孫菲 周柯 田克勇 常會(huì)敏 王潔 邱建華 查定軍

感音神經(jīng)性聾(sensorineural hearing loss，SNHL)主要是由于噪聲暴露、環(huán)境改變、老齡化、感染以及耳毒性藥物使用等因素造成耳蝸毛細(xì)胞(hair cells, HCs)、螺旋神經(jīng)元(spiral ganglion neurons, SGNs)及其聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)通路神經(jīng)元的損傷、死亡所致。由于哺乳動(dòng)物耳蝸HCs和SGNs均不可再生，其防護(hù)成為SNHL防治的關(guān)鍵。SGNs是位于螺旋神經(jīng)節(jié)(spiral ganglion, SG)內(nèi)的初級(jí)聽(tīng)覺(jué)傳入神經(jīng)元，與螺旋器HCs形成突觸聯(lián)系，將其感知的聲信息向聽(tīng)覺(jué)中樞傳遞[1,2]。SG屬于外周感覺(jué)神經(jīng)節(jié)組織，沿耳蝸軸呈螺旋式分布，主要由神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和纖維結(jié)締組織共同構(gòu)成，而膠質(zhì)細(xì)胞主要包括雪旺細(xì)胞(schwann cells, SCs)和衛(wèi)星細(xì)胞(satellite glial cells, SGCs)，它們與SGNs的神經(jīng)纖維和胞體形成聯(lián)系，部分形成髓鞘結(jié)構(gòu)[3]。神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞間相互聯(lián)系，是調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)突觸傳遞、神經(jīng)代謝平衡和神經(jīng)保護(hù)作用的重要基礎(chǔ)[4,5]。對(duì)耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外研究，探明耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞的具體功能有望揭示這些重要問(wèn)題[6,7]，為聽(tīng)力損傷的有效預(yù)防提供重要依據(jù)。提取膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)不可避免混雜神經(jīng)元和結(jié)締組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞，故需要進(jìn)一步純化；常用的純化方法有差速貼壁法、差速消化法、抗有絲分裂法、冷噴注法和免疫磁珠分選法等，每種方法都存在可能影響細(xì)胞產(chǎn)量、純度或活性的因素[8～10]。為優(yōu)化細(xì)胞產(chǎn)量、活性和純度，本研究采用蝸軸組織塊培養(yǎng)法獲得增殖的膠質(zhì)細(xì)胞，避免了酶消化法摻入大量成纖維細(xì)胞，再聯(lián)合冷噴注法進(jìn)行純化，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8檢測(cè)以及免疫熒光方法計(jì)算其產(chǎn)量、活性和純度，并與組織酶消化及阿糖胞苷補(bǔ)充法、酶消化及免疫磁珠分選法進(jìn)行比較，為進(jìn)一步研究膠質(zhì)細(xì)胞具體功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 多聚賴氨酸、牛血清白蛋白(BSA)、阿糖胞苷購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，胰蛋白酶trypsin-EDTA、I型膠原酶，基質(zhì)膠(Matrigel；Corning)購(gòu)自BD公司，Hank’s 平衡鹽溶液(HBSS；Invitrogen)、Dulbecco's磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)、高糖DMEM、DMEM/F-12 GlutamaxTM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、B-27添加劑、N2添加劑(Gibco)購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司，表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hbFGF)購(gòu)自PeproTech公司，免疫磁珠、細(xì)胞濾器和分離柱購(gòu)自Miltenyi Biotech公司，單克隆兔抗P75LNGFR抗體、單克隆小鼠抗S100β抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，多克隆兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購(gòu)自Abcam公司，驢血清(NDS)購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司，含DAPI防熒光淬滅封片劑(Vectashield)購(gòu)自Vector Laboratories公司，CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自翊圣生物科技公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及耳蝸軸組織準(zhǔn)備 研究方案得到空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。新生SD大鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，選取18只(36耳)出生后三天(P3)的健康乳鼠，雌雄不限，將大鼠斷頸處死，頭顱矢狀位正中斷開(kāi)，放入盛有冰凍生理鹽水的玻璃平皿中，去除大腦和小腦組織，暴露顱中窩和顱后窩。體視解剖顯微鏡(SZX10；Olympus)下，在枕骨大孔正上方打開(kāi)未骨化聽(tīng)泡，完整取出耳蝸，放入盛有冰凍HBSS平皿中。剝開(kāi)蝸殼后暴露耳蝸軟組織，分離去除膜蝸管外側(cè)壁螺旋韌帶、血管紋和基底膜組織，將含有SG的蝸軸組織備用。

1.3耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和純化 以下三種方法單次均使用4耳(2只乳鼠)蝸軸組織分離膠質(zhì)細(xì)胞，并重復(fù)三次，以計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)量、活性和純度。

1.3.1組織酶消化及阿糖胞苷補(bǔ)充法 蝸軸組織剪碎后與400 μl高糖DMEM 混合加入1.5 ml離心管，300×g 5 min 4 ℃離心，去除上清液；加入50 μl 37 ℃預(yù)熱0.25% trypsin-EDTA和0.125% I型膠原酶，37 ℃水浴10 min，加入50 μl 蛋白酶抑制劑和100 μl PBS以滴管吹打20次，將混懸液通過(guò)40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，移入1.5 ml離心管，300×g 5 min 4 ℃離心，去除上清；加入1 ml DMEM/F-12 Glutamax、10% FBS、1× B-27(膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基)，吸取100 μl細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并檢測(cè)細(xì)胞活性，其余均勻接種于含有多聚賴氨酸包被載玻片的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入足量培養(yǎng)基，隔天更換1/2培養(yǎng)基，共培養(yǎng)7 d。觀察膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，如單個(gè)顯微鏡視野內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞與成纖維細(xì)胞比例超過(guò)3∶1時(shí)，在培養(yǎng)基中添加阿糖胞苷(5 μmol/L)以抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，達(dá)到純化目的。

1.3.2組織酶消化及免疫磁珠分選法 蝸軸組織按上述方法進(jìn)行酶消化，終止酶反應(yīng)的細(xì)胞沉淀以1 ml 含10% BSA的DPBS緩沖液沖洗，重懸并進(jìn)行計(jì)數(shù)，按每107個(gè)細(xì)胞離心加入10 μl 兔抗P75LNGFR抗體，4 ℃孵育15 min 后，300×g 5 min 4 ℃離心，去除上清液；以4 ℃緩沖液清洗兩次，并以500 μl含5% BSA、2 mM EDTA的DPBS(磁珠緩沖液)重懸細(xì)胞，加入10 μl羊抗兔IgG標(biāo)記的免疫磁珠4 ℃孵育15 min，離心清洗兩次并以1 ml磁珠緩沖液重懸細(xì)胞；滴加入置于磁性分離器上的細(xì)胞濾器和分離柱中，細(xì)胞懸液通過(guò)后用等體積磁珠緩沖液清洗細(xì)胞濾器和分離柱三次，將分離柱移出磁場(chǎng)，用兩倍體積磁珠緩沖液快速?zèng)_洗分離柱，洗脫的分選細(xì)胞以1 ml膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，吸取100 μl細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并檢測(cè)細(xì)胞活性，其余接種于培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)7 d。

1.3.3組織塊培養(yǎng)及細(xì)胞冷噴注法 4 ml DMEM/F-12 Glutamax加入150 μl冷凍Matrigel并混合均勻，將400 μl Matrigel混合物包被于35 mm培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2孵箱中1 h，隨后吸去并余留10 μl DMEM/F-12 Glutamax培養(yǎng)基。將蝸軸組織剪成1 mm長(zhǎng)度，貼于Matrigel包被培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫下靜置2～3 min使其貼壁，滴加400 μl DMEM/F-12 Glutamax、1×B-27、1×N2培養(yǎng)基(神經(jīng)組織培養(yǎng)基)，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，隔天更換1/2培養(yǎng)基；約第4 d，待膠質(zhì)細(xì)胞從組織塊中長(zhǎng)出并融合至80%時(shí)，棄去組織塊和培養(yǎng)基，加入2 ml 4 ℃含10% FBS的DMEM/F-12 Glutamax培養(yǎng)基，然后快速棄去，重復(fù)上述操作直至顯微鏡下觀察細(xì)胞偽足收縮，將培養(yǎng)皿置于冰水浴中用玻璃吸管以中等力度吹打細(xì)胞(1次/s)，避免將吸頭與培養(yǎng)皿底部接觸，并不在同一部位吹打，以免造成成纖維細(xì)胞脫落；細(xì)胞懸液300×g 5 min 4 ℃離心，去除上清液，加入1 ml膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，吸取100 μl細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并檢測(cè)細(xì)胞活性，其余接種于培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.4膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞活性計(jì)算 三種方法各取10 μl細(xì)胞懸液，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量計(jì)算，按照稀釋比例計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)量。根據(jù)細(xì)胞總數(shù)量，加入一定比例的膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基使三種方法細(xì)胞懸液細(xì)胞密度相等，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μl/孔)，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)2 h使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞活性采取CCK-8檢測(cè)方法，根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，吸去檢測(cè)孔培養(yǎng)基，PBS清洗3遍后每孔加入100 μl培養(yǎng)基和10 μl CCK-8溶液，將96孔板檢測(cè)孔周圍空白孔加入100 μl PBS防止培養(yǎng)基揮發(fā)(并作為空白組)，孵育2 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各待測(cè)組樣本450 nm吸光度(A)，細(xì)胞活性(%)=[各組A-空白組A]/[對(duì)照組(組織酶消化及阿糖胞苷補(bǔ)充法)A-空白組A] ×100。

1.5膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)純度計(jì)算 三種方法純化后培養(yǎng)7 d的膠質(zhì)細(xì)胞以4%多聚甲醛固定30 min，以0.01 M PBS清洗，以含5% NDS和0.1% Triton X-100的封閉液37 ℃封閉40 min，然后與抗體稀釋液(含1% NDS和0.1% Triton X-100的0.01 M PBS)稀釋的小鼠抗S100β抗體(1∶250)、兔抗GFAP抗體(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜孵育，空白對(duì)照以PBS代替抗體；然后與Alexa Fluor 594標(biāo)記驢抗小鼠IgG、Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG(1∶800)室溫下孵育45 min，PBS清洗后以含DAPI的Vectashield封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡(FV1000；Olympus)下觀察。細(xì)胞核為DAPI(藍(lán)色)襯染，膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)同時(shí)表達(dá)S100β(紅色)和GFAP(綠色)，成纖維細(xì)胞不表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。每種純化細(xì)胞中隨機(jī)選擇10個(gè)60倍物鏡視野，計(jì)算DAPI襯染細(xì)胞核總數(shù)，以及S100β/GFAP陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞純度(%)=S100β/GFAP陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)/DAPI襯染細(xì)胞核總數(shù)×100。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過(guò)SPSS軟件(19.0版本)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，細(xì)胞產(chǎn)量比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，各組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；細(xì)胞活性和純度比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同純化方法獲得膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況 如圖1所示，膠質(zhì)細(xì)胞增殖迅速，呈典型的梭形或紡錘狀，折光性較強(qiáng)，胞體飽滿立體，具有雙極或多極細(xì)胞突起，增殖的細(xì)胞成束狀分布，相鄰細(xì)胞突起相連，呈“牽手狀”；培養(yǎng)至3～5 d，細(xì)胞數(shù)量顯著增多，細(xì)胞間緊密融合，交織成網(wǎng)狀或形成旋渦狀。組織酶消化及阿糖胞苷補(bǔ)充法純化得到的膠質(zhì)細(xì)胞下方，可見(jiàn)多數(shù)扁平多角形或不規(guī)則形的成纖維細(xì)胞，胞體較大，折光性較差，呈交疊或融合生長(zhǎng)。組織酶消化及免疫磁珠分選法純化得到的膠質(zhì)細(xì)胞占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少。蝸軸組織貼壁培養(yǎng)后6 h內(nèi)即可觀察到大量圓形、折光性較強(qiáng)的圓形細(xì)胞從組織塊周圍爬出，12 h左右折光性較強(qiáng)細(xì)胞伸展為梭形或紡錘形，組織周圍還分布有少量胞體較大的成纖維細(xì)胞；培養(yǎng)至第4 d進(jìn)行冷噴注處理時(shí)，可見(jiàn)絕大多數(shù)膠質(zhì)細(xì)胞偽足收縮，成為高折光性的圓形細(xì)胞，經(jīng)吸管多次吹打后，絕大部分細(xì)胞從培養(yǎng)皿底壁解離懸浮，而成纖維細(xì)胞依然貼壁。收集懸液后，培養(yǎng)皿中僅有少量膠質(zhì)細(xì)胞殘留，并留有大量成纖維細(xì)胞。

圖1 不同純化方法獲得膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和免疫熒光鑒定 a. 組織酶消化及阿糖胞苷補(bǔ)充法:a1. 組織酶消化獲得的貼壁細(xì)胞(×200); a2. 阿糖胞苷未能有效抑制成纖維細(xì)胞增殖(5 d,×200); b. 組織酶消化及免疫磁珠分選法:b1. 免疫磁珠分選的貼壁細(xì)胞(×100); b2. 經(jīng)培養(yǎng)后膠質(zhì)細(xì)胞純度較高(5 d,×100); b3. 細(xì)胞免疫熒光,絕大多數(shù)細(xì)胞共表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和S100β(7 d,×600); c. 組織塊培養(yǎng)及細(xì)胞冷噴注法:c1. 蝸軸組織塊周圍的膠質(zhì)細(xì)胞(2 d,×40); c2. 冷噴注使膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)收縮(×100); c3. 純化后的膠質(zhì)細(xì)胞(5 d,×100); c4. 細(xì)胞免疫熒光,箭頭所示細(xì)胞不表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(7 d,×600)

2.2不同純化方法獲得膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)量、活性及純度 如表1所示，三種不同純化方法獲得的細(xì)胞產(chǎn)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；以組織酶消化及阿糖胞苷補(bǔ)充法獲得的膠質(zhì)細(xì)胞活性為對(duì)照(100 %)，組織酶消化及免疫磁珠分選法細(xì)胞活性最低，為78.2%±5.8 %，組織塊培養(yǎng)及細(xì)胞冷噴注法細(xì)胞活性最高，為137.7%±8.6 %，三種方法之間細(xì)胞活性差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織酶消化及免疫磁珠分選法獲得膠質(zhì)細(xì)胞的純度最高，組織塊培養(yǎng)及細(xì)胞冷噴注法純度次之，兩種方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組織酶消化及阿糖胞苷補(bǔ)充法作為對(duì)照方法，獲得膠質(zhì)細(xì)胞的純度最低，與以上兩種方法比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 三種分離純化方法獲得膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)量、活性及純度

3 討論

SGNs包含兩種類型，I型為有髓鞘的雙極神經(jīng)元，約占SGNs總數(shù)的90%～95%，支配內(nèi)毛細(xì)胞并對(duì)不同頻率的聲信號(hào)進(jìn)行編碼；II型為胞體較小、無(wú)髓鞘的假單極神經(jīng)元，支配外毛細(xì)胞和部分支持細(xì)胞并反饋調(diào)節(jié)聽(tīng)覺(jué)感受。膠質(zhì)細(xì)胞主要包括SCs和SGCs，分別與SGNs的神經(jīng)纖維和胞體形成聯(lián)系，SCs與I型SGNs軸突形成髓鞘結(jié)構(gòu)，易化聽(tīng)覺(jué)信息的傳導(dǎo)；SGCs緊密包繞SGNs胞體與之共同構(gòu)成一個(gè)功能性單元，其具體功能仍然不清楚[1～3]。研究證實(shí)外周感覺(jué)神經(jīng)節(jié)SGCs表達(dá)多種離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)受體以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸傳遞過(guò)程中的神經(jīng)活性，并且形成一個(gè)與血腦屏障十分類似的選擇性通透屏障來(lái)調(diào)節(jié)局部神經(jīng)微環(huán)境和代謝，這與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形細(xì)胞具有諸多相似之處[5]。HCs、SGNs 生理穩(wěn)態(tài)的維持，需要支持細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的物理保護(hù)，以及多種神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)以及神經(jīng)活性物質(zhì)的共同調(diào)節(jié)。耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)為研究其與外周神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能異同、神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞間相互作用參與耳蝸神經(jīng)發(fā)育、微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、突觸調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等功能的調(diào)節(jié)機(jī)制創(chuàng)造了便利條件；具有修復(fù)受損SGNs潛在能力的組織工程耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞有望為聽(tīng)力損傷的防治提供新的策略。

目前，有關(guān)周圍神經(jīng)SCs體外培養(yǎng)和功能研究的方法較為成熟，其主要用于研究周圍神經(jīng)修復(fù)的相關(guān)機(jī)制，或?yàn)樾迯?fù)周圍神經(jīng)缺損提供種子細(xì)胞[8～10]。對(duì)耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的相關(guān)研究較少，獲得數(shù)量充足、純度高、細(xì)胞活性好的耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞具有一定挑戰(zhàn)性[6,7]。傳統(tǒng)的分離過(guò)程不可避免地混合有成纖維細(xì)胞等細(xì)胞成分，其增殖相對(duì)迅速會(huì)降低膠質(zhì)細(xì)胞的純度。如何去除成纖維細(xì)胞并提高膠質(zhì)細(xì)胞的純度，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的問(wèn)題。SCs的純化方法主要包括差速貼壁法、差速消化法、抗有絲分裂法、冷噴注法和免疫磁珠分選法等[8～10]。差速貼壁法利用SCs貼壁時(shí)間短的原理，但存在損失大量細(xì)胞、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)；差速消化法利用成纖維細(xì)胞更容易被胰蛋白酶消化解離的特點(diǎn)，但胰蛋白酶處理會(huì)造成SCs損傷和活性下降等風(fēng)險(xiǎn)；抗有絲分裂法使用一定濃度的抗有絲分裂藥物(如阿糖胞苷)抑制成纖維細(xì)胞增殖，但該方法對(duì)SCs的分裂同樣有抑制效應(yīng)，并影響細(xì)胞活性，需要控制阿糖胞苷的濃度和處理時(shí)間。冷噴注法利用的是膠質(zhì)細(xì)胞與培養(yǎng)板接觸面積較小，使用冷卻的緩沖溶液或培養(yǎng)基使其胞質(zhì)迅速收縮并解離，而成纖維細(xì)胞接觸面積較大解離不完全；該方法成本低廉，無(wú)需使用細(xì)胞毒性藥物，保持細(xì)胞活性且細(xì)胞純度較高。免疫磁珠分選法獲得的分選細(xì)胞純度最高，缺點(diǎn)是試劑成本較高，操作中會(huì)損失大量細(xì)胞造成產(chǎn)量下降，并且對(duì)分選細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷而影響細(xì)胞活性。

為獲得理想的細(xì)胞產(chǎn)量、活性和純度，本研究采用蝸軸組織塊培養(yǎng)法聯(lián)合冷噴注法作為耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的純化方法，并與組織酶消化阿糖胞苷補(bǔ)充法(抗有絲分裂法)以及免疫磁珠分選法進(jìn)行比較。其中，組織酶消化及阿糖胞苷補(bǔ)充法先通過(guò)酶處理獲得蝸軸組織大部分細(xì)胞，其細(xì)胞產(chǎn)量最高，細(xì)胞活性適中，但在培養(yǎng)過(guò)程中即使添加阿糖胞苷抑制成纖維細(xì)胞增殖，膠質(zhì)細(xì)胞純度仍然急劇下降，因此在本研究中作為對(duì)照方法；組織酶消化及免疫磁珠分選法，首先通過(guò)酶消化獲得解離細(xì)胞，然后通過(guò)磁珠分選，基本去除成纖維細(xì)胞，獲得的膠質(zhì)細(xì)胞純度最高，但分選操作對(duì)細(xì)胞有破壞作用，文中結(jié)果顯示所得細(xì)胞產(chǎn)量低，細(xì)胞活性最差；組織塊培養(yǎng)及細(xì)胞冷噴注法首先通過(guò)分離耳蝸軸組織進(jìn)行培養(yǎng)，相對(duì)保留了神經(jīng)和纖維結(jié)締組織的完整性，避免了組織酶消化后混合入大量難以去除的成纖維細(xì)胞；蝸軸內(nèi)離斷受損的神經(jīng)組織發(fā)生華勒氏變性(Wallerian degeneration)，膠質(zhì)細(xì)胞與SGNs神經(jīng)纖維形成的緊密結(jié)構(gòu)發(fā)生解離，并在組織塊邊緣增殖；再使用冷培養(yǎng)基噴注純化膠質(zhì)細(xì)胞，所需材料容易獲得且成本低廉，操作方法較為簡(jiǎn)便，文中結(jié)果顯示，與其它兩種方法相比，其對(duì)細(xì)胞活性保持最好，且純化后細(xì)胞純度接近磁珠分選法，但該方法獲得的細(xì)胞產(chǎn)量不高，低于其它兩種方法；可見(jiàn)，如需獲得大量純度較高的耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞，可首選使用數(shù)量足夠的組織，進(jìn)行組織塊培養(yǎng)及細(xì)胞冷噴注純化，可獲得細(xì)胞活性和純度較好的細(xì)胞。

綜上所述，耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化采用蝸軸組織塊培養(yǎng)及細(xì)胞冷噴注法，操作簡(jiǎn)便且使用成本低，獲得的耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量適中，細(xì)胞活性良好且細(xì)胞純度較高；該方法可作為一種便捷的耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和純化方法，為進(jìn)一步研究耳蝸膠質(zhì)細(xì)胞具體功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。