滿銘叁，隋仲敏，周慧慧，王 旋，徐 瑋，麥康森，何 艮

(中國(guó)海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

眾所周知，魚粉和魚油是水產(chǎn)飼料最主要的組成部分，因?yàn)閮烧叩臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值對(duì)于魚類的生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)是十分理想的[1]，但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，魚粉、魚油資源變得日益短缺，致使養(yǎng)殖成本上升，嚴(yán)重抑制了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因此如何合理有效地利用資源以及尋找其替代品就成為亟須解決的問(wèn)題。

飼料中的脂質(zhì)是魚類所需要的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，既是魚體能量的主要來(lái)源又是機(jī)體的重要組成部分，能為機(jī)體提供必需脂肪酸、磷脂、固醇類和脂溶性維生素等重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持體內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程[2-3]，在魚類的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝等生命活動(dòng)中起到了至關(guān)重要的作用。此外，脂肪還具有節(jié)約蛋白的作用，在一定范圍內(nèi)，飼料脂肪水平的升高可以提高飼料效率，并通過(guò)節(jié)約蛋白的作用促進(jìn)生長(zhǎng)。只有當(dāng)飼料的脂肪水平和脂肪酸組成適宜時(shí)，魚類的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等各項(xiàng)生命活動(dòng)才能正常進(jìn)行。由于脂肪的節(jié)約蛋白作用，促進(jìn)了高脂飼料的應(yīng)用，但是研究發(fā)現(xiàn)高脂飼料導(dǎo)致了魚體肝臟和腹腔脂肪的沉積，造成了可食用面積減少、肉質(zhì)下降等一系列問(wèn)題。用植物油高度替代魚油導(dǎo)致了同樣的問(wèn)題[4-6]。因此，了解飼料中的脂肪水平和脂肪源替代如何影響生長(zhǎng)和代謝以及兩者之間有什么相互的影響將有利于促進(jìn)飼料中魚油的高效節(jié)約利用。

大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)屬鰈形目(Pleuronectiformes)菱鲆科(Scophthalmidae)菱鲆屬(Scophthalmus)，俗稱“多寶魚”，是一種低溫經(jīng)濟(jì)魚類，具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、生長(zhǎng)迅速、宜于集約化養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已發(fā)展成為中國(guó)北方海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)[7]。然而，魚油資源的短缺限制了其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因此，尋找合理利用魚油的方法以及尋找魚油替代品就顯得十分必要。本實(shí)驗(yàn)探討了不同脂肪水平及脂肪源的飼料在生長(zhǎng)、脂代謝相關(guān)基因表達(dá)等方面對(duì)大菱鲆幼魚的影響，以期為大菱鲆飼料中魚油的利用提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以魚粉、谷朊粉、大豆?jié)饪s蛋白作為蛋白源，以魚油、大豆卵磷脂為脂肪源，豆油作為100%替代脂肪源，設(shè)計(jì)6種實(shí)驗(yàn)飼料，飼料干物質(zhì)的粗蛋白含量為50%，脂肪含量設(shè)為8%、12%和16% 3個(gè)梯度。所有實(shí)驗(yàn)飼料中添加晶體氨基酸以滿足大菱鲆對(duì)必需氨基酸的需求。添加丙酸鈣作為防霉劑；添加乙氧基喹啉作為抗氧化劑；添加海藻酸鈉作為黏合劑；添加三氧化二釔作為測(cè)定表觀消化率的指示劑。飼料配方見表1。各實(shí)驗(yàn)組用到的飼料F8、S8、F12、S12、F16、S16，字母F表示魚油為脂肪源，字母S表示豆油為替代脂肪源，數(shù)字8、12、16表示飼料的脂肪含量為8%、12%、16%。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料的組成及成分分析(干物質(zhì))Table 1 Formulas and proximate composition of the experimental diets (dry matter) /%

所有原料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎并過(guò)80目的網(wǎng)篩，然后將粉碎好的原料按照飼料配方從小量到大量逐步混合均勻，此后將大豆卵磷脂混入魚油和豆油中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)配方將預(yù)混料分別與相應(yīng)量的魚油或豆油混合均勻，然后將膽堿加入到30%飼料重量的水中混勻，再將水與飼料充分混勻。飼料顆粒(3 mm×4 mm)由制粒機(jī)制成，然后在55 ℃的通風(fēng)風(fēng)箱中烘干12 h。待飼料顆粒干燥冷卻后用雙層塑料袋裝好并封口，保存在-20 ℃冰箱中待使用。

1.2 飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)在青島億海豐水產(chǎn)品有限公司(山東青島)進(jìn)行。大菱鲆幼魚從養(yǎng)殖廠購(gòu)買，在實(shí)驗(yàn)開始前用商業(yè)飼料喂養(yǎng)2周，使魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。將初始體質(zhì)量(13.01±0.01) g的幼魚挑選出來(lái)隨機(jī)分到18個(gè)養(yǎng)殖箱中，每個(gè)養(yǎng)殖箱30尾魚。實(shí)驗(yàn)所用海水經(jīng)過(guò)砂濾器過(guò)濾后以1.5 L/min的速度注入養(yǎng)殖箱。每個(gè)處理組都被分成3個(gè)平行進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每天7:00和19:00進(jìn)行定量投喂(投喂量為魚體質(zhì)量的1%)，每2周稱一次體質(zhì)量并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整投喂量。投喂后將糞便清理干凈。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行56 d。

1.3 樣品收集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后饑餓處理24h，記錄每個(gè)養(yǎng)殖箱內(nèi)魚的數(shù)量，并稱量每個(gè)養(yǎng)殖箱內(nèi)魚總體質(zhì)量。每箱隨機(jī)選出4尾魚保存在-20 ℃冰箱中用以進(jìn)行體成分分析。從每個(gè)養(yǎng)殖箱中取4尾魚，取魚體的肝、腸、肌肉并用液氮保存。每養(yǎng)殖箱中隨機(jī)挑選2尾魚測(cè)量體質(zhì)量、體長(zhǎng)、內(nèi)臟團(tuán)重量、肝臟重量。取肝臟樣品保存在液氮中，再保存在-80 ℃冰箱中用于基因定量分析。

1.4 化學(xué)分析

將樣品置于105 ℃烘箱中烘至恒重以測(cè)定水分。粗蛋白的測(cè)定通過(guò)凱氏定氮法(Kjeltec TM 8400,FOSS,Sweden)。采用索氏提取法(Buchi 36680,Switzerland)用乙醚提取后測(cè)定粗脂肪。

1.5 肝臟脂肪含量及脂肪酸組成

檢測(cè)肝臟中脂肪含量方法如下：將肝臟樣品冷凍干燥，稱取100 mg的樣品于10 mL玻璃離心管中，記錄下樣品的質(zhì)量w0和對(duì)應(yīng)的試管編號(hào)；每個(gè)離心管中加入氯仿-甲醇溶液(氯仿∶甲醇 =2∶1，存放在棕色玻璃瓶中4 mL，搖勻后蓋好蓋子，浸泡24 h。75 ℃下烘干另外一批玻璃離心管至恒重，兩次誤差不得超過(guò)0.001 g，記錄下離心管質(zhì)量w1和對(duì)應(yīng)的編號(hào)。將氯仿-甲醇溶液加至6 mL，離心(3 000g，10 min)，再將上清液轉(zhuǎn)入第二批離心管；在沉淀中加入2 mL氯仿-甲醇溶液，靜置2 h后離心(3 000g，10 min)；上清液仍轉(zhuǎn)入第二批離心管。在上清液中加入1.2 mL 1.6%的CaCl2，搖勻，蓋上蓋子靜置過(guò)夜。過(guò)夜后用移液槍小心棄去上層液，再將離心管置于75 ℃烘箱中烘干至恒重，兩次誤差不得超過(guò)0.001 g，記錄下質(zhì)量w2。每個(gè)樣品兩個(gè)重復(fù)。得到肝臟脂肪含量=(w2-w1) /w0×100%。

檢測(cè)肝臟中脂肪酸含量方法如下：將肝臟樣品冷凍干燥，在研缽中充分磨細(xì)，稱取100 mg左右的樣品于帶蓋的10 mL刻度試管，加入1 mol/L的KOH-甲醇3 mL，于80 ℃的水浴中加熱20 min，放置冷卻；再加入2 mol/L HCl-甲醇溶液3 mL，混勻，于80 ℃的水浴中加熱20 min，放置冷卻；加正己烷1 mL，振蕩萃取，靜置過(guò)夜；過(guò)夜后取上清得到樣品，使用氣相色譜儀(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,California,USA)分析樣品脂肪酸組成，飼料脂肪酸組成見表2。

表2 飼料中脂肪酸的組成(總脂肪酸)Table 2 Fatty acid composition (total fatty acids) of the experimental diets /%

1.6 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

肝臟總RNA參照Trizol試劑盒(Invitrogen,USA)提取，提取肝臟樣品中的總RNA。然后利用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)cDNA的濃度并用DEPC水稀釋至80 μg/μL，分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用已有目的基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisomeproliferator-activatedreceptoralpha，PPARα)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I(CarnitinepalmitoyltransferaseI，CPTI)、磷脂酸磷酸化酶1(Lipin1)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma，PPARγ)、脂蛋白脂酶(LipoproteinLipase，LPL)、肝X受體(LiverXreceptors，LXR)、延伸因子1α(ElongationFactor-lα,EF1α)的引物序列合成引物，引物序列如表3所示。定量PCR的體系為25 μL，其中12.5 μL SYBR.Premix Ex TaqTM、0.5 μL上下游引物(10 μmol/L)、3μL cDNA和9.5 μL的DEPC水。定量?jī)x器為實(shí)時(shí)定量PCR儀(Mastercycler ep realplex，Eppendorf，Germany)。實(shí)時(shí)定量PCR的程序?yàn)?5 ℃持續(xù)2 min；95 ℃持續(xù)15 s，退火溫度持續(xù)15 s，72 ℃持續(xù)20 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。得到各基因的CT值，并根據(jù)2-ΔΔCt方法測(cè)定目的基因的表達(dá)量[8]。

表3 大菱鲆脂肪代謝相關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 3 Real-time quantitative PCR primers for fatty metabolismrelated genes of turbot (Scophthalmus maximus L.)

1.7 計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

大菱鲆攝食率、特定生長(zhǎng)率、肥滿度等參照以下公式計(jì)算：

存活率(Survival rate，SR)=(最終魚數(shù)量/初始魚數(shù)量)×100%；

增重率(Weight gain rate，WGR)=(終體質(zhì)量-初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量×100%；

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate，SGR) =(ln終體質(zhì)量-ln始體質(zhì)量)/實(shí)驗(yàn)天數(shù)×100%；

肥滿度(Condition factor，CF)=終體質(zhì)量(g) /體長(zhǎng)3(cm)×100%；

肝體比(Hepatosomatic index，HSI)=肝臟重(g)/體質(zhì)量(g)×100%；

臟體比(Viscerosomatic index，VSI)=內(nèi)臟重(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0。數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(ANOVA)再進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)視作有顯著性差異。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果

2.1 飼料中不同脂肪水平和脂肪源對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)參數(shù)影響

實(shí)驗(yàn)各組的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)如表4所示。隨著飼料脂肪水平的升高以及脂肪源的替代，大菱鲆幼魚的存活率(SR)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但是終末體質(zhì)量(FBW)、增重率(WGR)和特定生長(zhǎng)率(SGR)出現(xiàn)了顯著差異(P<0.05)。FBW、WGR和SGR均隨飼料脂肪水平的上升而上升，只有S16組下降，而用豆油替代了飼料中的魚油后FBW、WGR和SGR全部下降(P<0.05)，在所有的處理組中，F(xiàn)16組的FBW、WGR和SGR高于其他各組，S16組最低，但與F8、S8組相比沒(méi)有顯著差異(P<0.05)，F(xiàn)8、S8、F12和S12組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但F8、S8組與F16組有顯著差異(P<0.05)，F(xiàn)12和S12組則沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

表4 飼料脂肪水平和豆油替代對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of dietary lipid level and fish oil replaced by soybean oil on growth parameters of juvenile turbot

實(shí)驗(yàn)各組肥滿度(CF)、臟體比指數(shù)(VSI)和肝體比指數(shù)(HSI)結(jié)果如表5所示，隨著飼料脂肪水平的增加大菱鲆臟體比指數(shù)(VSI)和肝體比指數(shù)(HSI)均有所上升并且產(chǎn)生了顯著差異(P<0.05)，但肥滿度(CF)沒(méi)有受到顯著影響(P>0.05)；而在用豆油替代飼料中的魚油后，臟體比指數(shù)(VSI)和肝體比指數(shù)(HSI)沒(méi)有受到影響(P>0.05)，但肥滿度(CF)出現(xiàn)了顯著差異(P<0.05)。

表5 飼料脂肪水平和豆油替代對(duì)大菱鲆肝體比、臟體比及肥滿度的影響Table 5 Effect of dietary lipid level and fish oil replaced by soybean oil on hepatosomatic index (HSI),viscerosomatic index (VSI) and condition factor (CF) of juvenile turbot /%

2.2 飼料中不同脂肪水平和脂肪源對(duì)大菱鲆體組成變化的影響

對(duì)各處理組的大菱鲆的體組成進(jìn)行了分析，包括魚體的水分、粗蛋白和粗脂肪，結(jié)果如圖1所示。隨著飼料脂肪水平的上升，魚體水分含量下降但沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，脂肪含量上升(P<0.05)，蛋白含量沒(méi)有明顯的差異(P>0.05)；當(dāng)用豆油替代魚油后，魚體的水分、粗蛋白和粗脂肪含量均有所下降，但沒(méi)有顯著的差異(P>0.05)。在所有處理組中，F(xiàn)8組的水分含量最高，F(xiàn)16組的水分含量最低，但各組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；F16組的脂肪含量最高，與S16組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但顯著高于其他處理組(P<0.05)，F(xiàn)8組的脂肪含量最低，顯著低于其他處理組(P<0.05)，S8組的脂肪含量?jī)H高于F8組，顯著低于其他組(P<0.05)，F(xiàn)12、S12和S16組的脂肪含量差異不大(P>0.05)；F12組的蛋白含量最高，S12組的蛋白含量最低，但各組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

2.3 飼料中不同脂肪水平和脂肪源對(duì)大菱鲆肝臟脂肪含量和脂肪酸組成的影響

實(shí)驗(yàn)各組肝臟脂肪含量如圖2所示。大菱鲆肝臟脂肪含量隨著飼料脂肪水平的升高而顯著上升(P<0.05)，同時(shí)豆油的替代也引起了肝臟脂肪含量顯著的上升(P<0.05)，S16組的肝臟脂肪含量最高，顯著高于其他處理組(P<0.05)；其次是S12組，顯著高于剩余4組(P<0.05)，S8和F16組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于F8和F12組(P<0.05)。

(同一圖中不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。Significant differences are indicated by different superscript alphabets in each chart(P<0.05).)圖1 飼料脂肪水平和豆油替代對(duì)大菱鲆體組成的影響Fig.1 Effect of dietary lipid level and fish oil replaced by soybean oil on whole body composition of juvenile turbot

(同一圖中不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。Significant differences are indicated by different superscript alphabets in each chart(P<0.05).)圖2 飼料脂肪水平和豆油替代對(duì)大菱鲆肝臟脂肪含量的影響Fig.2 Effect of dietary lipid level and fish oil replaced by soybean oil on the lipid content of the liver in juvenile turbot

大菱鲆肝臟的脂肪酸組成如表6所示。肝臟中飽和脂肪酸(Saturated fatty acid，SFA)的含量隨著飼料脂肪水平的上升和豆油的替代而出現(xiàn)了下降(P<0.05)，n-6系列的多不飽和脂肪酸(n-6 Polyunsaturated fatty acids，n-6 PUFA)的含量受到了飼料脂肪水平和豆油替代的共同影響，在沒(méi)有豆油替代的3組中，∑n-6 PUFA的含量隨脂肪水平的升高而下降(P<0.05)，而用豆油替代后，∑n-6 PUFA的含量變化趨勢(shì)則相反(P<0.05)。二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)沒(méi)有受到飼料脂肪水平的顯著影響(P>0.05)，但在用豆油替代后EPA和DHA含量顯著下降(P<0.05)。

表6 飼料脂肪水平和豆油替代對(duì)大菱鲆肝臟脂肪酸組成(總脂肪酸)的影響Table 6 Effect of dietary lipid level and fish oil replaced by soybean oil on the fatty acid composition ( total fatty acids) in the liver of the juvenile turbot /%

2.4 飼料中不同脂肪水平和脂肪源對(duì)大菱鲆肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

各處理組間肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量如圖3所示。Lipin1和LPL的表達(dá)量沒(méi)有隨著飼料脂肪水平和豆油替代的變化而發(fā)生顯著的差異(P>0.05)，但是當(dāng)有豆油替代時(shí)兩者的表達(dá)量均有下降的趨勢(shì)。Lipin1表達(dá)量最高出現(xiàn)在F16組，最低出現(xiàn)在F12組；F12組LPL表達(dá)量最高，S12組表達(dá)量最低，但各組間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。PPARα的表達(dá)量受飼料脂肪水平和豆油替代的共同影響，豆油替代上調(diào)了PPARα的表達(dá)量(P<0.05)，而沒(méi)有豆油替代時(shí)，PPARα的表達(dá)量隨飼料脂肪水平的升高而降低，豆油替代魚油后其表達(dá)量升高，S16組PPARα的表達(dá)量最高，顯著高于F16組(P<0.05)，但與其他組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。豆油替代降低了CPTI的表達(dá)量，在豆油替代的情況下，CPTI的表達(dá)量隨著脂肪水平的升高而有所上升，非替代組的變化趨勢(shì)與此相反。F12組LXR的表達(dá)量最高，與F16和S16組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，S12組表達(dá)量最低，但只與F12組有顯著差異(P<0.05)。F16組PPARγ的表達(dá)量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，其余各組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

(同一圖中不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。Significant differences are indicated by different superscript alphabets in each gene(P<0.05).)圖3 飼料脂肪水平和豆油替代對(duì)大菱鲆肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of dietary lipid level and fish oil replaced by soybean oil on the lipid metabolism related gene expression in the liver of the juvenile turbot

3 討論

在本次實(shí)驗(yàn)中，用6種不同的飼料喂養(yǎng)大菱鲆幼魚，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行56 d。大菱鲆幼魚的存活率(SR)沒(méi)有隨著飼料脂肪水平的提高以及脂肪源的替代而出現(xiàn)顯著的差異(P>0.05)，但是終末體質(zhì)量(FBW)、增重率(WGR)和特定生長(zhǎng)率(SGR)出現(xiàn)了顯著的差異(P<0.05)。從結(jié)果可以看出，F(xiàn)16組的FBW、WGR和SGR最高，生長(zhǎng)最好；而S16組的生長(zhǎng)最差，其余4組的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。雖然沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異，但是除S16組外的5組FBW、WGR和SGR均隨飼料脂肪水平的上升而出現(xiàn)了上升趨勢(shì)，這是由于當(dāng)魚體攝食的飼料脂肪不充足時(shí)，魚體攝入的能量就會(huì)不足，就會(huì)引起生長(zhǎng)的下降，此外，飼料中的脂肪有節(jié)約蛋白的作用，當(dāng)攝入的脂肪充足時(shí)，魚體就可以減少用于產(chǎn)生能量的蛋白質(zhì)分解，進(jìn)而提高生長(zhǎng)。生長(zhǎng)結(jié)果表明，當(dāng)用豆油替代飼料中魚油時(shí)，魚體的FBW、WGR和SGR均出現(xiàn)了下降，說(shuō)明用豆油100%替代魚油會(huì)對(duì)大菱鲆的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，這與之前的研究相一致[9]。而且從生長(zhǎng)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料脂肪水平為8%和12%時(shí)，豆油替代雖然抑制了大菱鲆的生長(zhǎng)，但是沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，這可能說(shuō)明當(dāng)飼料脂肪水平為8%～12%時(shí)，在相同的攝食量下，100%的豆油替代不會(huì)對(duì)大菱鲆的生長(zhǎng)造成太大的影響；而當(dāng)飼料脂肪水平達(dá)到16%時(shí)，生長(zhǎng)出現(xiàn)了顯著的下降(P<0.05)，這與之前的研究報(bào)道相一致[10]，這說(shuō)明當(dāng)飼料中豆油含量上升時(shí)，其抑制魚體生長(zhǎng)的作用就會(huì)越明顯，進(jìn)而表現(xiàn)為生長(zhǎng)上的差異。之前的研究表明[9]，12%脂肪水平下100%的豆油替代會(huì)顯著抑制大菱鲆的生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)抑制大菱鲆的攝食率，而在本實(shí)驗(yàn)中，在定量投喂的情況下，12%脂肪水平的魚油組和豆油組生長(zhǎng)差異不大，這可能說(shuō)明豆油替代飼料的適口性是影響大菱鲆生長(zhǎng)的原因之一，因此可以考慮提高豆油替代飼料的適口性來(lái)增加豆油的利用性。

隨著飼料脂肪水平的增加，大菱鲆臟體比指數(shù)(VSI)和肝體比指數(shù)(HSI)均有所上升并出現(xiàn)了顯著差異(P<0.05)，這說(shuō)明了肝臟是大菱鲆體內(nèi)沉積脂肪的主要器官；而在用豆油替代魚油后，VSI和HSI均沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，這與在大菱鲆[10]、籃子魚(Siganuscanaliculatus)[11]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[12]、歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)和虹蹲(Oncorhynchusmykiss)[13]上的研究結(jié)果相一致。另外，肥滿度(CF)沒(méi)有受到飼料脂肪水平影響(P>0.05)，但當(dāng)用豆油替代魚油后，魚體的CF出現(xiàn)了顯著差異(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)分析了包括魚體水分、粗蛋白和粗脂肪在內(nèi)的各項(xiàng)體組分，結(jié)果顯示魚體水分受飼料脂肪水平的影響(P<0.05)，隨著飼料脂肪水平的上升，魚體水分含量下降；而豆油替代則沒(méi)有影響魚體的水分含量(P>0.05)。大菱鲆魚體的粗脂肪含量隨飼料脂肪含量升高而顯著升高(P<0.05)，這與大菱鲆[14]、歐洲鱸魚[15]、金頭鯛(Sparusaurata)[16]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)、長(zhǎng)吻鮠(LeiocassislongirostrisGünther)[17]。等研究結(jié)果相一致；而豆油替代對(duì)魚體粗脂肪的含量沒(méi)有造成顯著的差異(P>0.05)，這與先前的研究結(jié)果相一致[10,19-21]。魚體粗蛋白含量沒(méi)有受到飼料脂肪水平和豆油替代的顯著影響(P>0.05)，這與先前的研究結(jié)果相一致[10,19-21]，這說(shuō)明飼料脂肪水平和豆油替代不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)在大菱鲆體內(nèi)的沉積。

飼料的脂肪水平和豆油替代情況顯著影響了大菱鲆肝臟脂肪含量(P<0.05)：隨著飼料脂肪水平的升高，大菱鲆肝臟脂肪含量發(fā)生了顯著的上升(P<0.05)，其結(jié)果與Gélineau等[22]的研究結(jié)果相一致；同時(shí)豆油的替代也影響了其肝臟脂肪含量，引起了脂肪含量的顯著上升(P<0.05)，這也與Bell等[23]在大菱鲆上的研究結(jié)果相一致，這可能是與豆油替代后飼料中的n3/n6比值變化有關(guān)。n3-PUFA與n6- PUFA之間的不平衡會(huì)造成肝臟脂肪含量的增加[24]，而在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)飼料中的魚油被豆油替代后，n3/n6的比值均出現(xiàn)了下降。本實(shí)驗(yàn)中的大菱鲆肝臟脂肪酸組成驗(yàn)證了之前的一些研究結(jié)果[11-12,21,25-27]，反映了飼料中的脂肪酸組成。LC-PUFA的合成是通過(guò)Δ6去飽和酶、延長(zhǎng)酶和Δ5 去飽和酶催化C18底物，如C18:2n-6和C18:3n-3等來(lái)完成的，但大菱鲆將C18:3n-3轉(zhuǎn)化為EPA和DHA的能力有限，所以肝臟中EPA和DHA的含量變化并沒(méi)有與飼料中C18:3n-3含量的變化相一致，甚至表現(xiàn)出完全相反的變化趨勢(shì)，但與飼料中EPA和DHA的含量變化趨勢(shì)相近。其結(jié)果與Regost等[10]在大菱鲆上的研究一致。這也說(shuō)明大菱鲆獲得EPA和DHA主要靠外界攝食而不是自身合成。

肝臟脂肪的沉積受脂肪的合成與分解兩方面的影響。肝臟脂肪沉積的增加不僅與脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，同時(shí)與脂肪分解相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。飼料脂肪水平和豆油替代影響了脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，最終會(huì)影響肝臟的脂肪沉積。飼料在魚體腸細(xì)胞中形成乳糜微粒后進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而被LPL水解成乳糜殘粒(Chylomicron remnants，CMR)，LPL可以結(jié)合乳糜殘粒并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到肝細(xì)胞，這是飼料中的脂肪酸進(jìn)入肝臟的方式[28]。脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞后，在CPT I的作用下進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化供能，在氧化供能過(guò)程中會(huì)生成乙酰輔酶A。此外，飼料中 n-3 多不飽和脂肪酸會(huì)刺激CPT I的活性，進(jìn)而增加線粒體內(nèi)的脂肪酸氧化和提高β氧化能力[29]。PPARα可以通過(guò)與多不飽和脂肪酸和類視黃醇X受體(Retinoid X receptor，RXR)結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)脂肪酸氧化和線粒體氧化。此外，脂肪酸可以調(diào)節(jié)PPARα的表達(dá)并進(jìn)一步調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，包括LPL和CPT[30]。Lipin 1可以通過(guò)誘導(dǎo)PPARα的表達(dá)來(lái)激活脂肪酸氧化和線粒體氧化，同時(shí)可以抑制脂肪合成并降低循環(huán)脂質(zhì)水平[31]。LXR是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以與配體結(jié)合形成二聚體，形成的二聚體與DNA結(jié)合，可促進(jìn)脂肪的生成，而被激活的PPARα則會(huì)促進(jìn)脂肪酸的氧化[32]。PPARγ是脂肪酸攝取和脂肪生成的關(guān)鍵調(diào)控因子[33]。

當(dāng)大菱鲆攝入的能量不足時(shí)，體內(nèi)AMP/ATP的比值就會(huì)上升，進(jìn)而激活A(yù)MPK磷酸化，誘導(dǎo)Lipin1的基因表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)PPARa的基因表達(dá)，從而上調(diào)CPTI和LPL的基因表達(dá)[34]，這樣提高了肝臟的脂肪分解能力；同時(shí)抑制LXR結(jié)合到應(yīng)答元件上，從而抑制LXR靶基因的轉(zhuǎn)錄水平[35-36]，抑制脂肪的合成。而隨著飼料脂肪水平的上升，魚體攝入能量逐漸升高，Lipin1、PPARa、CPTI和LPL基因表達(dá)量均發(fā)生了下降；LXR和PPARγ的基因表達(dá)量上升。而豆油中富含亞油酸(18：2n-6)，豆油替代對(duì)肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的影響主要原因是飼料中脂肪酸組成的不同。有研究發(fā)現(xiàn)飼料中高水平的n-3 LC-PUFA可能會(huì)促進(jìn)脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)[37-38]，飼料中的n-3 PUFA可以通過(guò)刺激CPT I的酶活力促進(jìn)線粒體膜的流動(dòng)性，進(jìn)而增加線粒體脂肪酸氧化[29]。因此飼料中較高含量的n-3 PUFA會(huì)誘導(dǎo)脂肪分解相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致β-氧化能力增加，降低肝臟的脂肪沉積。當(dāng)用豆油替代飼料中的魚油時(shí)，飼料中n-3 PUFA的含量明顯下降，而n-6 PUFA的含量上升，這就可能引起豆油替代組內(nèi)脂肪氧化的降低，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂肪水平的上升。

各組Lipin1的基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)如圖3所示，當(dāng)飼料中沒(méi)有豆油替代時(shí)，Lipin1的表達(dá)量隨著飼料脂肪水平的上升先下降然后上升，在16%脂肪水平處上升的原因很可能是魚體攝入的能量和n-3 PUFA已經(jīng)超過(guò)魚體需求，這會(huì)激活脂肪分解相關(guān)基因(如Lipin1)的表達(dá)，提高肝臟脂肪分解的能力，避免脂肪過(guò)多沉積；而豆油替代組中Lipin1表達(dá)量雖然沒(méi)有出現(xiàn)顯著的差異(P>0.05)，但有降低的趨勢(shì)，這可能說(shuō)明飼料中的n-6 PUFA會(huì)抑制Lipin1的基因表達(dá)。PPARα的表達(dá)也受到了脂肪水平和豆油替代的影響，在魚油組中PPARα的表達(dá)量隨著飼料脂肪水平的上升而下降；當(dāng)有豆油替代時(shí)，各脂肪水平下PPARα的表達(dá)量均出現(xiàn)了上升，這與之前的研究結(jié)果相一致[9]，也有研究顯示亞油酸可以增加大鼠β細(xì)胞的胰島素分泌[39]，而胰島素會(huì)調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)PPARα的轉(zhuǎn)錄活性[40]，可上調(diào)PPARα基因表達(dá)。由此可見，飼料脂肪水平和豆油中的亞油酸都可上調(diào)PPARα的基因表達(dá)量。CPTI和LPL的表達(dá)量在非替代組中，均隨飼料脂肪水平的上升而下降；在各脂肪水平下，豆油的替代抑制了CPTI和LPL的基因表達(dá)，而在豆油替代的情況下，隨著脂肪水平的上升，兩者的表達(dá)量沒(méi)有出現(xiàn)顯著的變化，這可能說(shuō)明飼料中n-3 PUFA的含量會(huì)影響CPTI和LPL的基因表達(dá)。LXR的表達(dá)量隨著飼料脂肪水平的上升而上升，隨著豆油的替代而下降，該結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，其研究結(jié)果被解釋為飼料中n3 LC-PUFA含量的下降會(huì)導(dǎo)致LXR表達(dá)的下調(diào)[41-42]，本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證了這一現(xiàn)象，說(shuō)明n3 LC-PUFA可能會(huì)促進(jìn)LXR的表達(dá)，而飼料脂肪水平的上升會(huì)促進(jìn)LXR的表達(dá)，進(jìn)而增加脂肪的合成。PPARγ被認(rèn)為是脂肪合成和肝臟脂質(zhì)變性的重要調(diào)控因子[43-46]。飼料脂肪水平的上升促進(jìn)了PPARγ的表達(dá)，豆油替代則抑制了其表達(dá)，與之前的研究相一致[47]，說(shuō)明亞油酸會(huì)抑制PPARγ的表達(dá)，而在豆油替代的情況下，隨著脂肪水平的上升，PPARγ的表達(dá)量沒(méi)有出現(xiàn)顯著的變化，這也可能說(shuō)明飼料中n-3 PUFA的含量會(huì)影響PPARγ的表達(dá)量，即PPARγ的表達(dá)受飼料脂肪水平、n-3 PUFA的含量和亞油酸含量的共同影響。

總體來(lái)說(shuō)，當(dāng)魚體攝入能量不足時(shí)，魚體攝入的脂肪主要用于脂肪分解，此時(shí)脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)上升，同時(shí)，脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)下降，脂肪合成能力下降。當(dāng)魚體攝入能量充足時(shí)，脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)就會(huì)下降，脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)上升，達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)。而在用豆油替代后，各脂肪代謝相關(guān)的基因表達(dá)就會(huì)受到飼料脂肪酸組成變化的影響而表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)飼料主要脂肪源為魚油時(shí)，魚體生長(zhǎng)性能隨飼料脂肪水平升高而具有升高趨勢(shì)。當(dāng)飼料中脂肪水平為12%～16%時(shí)，獲得最優(yōu)的魚體生長(zhǎng)性能。當(dāng)飼料主要脂肪源為豆油時(shí)，大于16%的豆油會(huì)抑制魚體生長(zhǎng)。大菱鲆脂肪代謝顯著受飼料脂肪水平和脂肪來(lái)源的影響。本研究為大菱鲆飼料中脂肪水平及脂肪源的合理選擇提供了一定的理論依據(jù)。