徐善斌 鄭洪亮 劉利鋒 卜慶云 李秀峰, 鄒德堂,

(1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150030;2 中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 哈爾濱 150081;3 黑龍江省種業(yè)技術(shù)服務(wù)中心, 哈爾濱 150008；*通信聯(lián)系人, E-mail: lixiufeng@iga.ac.cn; 13603609603@163.com)

水稻作為全球最重要的糧食作物之一，全世界半數(shù)以上的人口均食用稻米，水稻是保障中國(guó)糧食安全與實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主糧作物[1]。近年來，人們對(duì)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)稻米的需求量越來越大，特別是長(zhǎng)粒香型稻米，如稻花香的價(jià)格是一般非香型大米的2～4 倍，長(zhǎng)粒香米更易受到農(nóng)民和消費(fèi)者們的青睞。傳統(tǒng)的水稻品種改良過程中，主要通過雜交、回交的方式實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的聚合，但傳統(tǒng)育種具有育種周期長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)，而基因編輯技術(shù)可以為水稻品種的快速改良帶來新的契機(jī)。

目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)作為新一代的基因編輯技術(shù)，在作物遺傳育種研究中應(yīng)用較廣泛[2-7]，該技術(shù)可在水稻基因組水平上進(jìn)行基因定向編輯改造[8-11]。水稻中已經(jīng)鑒定出許多與籽粒大小相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，如負(fù)調(diào)控因子GW2[12]、GS3[13]、GS9[14]、qW5/GW5[15]和TGW6[16]，正調(diào)控因 子GL2[17]、GL3.1[18]、GS5[19]、GL7[20]、GLW7/OsSPL13[21]和GW8/OsSPL16[22]。Li 等[23]利用該技術(shù)編輯水稻中的GS3基因，T2代的粒長(zhǎng)和粒重增加，產(chǎn)量得到提高。Zhao 等[14]使用CRISPR/Cas9 技術(shù)，在GS9第1 外顯子處插入1 bp，造成移碼突變，破壞GS9正常表達(dá)，使粒長(zhǎng)增加。

香味是水稻重要的品質(zhì)性狀之一，由第8 染色體上的Badh2基因控制。Badh2編碼一個(gè)由503 個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物[24]。Chen 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在香稻品種中，由于Badh2基因發(fā)生突變，使得香味的主要成分2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量增加，稻米產(chǎn)生香味。Shan 等[26]通過TALEN 技術(shù)，對(duì)Badh2進(jìn)行基因組編輯，稻米的2-AP 含量從無(wú)增加至0.35～0.75 mg/kg，獲得具有香味的稻米。孫慧宇等[27]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)Badh2進(jìn)行編輯，使寒地粳稻東農(nóng)425 香味獲得了改良，但東農(nóng)425適應(yīng)積溫區(qū)較小。因此，我們擬利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)黑龍江省第二、三積溫帶品種龍粳11 進(jìn)行香味改良，從而擴(kuò)大香稻的種植面積。龍粳11 屬早熟品種，其抗稻瘟病較強(qiáng)，抗倒伏，前、后生育時(shí)期耐寒性強(qiáng)。同時(shí)，龍粳11 的稻米品質(zhì)優(yōu)良，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到國(guó)家優(yōu)質(zhì)米標(biāo)準(zhǔn)。

本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，以龍粳11 為研究材料，對(duì)GS3、GS9和Badh2基因同時(shí)進(jìn)行敲除，能夠高效地將圓粒水稻變成長(zhǎng)粒香型水稻，可為加快水稻的種質(zhì)資源改良提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以粳稻龍粳11 為試驗(yàn)材料。在黑龍江哈爾濱（北緯45°）和海南（北緯19°），均以25 cm×25 cm 的株行距種植，自然長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)。

試驗(yàn)所用 pYL-U6a-gRNA 和 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H 雙元載體[28]由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈(zèng)。

1.2 gRNA 靶點(diǎn)接頭設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得GS3（Os03g0407400）、GS9（Os09g0448500）、Badh2(Os08g0424500)的基因序列，利用CRISPRGE 在線網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/）[29]，分別在GS3第1 外顯子、GS9第1 外顯子和Badh2第2 外顯子處設(shè)計(jì)1 對(duì)靶點(diǎn)接頭引物，B1-F/R、B2-F/R 及B3-F/R（表1）。利用軟件CRISPR Primer Designer設(shè)計(jì)GS3、GS9和Badh2基因靶序列，比對(duì)水稻序列，檢測(cè)設(shè)計(jì)靶點(diǎn)是否特異，排除潛在脫靶序列。

參照Ma 等[30]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行載體構(gòu)建，將連接好的載體通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Match1-T1中，菌落PCR 檢測(cè)后，選取陽(yáng)性菌落搖菌后提取質(zhì)粒。利用檢測(cè)引物NOSF/M13F-47(表1)對(duì)載體質(zhì)粒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將檢測(cè)無(wú)誤的質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。

表1 本研究中所用的引物Table 1.Primers used in this research.

1.3 T0 代陽(yáng)性植株的獲得

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將CRISPR/Cas9 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入龍粳11 的愈傷組織中，經(jīng)過潮霉素抗性篩選愈傷組織，分化成T0代植株。在T0代植株成熟期時(shí)，采用CTAB 的方法提取葉片的全基因組DNA，通過引物Hyg-F/R 進(jìn)行檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物大小為289 bp 的植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，篩選出陽(yáng)性苗。設(shè)計(jì)引物Seq1-F/R、Seq2-F/R 和Seq3-F/R，分別擴(kuò)增GS3、GS9和Badh2基因靶點(diǎn)及其附近的序列，使用兼并序列解碼（DSDecode）法[31]分析測(cè)序結(jié)果。

1.4 T1 代無(wú)T-DNA 元件的純合突變植株的篩選

T1代植株成熟時(shí)期，提取葉片基因組DNA，利用引物Hyg-F/R（表1）篩選出無(wú)T-DNA 元件插入的植株。再利用測(cè)序引物Seq1-F/R、Seq2-F/R 和Seq3-F/R，對(duì)無(wú)T-DNA 元件插入的植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果通過DSDecode 方法，篩選出無(wú)T-DNA 元件的三基因純合突變的植株，將其自交繁殖至T2代。

1.5 T2 代植株農(nóng)藝性狀考查

在大田環(huán)境下種植龍粳11野生型和T2代植株，成熟時(shí)期分別測(cè)量粒長(zhǎng)、粒寬、結(jié)實(shí)率、單株產(chǎn)量及千粒重，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析水稻籽粒中的2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量。利用SPSS 18.0 軟件對(duì)農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻GS3、GS9 和Badh2 敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

GS3基因位于第3 染色體，有5 個(gè)外顯子，編碼232 個(gè)氨基酸。GS9基因位于第9 染色體，有4個(gè)外顯子，編碼345 個(gè)氨基酸。Badh2基因位于第8 染色體上，有15 個(gè)外顯子，編碼503 個(gè)氨基酸。GS3、GS9和Badh2基因CDS 序列均與日本晴相同，本研究分別在GS3第1 外顯子、GS9第1 外顯子、Badh2第2 外顯子處設(shè)計(jì)1 對(duì)gRNA 靶點(diǎn)接引物，分別對(duì)GS3、GS9、Badh2基因進(jìn)行編輯(圖1)。

2.2 GS3、GS9 和Badh2 基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)“金門”克隆法將帶有3 個(gè)靶點(diǎn)的gRNA 表達(dá)盒連接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H 載體骨架上，構(gòu)建好的載體即為 pYLCRISPR/Cas9-GS3/GS9/Badh2-gRNA 載體(圖2)。

2.3 T0 代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗檢測(cè)及突變情況

16 株T0代再生苗中有8 株為陽(yáng)性苗，陽(yáng)性率為50%（圖3）。利用測(cè)序引物Seq1-F/R、Seq2-F/R和Seq3-F/R 擴(kuò)增8 株陽(yáng)性植株的靶點(diǎn)區(qū)域序列，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，測(cè)序比對(duì)后，8 株陽(yáng)性植株中有4株發(fā)生了突變，突變率為50%。

圖1 GS3、GS9 和Badh2 基因結(jié)構(gòu)和靶點(diǎn)位置Fig.1.Gene structure and target site ofGS3,GS9 and Badh2.

圖2 pYLCRISPR/Cas9-GS3/GS9/Badh2-gRNA 載體Fig.2.pYLCRISPR/Cas9-GS3/GS9/Badh2-gRNA vector.

圖3 T0 代植株轉(zhuǎn)基因檢測(cè)Fig.3.Transgenic detection of T0 generation plants.

2.4 T1代無(wú)T-DNA 元件三基因純合突變植株的篩選

將三基因突變植株自交繁殖獲得T1代植株，于成熟期提取葉片基因組DNA，利用引物Hyg-F/R篩選出無(wú)T-DNA 元件插入的植株。再利用引物Seq1-F/R、Seq2-F/R 和Seq3-F/R 進(jìn)行擴(kuò)增，通過DSDecode 方法分析測(cè)序結(jié)果，篩選出 2 株無(wú)T-DNA 元件的三基因純合突變植株（55-2、58-2），分析GS3、GS9、Badh2基因突變的具體情況（圖4）。

2.5 T2 代植株農(nóng)藝性狀分析及香味鑒定

圖4 三基因純合突變植株測(cè)序結(jié)果Fig.4.Sequencing result of homozygous plants with triple gene mutation.

圖5 T2 代植株農(nóng)藝性狀考查Fig.5.Agronomic traits of T2 generation plants.

圖6 龍粳11 及突變體中香味物質(zhì)2-AP 的含量Fig.6.2-acetyl-1-pyrroline(2-AP) content of Longjing 11 and mutant plants.

將野生型龍粳11 與55-2 株系、58-2 株系的農(nóng)藝性狀進(jìn)行比較(圖5)，發(fā)現(xiàn)55-2 株系和58-2 株系的粒長(zhǎng)比野生型植株分別增加27.01%、26.43%，都達(dá)到了極顯著的水平，粒寬較野生型植株降低13.4%、24.6%，結(jié)實(shí)率沒有顯著變化，單株產(chǎn)量分別增加10.82%、12.11%，千粒重分別增加18.34%、41.36%，58-2 株系千粒重增加比例顯著(圖5)。研究表明，通過CRISPR/Cas9 技術(shù)同時(shí)對(duì)GS3、GS9基因進(jìn)行編輯，高效地將圓粒水稻變長(zhǎng)，在育種方面加速了新品系的創(chuàng)制。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)野生型龍粳11、突變體55-2、58-2 株系中籽粒的2-AP 含量進(jìn)行分析（圖6）。野生型龍粳11 中2-AP 含量約87.13 μg/kg，與龍粳11 對(duì)照相比，55-2 株系中香味物質(zhì)2-AP 含量增加至248.22 μg/kg，58-2 株系中2-AP增加至176.43 μg/kg。55-2 株系和58-2 株系分別在Badh2基因第2 外顯子處缺失2 bp、插入1 bp，均產(chǎn)生移碼突變。結(jié)果表明，通過對(duì)Badh2基因進(jìn)行編輯，能有效創(chuàng)制香型水稻種質(zhì)新資源。

3 討論

CRISPR/Cas9 技術(shù)與傳統(tǒng)育種相比，因其具有操作簡(jiǎn)單、編輯效率高和成本低等優(yōu)點(diǎn)，正廣泛應(yīng)用于水稻的種質(zhì)改良中[32-35]，極大地縮短了培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻品種的周期。本研究以粒型負(fù)調(diào)控基因GS3、GS9和香味負(fù)調(diào)控基因Badh2為目標(biāo)基因，構(gòu)建 pYLCRISPR/Cas9-GS3/GS9/Badh2-gRNA 載體，對(duì)GS3、GS9、Badh2基因進(jìn)行敲除，篩選出兩個(gè)無(wú)T-DNA 元件的三基因純合突變株系。

GS3和GS9是粒長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子。Nan 等[36]利用具有g(shù)s3等位基因的供體GKBR 與黑龍江省優(yōu)良栽培品種空育131 雜交后，以空育131 為輪回母本，經(jīng)過回交3 代改善了空育131 的GS3位點(diǎn)，籽長(zhǎng)增加12.05%，千粒重和單株總粒數(shù)提高，進(jìn)而產(chǎn)量增加，但改良周期過長(zhǎng)，效率低。通過CRISPR/Cas9 技術(shù)可以極大地縮短育種年限，還大幅度提高粒長(zhǎng)。Li 等[23]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)GS3基因進(jìn)行編輯，破壞GS3正常表達(dá)，粒長(zhǎng)增加20%。Zhao 等[14]使用CRISPR/Cas9 技術(shù)，在GS9第1 外顯子處插入1 bp，使粒長(zhǎng)增加5.5%。本研究通過將兩個(gè)基因連入同一載體，同時(shí)對(duì)GS3和GS9進(jìn)行編輯。通過對(duì)GS3和GS9基因進(jìn)行編輯，粒長(zhǎng)與野生型相比差異達(dá)到極顯著水平，增幅為26.43%～27.01%，增幅大于通過CRISPR/Cas9 技術(shù)分別敲除GS3和GS9的效果，單株產(chǎn)量增加10.82%～12.11%，結(jié)實(shí)率沒有顯著變化，千粒重增加 18.34%～41.36%。研究結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)可以培育出長(zhǎng)粒型且高產(chǎn)的品種，加快長(zhǎng)粒種質(zhì)資源的創(chuàng)制。

傳統(tǒng)的香稻育種主要通過雜交和回交選育，但因其后代分離不穩(wěn)定、試驗(yàn)周期漫長(zhǎng)、抗逆性較弱、產(chǎn)量較低等因素，使得培育出穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良香稻品種較為困難。本研究對(duì)Badh2基因進(jìn)行編輯后，通過對(duì)籽粒的2-AP 含量進(jìn)行分析，Badh2基因功能缺失后香味物質(zhì)2-AP 含量由87.13 μg/kg 增加至176.43～248.22 μg/kg，香味物質(zhì)2-AP 顯著提高。孫慧宇等[27]通過CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)Badh2基因進(jìn)行編輯，在香味檢測(cè)時(shí)采用咀嚼法和氫氧化鉀浸泡法，主觀干擾性大。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，定量分析水稻籽粒中的2-AP 含量，結(jié)果更客觀準(zhǔn)確。

綜上所述，本研究以龍粳11 為材料，通過CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)GS3、GS9和Badh2基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除并獲得了無(wú)T-DNA 元件的三基因純合突變體材料，使龍粳11 粒型變長(zhǎng)，單株產(chǎn)量增加，千粒重增加，同時(shí)香味物質(zhì)2-AP 含量增加，創(chuàng)制出長(zhǎng)粒香型水稻品種，為培育產(chǎn)量與品質(zhì)均提高的水稻品種提供了理論和材料基礎(chǔ)，加速了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)香稻品種的選育進(jìn)程。

謝辭：中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所對(duì)本研究給予了極大幫助，在此表示感謝。