處理組OTUs韋恩圖Fig.3 Venn diagram showing the unique and shared OTUs between the different treatment groups

2.5.2 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu) 根據(jù)OTU物種注釋結(jié)果，各個(gè)樣品在門(mén)的水平上物種相對(duì)豐度圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，在門(mén)水平上，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為凡納濱對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，共超過(guò)腸道菌群90%的比例，其次是厚壁菌門(mén)。P組的變性菌門(mén)豐度較高，但和B組之間沒(méi)有顯著差異，但是P3樣本中變形菌門(mén)的豐度較為異常，有可能是樣本在采集至檢測(cè)過(guò)程中有偶然污染或保存過(guò)程中發(fā)生變化。B組的厚壁菌門(mén)豐度較高，但是兩組之間沒(méi)有顯著性差異，大多益生菌比如乳酸菌、芽孢桿菌都屬于厚壁菌門(mén)，從此處看來(lái)，植物乳桿菌干預(yù)后對(duì)厚壁菌門(mén)的豐度沒(méi)有提高作用。P組中的放線菌門(mén)有所提高(平均豐度由0.289提高到0.500)，雖然沒(méi)有達(dá)到顯著性差異，但是放線菌門(mén)中也有如節(jié)桿菌和雙歧桿菌類(lèi)益生菌，植物乳桿菌處理組均能提高腸道菌群中放線菌門(mén)的豐度。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌(KTP(C-2)、YRL45和QL)對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群沒(méi)有顯著改變，但是對(duì)其中一些物種的相對(duì)豐度有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖4 不同處理組腸道菌群結(jié)構(gòu)Fig.4 Gut flora structure in different treatment groups

2.5.3 植物乳桿菌組與空白對(duì)照組間的LEfSe差異分析 通過(guò)LEfSe分析，分析不同處理組的凡納濱對(duì)蝦腸道菌群種特有物種，結(jié)果見(jiàn)圖5。從屬水平上分析，Photobacterium(發(fā)光桿菌屬)和Gemella在B組中顯著上調(diào)，Algoriphagus、Desulfobulbus(脫硫球莖菌屬)和Erythrobacter(赤桿菌屬)在P組中顯著上調(diào)。

赤桿菌屬、發(fā)光桿菌和脫硫球莖菌屬的組內(nèi)相對(duì)豐度分布見(jiàn)圖6A、6B和6C，其中P組的赤桿菌屬平均豐度約為0.000 45，顯著高于B組的約0.000 10，并且P組中每個(gè)樣本中赤桿菌屬的豐度均比B組高。而P組中發(fā)光桿菌的豐度約為0.10，顯著低于B組的0.30，并且P組中發(fā)光桿菌的豐度均比B組低。P組中的脫硫球莖菌屬豐度比B組高，但是在2.5.2中發(fā)現(xiàn)P3樣本中腸道菌群變形菌門(mén)異常多，在這里P3的脫硫球莖菌屬豐度較高可能與之有關(guān)，但總體而言P組的脫硫球莖菌屬還是相對(duì)B組較高。

以上結(jié)果表明植物乳桿菌YRL45、KTP(C-2)和QL干預(yù)對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物結(jié)構(gòu)有一定的調(diào)節(jié)作用，干預(yù)過(guò)后提高了赤桿菌屬和脫硫球莖菌屬的豐度，降低了發(fā)光桿菌的豐度。

(c代表綱，o代表目，f代表科，g代表屬。c means Class,o means Order,f means Family,g means Genus.)圖5 不同處理組凡納濱對(duì)蝦腸道微生物L(fēng)DA分?jǐn)?shù)Fig.5 LDA scores of intestinal microbial in different treatment groups

3 討論

近年來(lái)，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中受到廣泛的關(guān)注與研究，但其在凡納濱對(duì)蝦等無(wú)脊椎動(dòng)物中的研究仍非常有限[15]。益生菌可以產(chǎn)生對(duì)病原菌有抑制或者殺滅作用的物質(zhì)如有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)[16]，本研究以對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中常見(jiàn)致病菌為指示菌評(píng)價(jià)受試菌的抑菌能力，發(fā)現(xiàn)23株乳酸菌對(duì)哈維氏弧菌和副溶血弧菌均有較明顯的抑制效果，分析上清液的酸堿度與其抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)其抑菌效果與pH有一定的聯(lián)系，比如T1的抑菌效果最差，其上清液pH最高，但是YRL863和KTZ的抑菌效果最好，其pH并不是最低的，并且經(jīng)過(guò)排酸實(shí)驗(yàn)后，此23株乳酸菌均無(wú)明顯抑菌圈產(chǎn)生，表明這23株乳酸菌的抑菌活性物質(zhì)均為有機(jī)酸，但其抑菌圈直徑與上清液pH并不是絕對(duì)成負(fù)相關(guān)的，這可能是由于不同有機(jī)酸的抑菌效果不同。益生菌通過(guò)對(duì)腸上皮的黏附位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生益生活性，細(xì)菌能黏附并定植于腸道上皮層而阻礙病原菌的黏附是益生菌篩選的理想標(biāo)準(zhǔn)，這種對(duì)位點(diǎn)的作用機(jī)制稱(chēng)為“競(jìng)爭(zhēng)性抑制”[17-18]，本研究再以凡納濱對(duì)蝦腸黏液為對(duì)象評(píng)價(jià)受試菌的黏附潛力，發(fā)現(xiàn)黏附性較好的為D-嗜酸乳桿菌、YRL45、KTP(C-2)、QL、YRL577和K14這6株乳酸菌；并且針對(duì)凡納濱對(duì)蝦廣鹽性的特點(diǎn)進(jìn)一步對(duì)受試菌進(jìn)行鹽度耐受性，發(fā)現(xiàn)YRL45、KTP(C-2)和QL對(duì)鹽度的耐受性最好。對(duì)YRL45、KTP(C-2)和QL進(jìn)行16S rDNA測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這3株乳酸菌均為植物乳桿菌。

(組內(nèi)三個(gè)柱形圖表示組內(nèi)3個(gè)平行樣本。The three bars in the each group represent 3 parallel samples in the group.)圖6 差異性物種的組內(nèi)分布Fig.6 Intra-group distribution of differential species

腸道菌群與生物體的健康有著密切的關(guān)系，并且對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫應(yīng)答和腸黏膜的形態(tài)都有影響[19]。本研究將植物乳桿菌YRL45、KTP(C-2)和QL混合后飼喂凡納濱對(duì)蝦,發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為凡納濱對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其次是厚壁菌門(mén)，與之類(lèi)似的是Huang等研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦腸道中優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)與放線菌門(mén)或厚壁菌門(mén)[20]。Sha等研究戊糖乳桿菌(L.pentosus)及其上清液對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌上清液能顯著提高對(duì)蝦腸道內(nèi)放線菌的豐度[19]，這與本研究有相似結(jié)果。

通過(guò)LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌YRL45、KTP(C-2)和QL能提高赤桿菌屬的豐度，降低了發(fā)光桿菌屬對(duì)腸道菌群的影響力。發(fā)光桿菌屬是凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中的條件致病菌，Amoah 等發(fā)現(xiàn)添加凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)可以減少凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中發(fā)光桿菌屬的豐度[21]，Huynh等發(fā)現(xiàn)添加合生元(植物乳桿菌和低聚半乳糖)可以減少腸道中美人魚(yú)發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)[22]，Hu等也發(fā)現(xiàn)低聚果糖的添加可以改善對(duì)蝦腸道微生物多樣性，抑制腸道中P.damselae-likestrains[23]。脫硫球莖菌屬為潛在病原體[24]，在植物乳桿菌組中也有所增加，但是其中有一個(gè)樣本的脫硫球莖菌屬豐度異常，總體而言有一定的增加。但是赤桿菌屬是光合細(xì)菌的一種，屬于功能性菌的一種，在本實(shí)驗(yàn)中，植物乳桿菌處理組中能增加赤桿菌屬。與之相似的是，Hu等發(fā)現(xiàn)相比較對(duì)照組，添加芽孢桿菌和糖蜜的混合物的對(duì)蝦腸道菌群中赤桿菌屬較為突出[25]。

從腸道菌群結(jié)構(gòu)與差異分析綜合來(lái)看，植物乳桿菌YRL45、KTP(C-2)和QL的添加對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定的調(diào)節(jié)作用，并且在提高赤桿菌屬和降低發(fā)光桿菌屬方面有一定的效果。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)評(píng)價(jià)乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦致病菌的抑制作用與對(duì)其腸黏液的黏附作用來(lái)篩選凡納濱對(duì)蝦的潛在益生菌，并根據(jù)其養(yǎng)殖鹽度范圍來(lái)評(píng)價(jià)乳酸菌的耐鹽性，進(jìn)一步選出耐鹽性能更好的植物乳桿菌YRL45、KTP(C-2)和QL作為凡納濱對(duì)蝦潛在益生菌來(lái)飼喂凡納濱對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)其對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的結(jié)構(gòu)中放線菌門(mén)的豐度有一定改善，且能提高赤桿菌屬豐度，降低發(fā)光桿菌屬豐度，對(duì)腸道菌群一定的調(diào)節(jié)作用，本研究為益生菌在凡納濱對(duì)蝦中的篩選應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。