梁楚欣，劉 崢?，陳則勝，馮煒怡，李?，摚瑥埵绶?，2

(1.桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院 電磁化學(xué)功能物質(zhì)廣西區(qū)重點實驗室，桂林 541004;2.大連理工大學(xué) 精細化工重點實驗室，大連 116024)

苯甲酸及其鈉鹽是一種常用的防腐劑，廣泛用作食品、飲料、牙膏、漱口水、化妝品等的添加劑[1]。苯甲酸作為食品添加劑時，其添加量應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)。美國食品和藥物管理局規(guī)定食品中苯甲酸的添加量為0.05%～0.1%[2];國家標準GB 2760－2014對苯甲酸的使用量有更嚴格的規(guī)定，如膠基糖果、調(diào)味糖漿、復(fù)合調(diào)味料、碳酸飲料中的苯甲酸最大使用量分別為1.5，1.0，0.6，0.2 g·kg－1。然而，一些不法貿(mào)易商為了延長食品的保質(zhì)期，在食品中違規(guī)添加了過量的苯甲酸，人在食用后，可能存在食物中毒等危害人身體健康的風(fēng)險[3]。因此，建立一種簡便、快捷和高靈敏的測定食品中苯甲酸含量的方法對相關(guān)執(zhí)法部門監(jiān)管食品中苯甲酸的添加量具有十分重要的意義。

目前，苯甲酸的測定方法主要有差示掃描量熱法(DSC)[4]、膠束電動色譜法(MEKC)[5]、氣相色譜法(GC)[6-7]、高效液相色譜法(HPLC)[8-9]等，但這些方法存在成本高、操作復(fù)雜和分析速率慢等缺點。薄層色譜法(TLC)[10]、紫外分光光度法[11]和熒光光譜法[12]也可用來測定苯甲酸的含量，具有操作簡單、分析速率快和結(jié)果準確等特點，但其靈敏度還需要提高。電分析法具有成本低、靈敏度高、檢測速度快等特點，已廣泛用于食品分析領(lǐng)域，但開發(fā)一種成本更低廉、操作更方便、靈敏度更高、測定時間更短的測定食品中食品添加劑含量的方法，仍是科研工作者不斷努力的方向。

雙席夫堿結(jié)構(gòu)靈活多變，能與過渡金屬離子配位形成穩(wěn)定的雙席夫堿金屬配合物，將其作為電子轉(zhuǎn)移媒介物修飾到電極表面，可提高電極的選擇性與靈敏度[13]。將雙席夫堿金屬配合物應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域，建立測定苯甲酸含量的方法，可拓寬雙席夫堿及其金屬配合物的應(yīng)用領(lǐng)域范圍。本工作采用溶液法制備了雙席夫堿銅配合物(M)，并采用電沉積法將其固定在玻碳電極(GCE)表面，形成了雙席夫堿銅配合物修飾GCE(M/GCE)，據(jù)此建立了M/GCE測定碳酸飲料中的苯甲酸含量的電化學(xué)方法，以期為食品中苯甲酸含量的測定提供技術(shù)參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI 760E型電化學(xué)工作站;AL 204型電子分析天平;WS 701型紅外快速干燥燈;BPZ-6000型真空干燥箱;DHG-9023A 型鼓風(fēng)干燥箱;KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器;Perkin-Elmer 240Q 型元素分析儀;SU 5000 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM);Shimadzu FTIR-8400 型紅外光譜儀(FTIR);GCE(直徑為2 mm)，鉑絲電極(直徑為2 mm)。

KCl溶液:0.1 mol·L－1，稱取KCl 固體1.862 5 g，用水溶解并定容至250.0 mL。

苯甲酸標準溶液:2.000 0 mmol·L－1，稱取苯甲酸0.024 4 g，用0.1 mol·L－1KCl溶液溶解并定容至100.0 mL。

所用試劑均為分析純;試驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器工作條件

三電極體系:以M/GCE 或GCE 為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極;電化學(xué)方法為循環(huán)伏安法(CV);掃描范圍為－1.0～1.0 V，掃描速率為50 mV·s－1;以0.1 mol·L－1KCl溶液為支持電解質(zhì)。

1.3 試驗方法

1.3.1 M 的制備

鄰羧基苯甲醛縮乙二胺席夫堿:根據(jù)文獻[14]，以鄰羧酸苯甲醛和乙二胺為原料制備，得到白色粉末，熔點為131.0～134.0 ℃。

稱取0.324 5 g(1 mmol)鄰羧基苯甲醛縮乙二胺席夫堿和20 mL 甲醇于100 mL 的三口燒瓶中，于室溫下磁力攪拌成白色渾濁溶液，然后向溶液中緩慢滴加含有0.199 5 g(1 mmol)一水合乙酸銅的甲醇溶液25 mL，溶液由渾濁狀態(tài)逐漸變成藍色澄清狀態(tài)。在100 ℃下攪拌回流3 h后，停止攪拌，靜置，冷卻至室溫，有藍色片狀晶體析出。用中速濾膜減壓抽濾，并用甲醇洗去沉淀中的雜質(zhì)，置于30 ℃真空干燥箱中干燥24 h，得到 M 的質(zhì)量為0.201 9 g，產(chǎn)率為42.47%。

1.3.2 M/GCE的制備

在麂皮上依次用0.1μm 和0.03μm 的氧化鋁粉末將GCE拋光20 min，打磨至鏡面，然后在水中超聲30 min，除去電極表面的雜質(zhì)，用水沖洗后，置于50℃的烘箱中干燥5 min。將3 mmol M 在瑪瑙研缽中碾碎，用400 mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成0.007 5 mol·L－1M-DMF 溶液。將預(yù)處理好的GCE浸泡在M-DMF溶液中，采用三電極體系(參比電極為Ag/AgCl電極)，以四丁基高氯酸銨(TBAP)為支持電解質(zhì)，控制電位為－1.5～1.5 V，電沉積速率為50 mV·s－1，電沉積圈數(shù)為20，將M 通過CV 沉積到GCE 表面，得到M/GCE，用適量水沖去M/GCE 表面吸附的雜質(zhì)，在紅外快速干燥燈下干燥。

1.3.3 樣品的分析方法

超聲除去雪碧中CO2后，量取10.0 mL雪碧樣品，用0.1 mol·L－1KCl溶液定容至100.0 mL，分取15.0 mL于25 mL燒杯中，按照儀器工作條件測定其中苯甲酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 M 的 表征

通過元素分析的結(jié)果可知，M 的分子式為C41H52Cu2N4O15，M 中碳、氮、氫元素的質(zhì)量分數(shù)的實測值(理論值)為:C 50.73%(50.87%);N 5.64%(5.79%);H 5.51%(5.42%)。

采用KBr壓片，對合成的M 進行了FT-IR 表征，見圖1。

圖1 M 的紅外光譜圖Fig.1 IR spectrum of M

由圖1可知:在3 479 cm－1處出現(xiàn)了較寬的吸收峰，此峰的出現(xiàn)主要歸因于配合物中含有配位水和結(jié)晶水中的O－H 伸縮振動;1 615 cm－1是NH 的彎曲振動吸收峰，表明N－H 中氮原子與金屬銅離子發(fā)生了配位;1 204 cm－1是羧基C－O 的伸縮振動吸收峰;1 106 cm－1是伯烷基醚sp3雜化的C－O 鍵的伸縮振動吸收峰。

2.2 電沉積過程的電化學(xué)行為

M 在GCE上的電沉積過程的CV 曲線見圖2。

圖2 M/GCE修飾電極的CV 曲線Fig.2 CV curves of M/GCE

由圖2 可知:0.079 V 處出現(xiàn)了氧化峰，－0.014 V 處出現(xiàn)了還原峰，兩峰電位差約0.059 V，可歸屬為Cu(Ⅱ)/Cu(Ⅰ)電對的電極反應(yīng)[15]，且該反應(yīng)的可逆性較高[16]。隨著掃描圈數(shù)的增大，氧化峰和還原峰越來越明顯，推測可能是M 通過其中的芳香環(huán)與銅離子之間的d-π作用，已逐漸沉積到了GCE上。

2.3 M/GCE的表面形貌

為了考察M/GCE表面的修飾效果，采用SEM對GCE和M/GCE 的表面形貌進行了表征。在加速電壓為5.0 k V，放大倍數(shù)為800倍時，GCE和M/GCE表面的SEM 形貌見圖3。

圖3 GCE和M/GCE表面的SEM 圖Fig.3 SEM images of the surface of GCE and M/GCE

由圖3可知:GCE顯示為較為光滑的表面，M/GCE顯示為凹凸不平的表面，說明GCE 表面已形成一層聚合膜[17]。

2.4 苯甲酸在電極上的電化學(xué)行為

以2.000 0 mmol·L－1苯甲酸標準溶液為待測對象，按照儀器工作條件考察了GCE和M/GCE對苯甲酸的電化學(xué)響應(yīng)效果，結(jié)果見圖4。

圖4 GCE和M/GCE上苯甲酸的電化學(xué)行為Fig.4 Electrochemical behavior of benzoic acid on the GCE and M/GCE

由圖4可知:當(dāng)以GCE 為工作電極時，在CV曲線上幾乎觀察不到電化學(xué)響應(yīng)信號;當(dāng)以M/GCE作為工作電極時，在CV 曲線上觀察到分別位于0.148，－0.007 V 處的氧化峰1 和氧化峰2，0.096，－0.359 V 處的還原峰1′和還原峰2′。氧化峰1和還原峰1′可能與Cu(Ⅱ)/Cu(Ⅰ)電對的電極反應(yīng)有關(guān)，而氧化峰2和還原峰2′來源于苯甲酸的電極反應(yīng)[18]:

以上結(jié)果表明:M/GCE 對苯甲酸的電化學(xué)響應(yīng)和其表面修飾的M 有關(guān)。

2.5 掃描速率對M/GCE 上苯甲酸電化學(xué)行為的影響

試驗考察了掃描速率為25～200 mV·s－1時對苯甲酸電化學(xué)行為的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知:氧化峰2和還原峰2′電流隨掃描速率的增加而增大，氧化峰2電流從18.6μA 增加至40.2 μA，還原峰2′電流從8.23 μA 增加至19.7μA。氧化峰2的電位略向正向移動，還原峰2′的電位略向負向移動，電極反應(yīng)可逆性變差。

以掃描速率的平方根(ν1/2)為橫坐標，相應(yīng)的苯甲酸的氧化峰電流(Ipa2)和還原峰電流(Ipc2′)為縱坐標繪圖，見圖6。

圖5 掃描速率對苯甲酸電化學(xué)行為的影響Fig.5 Effect of scan rate on electrochemical behavior of benzoic acid

圖6 氧化還原峰電流與掃描速率的平方根的關(guān)系圖Fig.6 Relationship between redox peak current and square root of scan rate

由圖6可以看出:Ipa2～ν1/2的線性方程為Ipa2＝－2.535×ν1/2－4.446，相關(guān)系數(shù)為0.987 1;而Ipc2′～ν1/2的線性回歸方程為Ipa2′＝1.296×ν1/2＋1.295，相關(guān)系數(shù)為0.992 3。以上結(jié)果表明，在25～200 mV·s－1內(nèi)，苯甲酸在M/GCE 表面的反應(yīng)受擴散控制[19]。

2.6 支持電解質(zhì)對苯甲酸電化學(xué)行為的影響

試驗考察了分別以H2SO4溶液(pH 2.0)、NaOH 溶液(pH 12.0)、KCl溶液、KBr溶液、磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)為支持電解質(zhì)時對苯甲酸電化學(xué)行為的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知:以KCl溶液為支持電解質(zhì)時，有2對氧化還原峰出現(xiàn)，由上面分析可知，可歸屬于Cu(Ⅱ)/Cu(Ⅰ)和苯甲酸的可逆電極反應(yīng)，電化學(xué)響應(yīng)較好。以KBr 溶液為支持電解質(zhì)時，只在－0.008，0.140 V 處出現(xiàn)了2個氧化峰，而沒有對應(yīng)還原峰，說明在KBr溶液中，M/GCE上發(fā)生的2個電極反應(yīng)不可逆;以磷酸鹽緩沖溶液為支持電解質(zhì)時，在－0.346，－0.352 V 處出現(xiàn)了一對明顯的氧化還原峰，可歸屬于苯甲酸的可逆電極反應(yīng)，而在－0.011 V 處出現(xiàn)一個氧化峰，沒有對應(yīng)的還原峰，可歸屬于Cu(Ⅱ)/Cu(Ⅰ)的不可逆電極反應(yīng);以H2SO4溶液(pH 2.0)為支持電解質(zhì)時，只在0.125 V 處出現(xiàn)一個氧化峰，可歸屬于Cu(Ⅱ)/Cu(Ⅰ)的不可逆電極反應(yīng);以NaOH 溶液(pH 12.0)為支持電解質(zhì)，基本無電化學(xué)響應(yīng)信號。因此，試驗選擇KCl溶液作為支持電解質(zhì)來考察苯甲酸在修飾電極上的電化學(xué)行為。

圖7 支持電解質(zhì)對苯甲酸電化學(xué)行為的影響Fig.7 Effect of the support electrolyte on the electrochemical behavior of benzoic acid

2.7 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件對0.001 0，0.010 0，0.100 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0，2.000 0 mmol·L－1的 苯甲酸標準溶液系列進行測定，以苯甲酸濃度為橫坐標，氧化峰2電流為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明:苯甲酸的濃度在0.001 0～2.000 0 mmol·L－1內(nèi)，M/GCE 對苯甲酸的響應(yīng)電流與苯甲酸濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝－0.032 2x－0.009 8，相關(guān)系數(shù)為0.995 7。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)，所得結(jié)果為0.27μmol·L－1。

2.8 M/GCE的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

將M/GCE在4℃保存7 d，再按照儀器工作條件在支持電解質(zhì)中進行掃描，其響應(yīng)電流只比初始值下降了4.8%，表明制備的M/GCE具有良好的穩(wěn)定性。

按照試驗方法制備5個M/GCE 修飾電極，每個電極在2.000 0 mmol·L－1苯甲酸標準溶液中平行測定5次，計算氧化峰響應(yīng)電流的相對標準偏差(RSD)為3.2%，說明M/GCE具有良好的重現(xiàn)性。

2.9 干擾試驗

在苯甲酸標準溶液濃度為2.000 0 mmol·L－1時，試驗考察了L-半胱氨酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、白砂糖等干擾物質(zhì)對苯甲酸電化學(xué)行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)存在15倍的L-半胱氨酸，50倍的檸檬酸、檸檬酸鈉，100倍的白砂糖時，苯甲酸測定值的相對誤差分別為4.6%，4.5%，3.3%，2.9%，說明以上幾種干擾物質(zhì)均不影響苯甲酸的測定。

2.10 精密度和回收試驗

按試驗方法對雪碧樣品中苯甲酸的含量進行5次平行測定，并以其為基質(zhì)進行了加標回收試驗，計算回收率和測定值的RSD，結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

本工作建立了一種用M/GCE測定碳酸飲料中苯甲酸含量的電化學(xué)方法，該方法具有靈敏度高、準確性好、穩(wěn)定性高和重現(xiàn)性較好等優(yōu)點，可用于碳酸飲料中苯甲酸含量的測定。