張勝蘭，鄒 曉，商勝華，于曉飛，楊茂發(fā),*

(1. 貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)真菌資源研究所，貴陽(yáng) 550025；3. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081；4. 貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

昆蟲病原真菌是最早用于害蟲生物防治的病原微生物，在害蟲持續(xù)控制、環(huán)境保護(hù)以及藥品開發(fā)等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

蟬棒束孢菌Cordycepscicadae(Kepleretal.，2017)又被稱為蟬擬青霉(衛(wèi)亞麗等，2014)，是一種重要的具有生防潛力的藥用資源菌(李忠等，2013)，可寄生膜翅目和鱗翅目中的許多昆蟲(鄧淑群，1963；陳祝安，1991)。該菌易培養(yǎng)，產(chǎn)孢量大，侵染力強(qiáng)，在害蟲防治上有很大的優(yōu)勢(shì)(李忠等，2013)。

Yaginuma等(2002)研究蟬擬青霉對(duì)桃蛀果蛾Carposinasasakii的毒力影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)此菌對(duì)桃蛀果蛾有很強(qiáng)的致病性，有望成為桃蛀果蛾微生物防治的制劑。劉又高等(2007)采用蟬擬青霉孢子粉處理小菜蛾P(guān)lutellaxylostella幼蟲發(fā)現(xiàn)，蟬擬青霉可以在小菜蛾的幼蟲和蛹上寄生，并導(dǎo)致其死亡。歐翔(2008)以蟬擬青霉的孢子懸液處理蠶豆蚜蟲Aphiscraccivora和小菜蛾的致死率都較高，可達(dá)88.7%。陳官菊等(2008)研究發(fā)現(xiàn)蟬擬青霉APC20對(duì)小菜蛾具有致病力。譚艾娟等(2009)研究發(fā)現(xiàn)，4株蟬擬青霉的分生孢子和菌絲對(duì)小菜蛾的致病性有一定差異。

此外，有報(bào)道表明這類真菌在黃酮類糖苷、類固醇等的生物轉(zhuǎn)化中具有潛在用途(Dymarskaetal.，2017；Ewaetal.，2018；Monikaetal.，2018)，應(yīng)用前景廣闊(Qunetal.，2019)。

斜紋夜蛾Spodopteralitura屬鱗翅目夜蛾科，其具有食性雜、世代重疊、抗性強(qiáng)等的特點(diǎn)，防治難度大(羅凱等，2015；唐二平和張傳根，2017)。在各類綠色防控技術(shù)中，諸如性誘劑及使用藥劑防治害蟲均有研究報(bào)道(羅凱等，2015；唐二平和張傳根，2017)，天敵(Luoetal.，2007)、斜紋夜蛾核型多角體病毒Spodopteralituranuclepolyhedrovirus(Thomasetal.，2006)、萊氏野村菌Nomuraearileyi和斯氏線蟲Steinernemafeltiae等(宗瑞英，2016)均有成功應(yīng)用報(bào)道。

據(jù)報(bào)道，棒束孢對(duì)菜青蟲Pierisrapae(代永東等，2013)、茶卷夜蛾Homonacoffearia和茶小卷夜蛾Adoxophyeshonmai(王定鋒等，2014)、小菜蛾(何勁等，2010)、埃及伊蚊Aedesaegypti(Ramirezetal.，2018)、蚜蟲Aphid(Liangetal.，2006)、二斑葉螨Tetranychusurticae(Zhangetal.，2016)等都有一定的致病性。鑒于斜紋夜蛾危害的嚴(yán)重性，蟬棒束孢屬菌株對(duì)鱗翅目等害蟲有致病性報(bào)道，本文選用一株對(duì)斜紋夜蛾相對(duì)毒力較好的蟬棒束孢菌株SLGY-2探究其固體培養(yǎng)條件，為今后深入研究昆蟲病原真菌棒束孢的孢子擴(kuò)繁和生物防治應(yīng)用做些基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：蟬棒束孢SLGY-2。由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所(GZAC)提供，用PDA斜面培養(yǎng)基于冰箱(4℃)保存。

材料：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉等。

儀器：人工氣候箱，恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，立式滅菌鍋等。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基配置和產(chǎn)孢量測(cè)定

參照沈萍和陳向東(2007)方法配置以下培養(yǎng)基，PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL；改良PDA培養(yǎng)基1：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉各2.5 g，共15 g)；改良PDA培養(yǎng)基2：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉各5 g，共30 g)；改良PDA培養(yǎng)基3：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉各7.5 g，共45 g)；改良PDA培養(yǎng)基4：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉各10 g，共60 g)；pH值均為自然，1×105Pa滅菌30 min。

在超凈工作臺(tái)用無(wú)菌接種環(huán)挑取培養(yǎng)7 d的菌種，在培養(yǎng)基上分別接3個(gè)點(diǎn)，約5 mm大??；同樣方法分別接入5種改良直徑90 mm培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)；接菌后在培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)觀察(25℃)，48 h后第1次觀察記錄，之后每24 h觀察1次。第7天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，然后用0.05%吐溫-80無(wú)菌水洗脫培養(yǎng)基中的菌絲和孢子粉，刮取孢子液裝入離心管充分震蕩搖勻30 min，離心管中裝入研磨珠以充分打散孢子粉。待分生孢子完全被打散均勻后，用無(wú)菌脫脂紗布過(guò)濾，棄去雜物和培養(yǎng)基殘留物，配成5 mL孢子懸浮液，同樣3次重復(fù)。最后用血球計(jì)數(shù)板(25×16型)進(jìn)行孢子數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算產(chǎn)孢量。

孢子濃度計(jì)算方法：計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板4個(gè)角和中央共5個(gè)中方格(80個(gè)小方格)的孢子數(shù)，重復(fù)3次求得平均值，血球計(jì)數(shù)板(25×16型)公式：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)/mL=80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/ 80×400×10 000×稀釋倍數(shù)。

1.2.2不同pH值條件下產(chǎn)孢量測(cè)定

同1.2.1在超凈工作臺(tái)將菌株接種在PDA培養(yǎng)基，置于pH值分別為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5條件的生化培養(yǎng)箱(T=25±1℃，RH=75%±5%，L ∶D=18 ∶6)培養(yǎng)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，同上觀察記錄計(jì)數(shù)。

1.2.3不同溫度條件下產(chǎn)孢量測(cè)定

同1.2.1在超凈工作臺(tái)將菌株接種在PDA培養(yǎng)基，置于溫度分別為10、15、20、25、30℃的生化培養(yǎng)箱(RH 75%±5%，L ∶D=18 ∶6)培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，同上觀察記錄計(jì)數(shù)。

1.2.4不同光照時(shí)間產(chǎn)孢量測(cè)定

同1.2.1在超凈工作臺(tái)將菌株接種在PDA培養(yǎng)基，置于光照時(shí)間分別為0 h、6 h、12 h、18 h、24 h生化培養(yǎng)箱(25±1℃，RH 75%±5%)培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，同上觀察記錄計(jì)數(shù)。

1.2.5響應(yīng)面分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量、溫度、pH值、光照時(shí)間4個(gè)因素作為響應(yīng)變量，按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立四因素三水平數(shù)學(xué)模型，以產(chǎn)孢量為響應(yīng)值，因素與水平編碼(表1)。以Design-Expert 8.0的響應(yīng)曲面法分析得出一個(gè)優(yōu)化條件，重復(fù)以上培養(yǎng)基的制備和試驗(yàn)方法，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。

表1 因素與水平編碼Table 1 Coding of factors and levels

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面組合及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素產(chǎn)孢量試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量的產(chǎn)孢量

蟬棒束孢SLGY-2(PDA和改良培養(yǎng)基1)的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量在0～15 g時(shí)，產(chǎn)孢量呈增加趨勢(shì)，當(dāng)添加營(yíng)養(yǎng)成分含量為30 g時(shí)，即改良培養(yǎng)基2中的產(chǎn)孢量最多，達(dá)到了5.38×108個(gè)/mL，顯著多于其他配方組，之后在營(yíng)養(yǎng)成分含量為45～60 g時(shí)，產(chǎn)孢量逐漸減少(圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量的產(chǎn)孢量Fig.1 Spore yield of strain SLGY-2 of media of different nutrient components

2.1.2不同pH值產(chǎn)孢量的測(cè)定

在pH值為6.5時(shí)，蟬棒束孢SLGY-2的產(chǎn)孢量達(dá)到最大，為8.72×107個(gè)/mL，顯著高于其他pH值試驗(yàn)組。在pH值7.5～9.5范圍內(nèi)產(chǎn)孢量呈現(xiàn)梯度遞減，最低僅2.59×107個(gè)/mL，各pH值處理間差異顯著。pH過(guò)酸或過(guò)堿都不利于產(chǎn)孢，顯著低于其他試驗(yàn)組；在中性值為7.5時(shí)的產(chǎn)孢量也未能達(dá)到最高。因此，選擇pH值為6.5較為適宜(圖2)。

圖2 不同pH值的產(chǎn)孢量Fig.2 Spore yield of strain SLGY-2 at different pH values

2.1.3不同溫度產(chǎn)孢量的測(cè)定

菌株SLGY-2產(chǎn)孢量在25℃條件下最高，達(dá)到3.86×107個(gè)/mL，顯著高于其他溫度條件下的產(chǎn)孢量。在10℃條件下的產(chǎn)孢量最低，但與15℃、20℃、30℃下的產(chǎn)孢量無(wú)顯著差異(圖3)。

圖3 不同溫度的產(chǎn)孢量Fig.3 Spore yield of strain SLGY-2 in different constant temperatures

2.1.4不同光照時(shí)間產(chǎn)孢量的測(cè)定

在全黑暗環(huán)境下不利于蟬棒束孢SLGY-2產(chǎn)孢。光照時(shí)長(zhǎng)在每天6～18 h時(shí)，產(chǎn)孢量隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；光照18 h時(shí)，產(chǎn)孢量達(dá)到最大值3.87×108個(gè)/mL，顯著高于其他光照時(shí)長(zhǎng)處理。至光照24 h產(chǎn)孢量又稍有下降(圖4)。

圖4 不同光照時(shí)間的產(chǎn)孢量Fig.4 Spore yield of strain SLGY-2 in different light: dark cycle

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及曲面分析結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果(表2)。利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2中的蟬棒束孢SLGY-2產(chǎn)孢量以及4個(gè)因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到各單因子的顯著性，結(jié)果如表3所示；并得到了產(chǎn)孢量(Y)對(duì)自變量培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量(A)、pH值(B)、溫度(C)以及光照時(shí)間(D)的多元二次回歸方程為：Y=6.72×108-1.05×107A+2.18×107B+1.63×107C-2.66×106D+1.50×107AB+1.86×107AC+1.07×107AD-7.20×106BC+9.39×107BD-9.84×107CD-3.18×108A2-3.05×108B2-3.12×108C2-2.64×108D2。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The results of Box-Behnken response surface design

響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析(表3)結(jié)果可以看出，方程模型的P<0.0001<0.01，表明該方程模型極顯著，方程能很好地?cái)M合試驗(yàn)結(jié)果。失擬項(xiàng)P=0.9752>0.05，差異不顯著，說(shuō)明該回歸模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值有較好的擬合水平，該模型適用于對(duì)蟬棒束孢SLGY-2產(chǎn)孢條件優(yōu)化分析和預(yù)測(cè)。由方差分析可知，二次項(xiàng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量(A2)、pH值(B2)、溫度(C2)、光照時(shí)間(D2)的P值均小于0.0001，達(dá)到極顯著水平。兩兩因素交互，pH值與光照時(shí)長(zhǎng)(BD)和溫度和光照時(shí)長(zhǎng)(CD)的交互作用顯著，P值都小于0.05，差異顯著。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken response surface design

2.2.2響應(yīng)面曲面分析

從響應(yīng)面曲線及等高線圖進(jìn)行分析，可以直觀看出優(yōu)化區(qū)域；兩兩因素交互作用的強(qiáng)弱主要由響應(yīng)面圖的形狀呈現(xiàn)出來(lái)，響應(yīng)面圖形狀陡峭，表示兩因素交互作用顯著。

從響應(yīng)面分析圖可以直觀看出，4個(gè)因素兩兩之間的交互作用對(duì)蟬棒束孢SLGY-2產(chǎn)孢量有影響，開始隨著兩因素的增加而增加，當(dāng)產(chǎn)孢量達(dá)到極值后，逐漸減小。圖中的優(yōu)化區(qū)域可以直觀看出，從而得到較高的產(chǎn)孢量。(光照時(shí)間-pH值)模型和(光照時(shí)間-溫度)模型的交互作用顯著(P<0.05)，隨著光照時(shí)長(zhǎng)的增加和pH值增大，蟬棒束孢SLGY-2的產(chǎn)孢量也隨之增加，增加到一定程度時(shí)，產(chǎn)孢量有下降的趨勢(shì)；pH值和光照時(shí)長(zhǎng)交互作用響應(yīng)曲面圖(圖5A)的坡度陡，等高線圖(圖5B)呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明對(duì)該菌的產(chǎn)孢量亦呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)。隨著光照時(shí)長(zhǎng)和溫度的增加，產(chǎn)孢量也隨之增加，到一定值也下降；光照時(shí)長(zhǎng)和溫度交互作用響應(yīng)曲面圖(圖6A)的坡度陡，等高線圖(圖6B)呈現(xiàn)橢圓形，對(duì)該菌的產(chǎn)孢量影響顯著。

圖5 光照時(shí)間和pH值對(duì)產(chǎn)孢量影響的響應(yīng)面圖(A)和等高線圖(B)Fig.5 Response surface map(A)and contour map(B)of the influence of light and pH value on sporulation quantity

圖6 光照時(shí)間和溫度對(duì)產(chǎn)孢量影響的響應(yīng)面圖(A)和等高線圖(B)Fig.6 Response surface map(A)and contour map(B)of the influence of light and temperature on sporulation quantity

2.2.3產(chǎn)孢條件確定及驗(yàn)證

結(jié)合Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理及響應(yīng)值預(yù)測(cè)，對(duì)響應(yīng)曲面圖和等高線分析，為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性及產(chǎn)孢條件的優(yōu)化，模型中產(chǎn)孢量?jī)?yōu)化條件為：培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量38.3 g、pH 6.55、25.21℃、光照18.04 h，在該培養(yǎng)條件下，產(chǎn)孢量達(dá)到5.70×108個(gè)/mL。本研究實(shí)際試驗(yàn)測(cè)定設(shè)定培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量38 g、pH 6.5、25℃、光照18 h驗(yàn)證，重復(fù)3次，產(chǎn)孢量的值為5.70(±0.49)×108個(gè)/mL。實(shí)際測(cè)定結(jié)果與模型優(yōu)化條件結(jié)果基本相符，可以證明響應(yīng)面法優(yōu)化蟬棒束孢SLGY-2產(chǎn)孢條件具有可行性。

3 結(jié)論與討論

微生物的生長(zhǎng)需要碳源、氮源以及適宜其生長(zhǎng)的環(huán)境條件(張文芝和郭堅(jiān)華，2013)。從本研究結(jié)果來(lái)看，不同培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件對(duì)真菌產(chǎn)孢量有較大影響。本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析法對(duì)目標(biāo)菌株蟬棒束孢SLGY-2的培養(yǎng)條件優(yōu)化。

陳祝安等(1990)采用煮熟的小麥、大麥以及玉米、豆餅、麩皮和谷殼等進(jìn)行室溫固體發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的碳源、氮源影響蟬擬青霉的產(chǎn)孢量和孢梗束的生長(zhǎng)。狄雪塬(2015)等選用不同培養(yǎng)基配方，YS03球孢白僵菌產(chǎn)孢量最大。本研究在單因素條件中不同培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量在30 g時(shí)，可獲得最高的產(chǎn)孢量(5.38×108個(gè)/mL)。單因素條件選用不同碳源和氮源按1 ∶1的比例，按不同添加量對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行改良。但未對(duì)不同碳源和氮源按不同比例對(duì)產(chǎn)孢量的影響進(jìn)行研究，有待繼續(xù)探索不同比例和不同用量對(duì)產(chǎn)孢量的影響。

李忠(2013)對(duì)蟬棒束孢LB菌株液體培養(yǎng)特性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液的pH值影響蟬棒束孢菌絲生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)適宜產(chǎn)孢的最佳pH值為6.5，pH值在4.5時(shí)，培養(yǎng)基不凝固，不能進(jìn)行接菌培養(yǎng)；當(dāng)pH值在9.5時(shí)培養(yǎng)基凝固，但蟬棒束孢SLGY-2生長(zhǎng)緩慢且產(chǎn)孢極少；偏酸或偏堿性都不利于產(chǎn)孢。適宜溫度為25℃，與許明敏(2012)以Richard液為培養(yǎng)基25℃適宜產(chǎn)孢相近；當(dāng)溫度低于15℃或高于30℃時(shí)菌株生長(zhǎng)慢且未能見明顯孢子粉，不利于產(chǎn)孢。全黑暗時(shí)產(chǎn)孢也未見明顯孢子粉，最適光照時(shí)間為18 h，光照時(shí)長(zhǎng)影響蟬棒束孢產(chǎn)孢量。結(jié)合響應(yīng)曲面分析法對(duì)蟬棒束孢SLGY-2的培養(yǎng)條件進(jìn)行探究，產(chǎn)孢量較單因素的條件有所提高。

本文從固體培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)其產(chǎn)孢量的影響進(jìn)行探究，運(yùn)用響應(yīng)曲面分析法探究培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量、pH值、溫度以及光照時(shí)間4個(gè)因素對(duì)蟬棒束孢SLGY-2產(chǎn)孢量的影響。經(jīng)過(guò)響應(yīng)曲面分析產(chǎn)孢量最優(yōu)組合：培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量38.3 g、pH 6.55、25.21℃、光照18.04 h。適宜于為進(jìn)一步探究蟬棒束孢固體培養(yǎng)條件的優(yōu)化。