曹志駿 張志昱 歐陽駿 浦金賢 侯建全 張江磊

腎透明細胞癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，在我國發(fā)病率已達到6.8/10萬[1]，而當下腫瘤免疫治療已成為腎癌綜合治療的研究熱點之一[2-3]，其中白細胞介素9(interleukin-9， IL-9)已證實與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[4-9]。本研究旨在通過免疫組織化學(xué)法檢測腎透明細胞癌及癌旁組織中IL-9表達水平的差異，以探索IL-9與腎透明細胞癌的臨床病理特征之間的關(guān)系。

材料與方法

一、一般資料

回顧分析蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2018年1～12月期間術(shù)后病理證實為腎透明細胞癌且癌旁組織未受侵犯的患者數(shù)據(jù)，剔除有自身免疫性疾病病史或有傳染病史者，共納入病例66例，包括腔鏡腎癌根治術(shù)37例、開放腎癌根治術(shù)1例、腔鏡保留腎單位術(shù)28例。其中男40例，女26例；年齡35～82歲，平均年齡61.62歲；腫瘤直徑≤4 cm 40 例，>4 cm～<7 cm 17例，≥7 cm 9例；根據(jù)R.E.N.A.L.評分標準：≤6分29例，>6分37例；根據(jù)Fuhrman組織學(xué)分級：Ⅰ級24例，Ⅱ級28例，Ⅲ級11例，Ⅳ級3例；根據(jù)2010年美國癌癥聯(lián)合會TNM分期標準：Ⅰ期46例，Ⅱ期20例。

二、免疫組織化學(xué)法檢測

1.標本采集：分別收集入組患者標本，分為腎癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣2 cm以上，且術(shù)后病理證實無腫瘤細胞侵犯，其中保留腎單位術(shù)時由于背向操作視野的腫瘤切除往往因瘤體阻擋而切除范圍較廣，因而距腫瘤邊緣也有2 cm)，分別將其固定在10%甲醛溶液中，并經(jīng)石蠟包埋后再切片存檔。

2.免疫組化SP法：取出保存的石蠟切片，先脫蠟水化，后PBS洗片，再用檸檬酸緩沖液沖洗。隨后用3%的H2O2滴于切片上，加入滅活內(nèi)源性過氧化物酶并在室溫下維持10 min，PBS再次洗片，滴加5% BSA 50 ml后室溫孵育10 min。再滴加IL-9一抗(1∶200稀釋)后在4℃冰箱過夜，后用PBS洗片。在室溫下加入二抗靜置60 min，后用PBS洗片。隨后用DAB顯色劑反應(yīng)5 min，然后用蘇木素復(fù)染，并用梯度濃度乙醇脫水，最后用中性樹脂封片并進行觀察。

3.結(jié)果判定標準：IL-9主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達，故認定200倍鏡下細胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或者棕褐色顆粒為檢驗陽性。對檢驗陽性的切片再隨機觀察10個400倍鏡視野，并按照陽性細胞所占比例以及染色強度進行賦值評分，具體為：陽性染色細胞所占比例<5%計為0分，5%～30%計為1分，31%～60%計為2分，>60%計為3分；陽性細胞染色強度無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分；最后將陽性染色細胞比例評分與染色強度評分相乘，并認定乘積<2分為表達陰性(-)，≥2分為表達陽性(+)[10]。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、腎透明細胞癌和癌旁組織中IL-9的表達

免疫組化染色顯示(圖1、表1)，腎透明細胞癌組織中IL-9陰性表達59例，陽性表達7例，陽性率為10.61%；癌旁組織中IL-9陰性表達5例，陽性表達61例，陽性率為92.42%。結(jié)果表明，IL-9在腎透明細胞癌組織中低表達，在癌旁組織中高表達，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A：IL-9在腎透明細胞癌組織中表達陰性；B：IL-9在腎透明細胞癌組織中表達陽性；C：IL-9在癌旁組織中表達陰性；D：IL-9在癌旁組織中表達陽性圖1 腎透明細胞癌組織和癌旁正常組織中IL-9蛋白的表達(SP，×100)

表1 腎透明細胞癌組織和癌旁組織中IL-9的表達情況[例(%)]

二、腎透明細胞癌中IL-9的表達與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

研究結(jié)果表明(表2)，腎透明細胞癌中IL-9的表達水平與患者的性別、體重質(zhì)量指數(shù)(body mass index， BMI)、年齡、腫瘤直徑及TNM分期無關(guān)(P>0.05)。而R.E.N.A.L.評分≤6分者的IL-9陽性表達水平顯著高于R.E.N.A.L.評分>6分者(P=0.028)。細胞中低分化者的IL-9陽性表達水平則明顯低于細胞高分化者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。

表2 IL-9的表達與腎透明細胞癌臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，免疫微環(huán)境的破壞與腎透明細胞癌的發(fā)生有關(guān)[2-3]。因此，腫瘤免疫治療可以作為綜合治療腎透明細胞癌的手段之一。IL-9是一種具有多種生物學(xué)作用的細胞因子，主要通過激活STAT1、STAT3、STAT5通路由Th9細胞產(chǎn)生[11-12]，其與腫瘤的關(guān)系目前尚未完全闡明。一方面IL-9可以抑制黑色素瘤和鱗狀細胞癌等的生長[5-7]，這可能與IL-9刺激DC細胞進入前哨淋巴結(jié)，激活CTL細胞抗原啟動并進入腫瘤組織有關(guān)[13]；另一方面，在淋巴瘤等血液惡性疾病患者的血液中檢測到高表達的IL-9，而使用抗體阻斷IL-9后可以減緩腫瘤的進展[14]，表明IL-9也可以促進腫瘤的發(fā)展[8-9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-9在腎透明細胞癌組織中陽性表達率低而在癌旁組織中陽性表達率高，說明IL-9對腎透明細胞癌的作用可能為抑制腫瘤的生長。其原因可能是腎透明細胞癌通過阻斷STAT1、STAT3、STAT5等通路來抑制Th9等免疫效應(yīng)細胞分泌IL-9。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，喉鱗狀細胞癌和小細胞肺癌患者中IL-9的表達比正常對照組高，且Ⅲ、Ⅳ期患者IL-9的表達也比Ⅰ、Ⅱ期患者高，說明IL-9的表達水平與腫瘤的分期有一定的關(guān)系[15-16]。本研究中，我們并未發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌中IL-9的表達與TNM分期存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，這可能與納入本研究的患者數(shù)量有限有關(guān)，且患者分期均在Ⅰ、Ⅱ期，缺少Ⅲ、Ⅳ期的患者數(shù)據(jù)進一步進行統(tǒng)計分析。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)IL-9的表達與R.E.N.A.L.評分呈負相關(guān)，提示R.E.N.A.L.評分系統(tǒng)除了可以作為腎癌手術(shù)難度的輔助評估參考外，對于IL-9在腎癌組織中的表達情況也有一定的參考作用，這可能與R.E.N.A.L.評分越高的患者，往往侵犯腎臟范圍越廣，腫瘤的惡性程度相對越高有關(guān)。然而本研究為單中心、小樣本研究，R.E.N.A.L.評分系統(tǒng)與腎癌組織IL-9表達的關(guān)系仍待今后多中心、大樣本的研究來進一步證實。同樣的，本實驗研究也發(fā)現(xiàn)組織分化越差的患者，其IL-9的表達水平越低，提示IL-9可能對腎癌的發(fā)生、發(fā)展起著一定的抑制作用，今后我們將進一步詳細研究STAT1、STAT3、STAT5等相關(guān)通路來嘗試闡述IL-9抑制腎透明細胞癌的相關(guān)機制。

綜上所述，腎透明細胞癌患者若IL-9低陽性表達，則往往伴隨更高的R.E.N.A.L.評分，即具有更復(fù)雜的手術(shù)難度，同時也可能具有更差的分化程度，即預(yù)示著預(yù)后不良。IL-9可能具有的抗腎透明細胞癌的免疫機制也尚待進一步研究。