杜秋瑤，張云峰，王繼芬，王 璐，常 靖，董林沛，吳小軍，劉冰潔

(1.中國人民公安大學 偵察學院，北京 100038; 2.公安部 物證鑒定中心，北京 100038;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191; 4.SCIEX 亞太應用支持中心，北京 100015)

由于農(nóng)藥暴露和某些慢性疾病存在關(guān)聯(lián)，農(nóng)藥引起的健康問題日益受到關(guān)注，但是，在臨床和法醫(yī)病理學的實際工作中，經(jīng)常碰到因意外、自殺或刑事犯罪引起的農(nóng)藥中毒等[1-3]。因此，不僅食品和環(huán)境中農(nóng)藥殘留量的測定很重要，而且疑似含有農(nóng)藥的血液等人體生物樣品中農(nóng)藥的快速定性定量分析也很重要[4-9]。測定血液中農(nóng)藥含量的方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫分析法和高分辨質(zhì)譜法等[10-11]。四極桿-飛行時間(Q-TOF)質(zhì)譜作為一種高分辨率質(zhì)譜，具有高質(zhì)量精度、高靈敏度、高掃描速率和寬線性范圍等特點，常應用于多目標物的定性定量分析和未知物的篩查中[12-17]。

本工作以常見的110種農(nóng)藥為目標化合物，包括58 種有機磷類農(nóng)藥、17 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥、18種除草劑、2種其他農(nóng)藥(昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑噻嗪酮和低毒性殺菌劑三唑酮)，結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF/MS)定性定量分析疑似血樣中的目標化合物，旨在建立血液樣品中多農(nóng)藥快速篩查和定量分析的方法，以期為法醫(yī)毒物檢驗提供技術(shù)參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity型超高效液相色譜儀;5600 Q-TOF型飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)，配DuoSpray TM 離子源;Milli-Q 型超純水系統(tǒng);DHC-16500 型臺式高速離心機;Vortex-Genie 2型可調(diào)速渦旋混合器;空白血來自首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院。

110種農(nóng)藥混合標準溶液:100 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

混合標準中間溶液和混合標準溶液系列均由混合標準溶液用甲醇逐級稀釋制得。

基質(zhì)匹配工作溶液由混合標準中間溶液用空白血的提取溶液稀釋制得。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸、甲酸銨均為高效液相色譜級;試驗用水為超純水。

以上所有試劑均需在－20 ℃的黑暗環(huán)境中密封儲存。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Kinetex Biphenyl 色譜柱(100 mm×3.0 mm，2.6μm)，柱溫40 ℃;流 量0.5 mL·min－1;進樣量為3 μL。流 動 相:A 為5 mmol·L－1甲酸銨溶液，B 為含5 mmol·L－1甲酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫程序:0～0.6 min時，初始流動相B 為4%;0.6～1.2 min時，流動相B 由4%升至42%;1.2～2.2 min時，流動相B由42%升至62%;2.2～7.2 min時，流動相B 由62%升至82%;7.2～10.2 min時，流動相B 由82% 升至85%;10.2～10.4 min時，流動相B 由85%升至95%B;10.4～13.2 min時，流動相B 由95%升至99%;13.2～15.6 min時，B為99%;15.6～15.8 min時，B 由99%降 至4%;15.8～19.2 min 時，B 為4%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子(ESI＋)模式;噴霧電壓5 500 V;離子源溫度550℃;霧化氣壓力379 225 Pa;輔助氣壓力344 750 Pa;氣簾氣壓力241 352 Pa;碰撞氣壓力48 265 Pa;去簇電壓60 V。采集模式:信息依賴采集(IDA)，先進行一級質(zhì)譜掃描，然后基于預定義的IDA 標準自動觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描，在碰撞能量(CE)為(35±15)eV 時，采用動態(tài)背景扣除(DBS)功能自動扣除背景離子，即可獲得目標化合物的一級和二級質(zhì)譜信息。其中，一級質(zhì)譜參數(shù):質(zhì)量數(shù)掃描范圍100～800，累積時間0.2 s;二級質(zhì)譜參數(shù):質(zhì)量數(shù)掃描范圍50～800，累積時間0.05 s。在試驗開始前，應對儀器進行正向校準，直至質(zhì)量誤差的絕對值在2‰以內(nèi)且分辨率大于30 000。進樣過程中每隔5 個樣品進行一次自動校正。

1.3 試驗方法

在2 mL 離心管中，加入200μL 血液樣品和1 000μL甲醇，混合均勻，渦旋振蕩2 min，以12 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min，上清液按照儀器工作條件測定。

1.4 定性和定量分析

采用Analyst、Peak View、Master View、Library View 和Multi Quant軟件進行儀器控制、數(shù)據(jù)采集和處理。根據(jù)化合物一級精確質(zhì)量誤差、差異同位素比、二級質(zhì)譜碎片離子和譜庫的相似程度，結(jié)合提取離子流色譜圖的保留時間對化合物進行定性分析;采用Multi Quant軟件對目標化合物進行定量分析[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

液相色譜條件對于目標化合物分離是否能獲得良好的色譜行為和電離起著關(guān)鍵作用[19-21]。試驗考察了以甲醇、乙腈作為有機相，在流動相中加入不同濃度的甲酸銨和甲酸時對目標物的色譜峰峰形和色譜分辨率的影響。結(jié)果表明:以5 mmol·L－1甲酸銨溶液(A 相)-含5 mmol·L－1甲酸銨的甲醇溶液(B相)作為流動相體系時，110種目標化合物均可獲得較好的峰形和色譜分辨率。試驗還對梯度洗脫程序進行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見1.2節(jié)中的色譜條件。在優(yōu)化的色譜條件下，110種目標化合物均可在20 min內(nèi)獲得較好的峰形和色譜分離效果。100μg·L－1混合標準溶液的提取離子流(XIC)色譜圖見圖1。

2.2 基于譜庫的定性篩查和確認

Master View 軟件可自動進行定性分析，包括靶向和非靶向篩查，其中，二級碎片譜的與譜庫中已知化合物的二級碎片的匹配度對于陽性結(jié)果的確認尤為重要，兩者越匹配，得分越高，假陽性率越低，定性結(jié)果越準確。定性篩查的規(guī)則為:質(zhì)量誤差的絕對值小于2‰，保留時間誤差小于0.5 min，差異同位素比小于10%，譜庫相似程度大于80%，以上4個因子所占比重分別為30%，30%，10%，30%。軟件自動計算各項得分及綜合得分，當綜合得分高于80分時，軟件中的交通燈顯示為綠色，表明化合物已成功得到定性篩查[22-23]。

圖1 110種農(nóng)藥的提取離子流色譜圖Fig.1 XIC chromatogram of the 110 pesticides

以100μg·L－1空白血提取溶液配制的混合標準溶液為試驗對象時，110種目標農(nóng)藥碎片的定性篩查數(shù)據(jù)見表1。

表1中1～58，59～75，76～90，91～108，109～110號對應的化合物分別屬于有機磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類、除草劑和其他農(nóng)藥;M 為目標化合物的分子式。

表1 110種農(nóng)藥碎片的的定性篩查數(shù)據(jù)Tab.1 Data of qualitative screening of the 110 pesticide fragments

表1 (續(xù))

表1 (續(xù))

表1 (續(xù))

以亞胺硫磷和胺菊酯為例，其一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖見圖2和圖3。

2.3 定量分析

2.3.1 工作曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件對1，2，5，10，20，50，100，200μg·L－1的基質(zhì)匹配工作溶液進行測定，以110種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標，其對應的色譜峰面積為縱坐標繪制工作曲線。110種農(nóng)藥的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2，其線性范圍為5～200μg·L－1，相關(guān)系數(shù)均不小于0.99。

圖2 亞胺硫磷的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.2 Spectra of MS and MS2 of phosmet

圖3 胺菊酯的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.3 Spectra of MS and MS2 of tetramethrin

以3倍信噪比(S/N)計算110種目標農(nóng)藥的檢出限(3S/N)，所得檢出限為2μg·L－1;以10倍信噪比(S/N)計算110種目標農(nóng)藥的測定下限(10S/N)，所得測定下限為5μg·L－1。

以上結(jié)果說明該方法的靈敏度可以滿足實際工作的測定要求[24]。

表2 110種農(nóng)藥的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear regression equations and correlation coefficients of the 110 pesticides

表2 (續(xù))

2.3.2 精密度和回收試驗

以空白血為基質(zhì)，按照儀器工作條件進行了50，100，200 g·L－1等3個濃度水平的加標回收試驗，每個濃度水平重復測定6次，計算110種目標化合物的回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，所得結(jié)果見表3。

表3 110種農(nóng)藥的精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery of the 110 pesticides(n＝6) %

表3 (續(xù)) %

表3 (續(xù)) %

由表3可知:110種農(nóng)藥的回收率為80.3%～120%，RSD 為1.9%～20%，說明該方法有良好的重復性，可用于多組分農(nóng)藥分析。

2.3.3 基質(zhì)效應

按照試驗方法分析混合標準溶液和空白基質(zhì)配制的相同濃度的混合標準溶液，以兩者中各農(nóng)藥的峰面積的比值評估基質(zhì)效應(ME)，當比值不小于100%時，目標農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，小于100%時，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應，110種農(nóng)藥基質(zhì)效應結(jié)果見表4。

表4 110種農(nóng)藥的基質(zhì)效應Tab.4 Matrix effects of the 110 pesticides %

表4 (續(xù)) %

由表4 可知:110 種目標農(nóng)藥的基質(zhì)效應為80.65%～119.86%，其中59%的目標農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，41%表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應，為保證方法的準確性和可靠性，定量分析時應考慮方法的基質(zhì)效應[25-26]。

2.4 樣品分析

2019年9月，甘肅省某地發(fā)生了一起疑似妻子在丈夫的食物中投放農(nóng)藥致丈夫死亡的案件，本單位按照試驗方法分析了死者血液樣品，檢出了敵敵畏、毒死蜱、氯氰菊酯等3種農(nóng)藥，質(zhì)量誤差分別為－1.8‰，－0.1‰，－0.1‰，保留時間誤差分別為0.10，0.32，0.39 min，差異同位素比分別為7.6%，8.9%，8.5%，譜庫相似程度分別為99.7%，98.5%，89.5%，綜合得分分別為89.8，91.3，89.4分，質(zhì)量濃度分別為183.98，156.79，104.67μg·L－1，結(jié)果與服下農(nóng)藥的結(jié)果一致。

2019年6月，甘肅省某地某女子因不堪忍受丈夫家庭暴力而服農(nóng)藥自殺，本單位根據(jù)試驗方法分析了死者血液樣品，檢出阿特拉津、氯氟氰菊酯和克百威等3種農(nóng)藥，質(zhì)量誤差分別為0.6‰，－0.3‰，0.4‰，保留時間誤差分別為0.21，0.17，0.08 min，差異同位素比分別為4.3%，7.5%，6.2%，譜庫相似程度分別為97.6%，95.3%，92.8%，綜合得分分別為93.7，94.5，92.1分，質(zhì)量濃度分別為144.57，165.32，138.91μg·L－1，檢出結(jié)果和服下農(nóng)藥的結(jié)果一致。

本工作建立了UPLC-Q-TOF/MS用于同時篩查、確認和定量分析血液中的110種農(nóng)藥的方法，該方法快速、靈敏，為臨床和法醫(yī)毒理學中多未知目標物的篩查提供了高效可靠的技術(shù)手段。