丁兆潤(rùn)，韓日疇，張 祎*

(1, 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510640；2, 廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260)

蜜蜂屬于膜翅目Hymenoptera蜂科Apidae，分布于世界各地，不僅生產(chǎn)蜂蜜、蜂膠、蜂王漿以及其它蜂產(chǎn)品，更是重要的授粉昆蟲(chóng)，對(duì)全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到舉足輕重的作用。然而，越冬蜂群的消失(Overwintering Colony Loss，OCL)和蜂群崩潰綜合癥(Colony Collapse Disorder, CCD)現(xiàn)象的出現(xiàn)(Dennisetal., 2007)，引起了人們對(duì)蜜蜂的健康和生存的重視。蜂群的消失與棲息地、農(nóng)藥、害蟲(chóng)和病毒等多方面因素有關(guān)，蜜蜂的減少不僅會(huì)影響作物授粉,對(duì)糧食安全產(chǎn)生威脅，還會(huì)對(duì)植物多樣性及生態(tài)平衡帶來(lái)不利影響(Pottsetal., 2010)。

蜜蜂殘翅病病毒(Deformed Wing Virus, DWV)是西方蜜蜂Apismellifera中最常見(jiàn)的病毒。其危害蜜蜂的典型特征是成年蜜蜂翅膀畸形、腹部縮短腫脹、行動(dòng)乏力和幼蜂迅速死亡(de Miranda and Genersch, 2010)。在沒(méi)有狄斯瓦螨Varroadestructor的情況下，蜂群中DWV病毒水平低，呈無(wú)癥狀感染。在狄斯瓦螨寄生的蜂群中，DWV滴度明顯上升，呈顯性癥狀感染，群勢(shì)削弱，甚至死亡消失(Kovac and Crailsheim, 1988;de Miranda and Genersch, 2010)。DWV和狄斯瓦螨的相互作用導(dǎo)致西方蜜蜂大量消失的現(xiàn)象，受到世界蜜蜂學(xué)家的廣泛關(guān)注。DWV是單鏈RNA病毒，基因組約10 kb, 感染力強(qiáng)，易變異，在狄斯瓦螨的媒介作用下，不斷擴(kuò)大著寄主范圍，并且演化出新的變異體，DWV-A、DWV-B和DWV-C (Ongusetal., 2004; Zionietal., 2011; Mordecaietal., 2016a)。本文將從DWV的生物學(xué)、流行病學(xué)、病理學(xué)和防治技術(shù)4個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1 生物學(xué)

1.1 病毒結(jié)構(gòu)

根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)分類，DWV屬于小核糖核酸病毒目Picornavirales傳染性軟化病毒科Iflaviridae，傳染性軟腐病病毒屬Iflavirus(Vallesetal., 2017)。如圖1所示，DWV是單鏈正鏈RNA病毒，其基因組是單順?lè)醋?，總長(zhǎng)度為10 140 bp(不含PolyA長(zhǎng)度時(shí))，僅有一個(gè)連續(xù)開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)?；蚪M的5′UTR長(zhǎng)1 144 bp，3′UTR長(zhǎng)338 bp，5′UTR 和3′UTR都參與了基因組的復(fù)制和翻譯。N端包括核糖體翻譯起始位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site，IRES)和先導(dǎo)蛋白(Leader protein，Lp)以及4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，VP1(44 kDa)、VP2(32 kDa)、VP3(28 kDa)和VP4。C端包括RNA解旋酶(Helicase)、病毒基因組連接蛋白(Viral Protein genome linked，VPg)、3C-蛋白酶(Chymotrypsin-like 3C protease，3C-pro)以及RNA聚合酶(RdRp)，其末端有多聚A尾巴(PolyA)(Lanzietal., 2006; Nakashima and Uchiumi, 2009; Dalmonetal., 2017)。

DWV的5′端與Iflaviridae屬的其他病毒相比，具有高度的多樣性(Murakamietal., 2014)。5′UTR有一個(gè)類似四葉草形狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)IRES，與翻譯的啟動(dòng)有關(guān)。IRES的存在使得許多小核糖核酸病毒目病毒可以通過(guò)阻斷帽子依賴(Cap-dependent)的翻譯起始，從而抑制宿主細(xì)胞蛋白的合成，但不影響病毒蛋白的合成，這有利于病毒應(yīng)對(duì)宿主防御機(jī)制(Fernándezetal., 2013)。Lp具有多種功能，包括蛋白酶活性，在氨基酸水平高度可變。有研究發(fā)現(xiàn)DWV與其變異體VDV-1差異最大位置是Lp，同源性最低只有73.9%(Dalmonetal., 2017)。VPg不僅有穩(wěn)定基因組的作用，還參與了復(fù)制和翻譯等過(guò)程(Hébrardetal., 2009)。3′UTR區(qū)域高度保守，末端以共價(jià)的方式連接PolyA，PolyA的長(zhǎng)度由遺傳決定。圖1顯示核苷酸標(biāo)度及各元件相應(yīng)核苷酸數(shù)量；非結(jié)構(gòu)蛋白在上方，結(jié)構(gòu)蛋白在下方；箭頭表示一些關(guān)鍵的重組區(qū)域，包括DWV基因組Helicase、5′UTR 和Lp編碼的區(qū)域。

圖1 DWV基因組的示意圖Fig.1 Schematic diagram of DWV genome注：根據(jù)文獻(xiàn) Lamp et al., 2016和Dalmon et al., 2017修改。

通過(guò)冷凍電子顯微鏡(Cryo-Electron Microscopy)和X射線晶體學(xué)發(fā)現(xiàn)DWV是輕微的橢球體結(jié)構(gòu)，其直徑約30 nm，病毒衣殼為對(duì)稱的偽T3二十面體，不含脂膜(kubníketal., 2017)。結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3的亞基排列成原聚體，在衣殼蛋白上每5個(gè)原聚體形成一個(gè)單位，五聚體的封閉和開(kāi)放控制著病毒的釋放過(guò)程(Organtinietal., 2017)，衣殼蛋白在保護(hù)病毒RNA不被RNA酶降解和確定病毒宿主的特異性等方面也起著重要作用。當(dāng)環(huán)境pH改變或者在高濃度的非生理性離子條件下，DWV的衣殼三維結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，特別是衣殼蛋白VP3的C末端延伸在病毒表面形成的p-結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)為突出球狀延伸；病毒衣殼構(gòu)象的變化，可能會(huì)產(chǎn)生新的催化位點(diǎn)，從而影響病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞(Organtinietal., 2017;kubníketal., 2017)。Picornavirales的大多數(shù)病毒基因組編碼的小蛋白VP4已經(jīng)被證明參與了細(xì)胞膜通透性的改變，例如吸血獵椿病毒(Triatoma Virus，TrV)的VP4小蛋白插入膜中，形成新的蛋白通道，而當(dāng)pH值越高時(shí)，膜的滲透性也越高(Sánchez-Eugeniaetal., 2015)，DWV中的VP4小蛋白也可能影響著膜的透性。

1.2 病毒變異及進(jìn)化關(guān)系

RNA病毒具有很高的突變率，變異后的毒株共同存在并感染寄主的現(xiàn)象是病毒感染的特征之一，影響著病毒的復(fù)制、傳播和疾病誘導(dǎo)等過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)DWV主要有3種基因型：DWV-A、DWV-B和DWV-C (Lanzietal., 2006; Zionietal., 2011; Mordecaietal., 2016a)。

圖2-a顯示了基于RdRp的氨基酸序列保守區(qū)域的貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化推理，節(jié)點(diǎn)上顯示貝葉斯支持值。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，DWV各基因型的親緣性不同，DWV-A與DWV-B親緣性較近，屬于同一分支，DWV-C雖然與DWV-A和DWV-B不屬于同一分支，但相比于囊狀幼蟲(chóng)病毒(Sacbrood Bee Virus，SBV)，與DWV-A和DWV-B的親緣性更近。

DWV最初基因，現(xiàn)在稱為DWV-A基因型，包括先前大部分DWV序列和Kakugo病毒(KV)(Lanzietal., 2006)。通常，在無(wú)狄斯瓦螨的蜂群中，DWV表現(xiàn)為低水平，無(wú)癥狀感染，然而狄斯瓦螨存在時(shí)，會(huì)導(dǎo)致DWV的載量顯著增加，流行率上升，呈現(xiàn)明顯癥狀(Ryabovetal., 2014)。早先研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)顯性感染的狄斯瓦螨體內(nèi)的DWV水平，遠(yuǎn)高于誘導(dǎo)隱形感染的狄斯瓦螨的DWV水平，暗示著DWV在狄斯瓦螨體內(nèi)復(fù)制到一定閾值，才能表現(xiàn)出致病癥狀(Gisderetal., 2009)。而其他的研究則發(fā)現(xiàn)狄斯瓦螨體內(nèi)的DWV水平呈高度動(dòng)態(tài)，主要由狄斯瓦螨取食過(guò)程決定，而不是依賴狄斯瓦螨體內(nèi)的復(fù)制。取食低DWV-A水平蜂蛹的狄斯瓦螨傳代后，子代螨傳播DWV-A的能力下降，說(shuō)明DWV-A進(jìn)化更傾向于寄生蜜蜂，而不是寄生狄斯瓦螨(Posada-Florezetal., 2019)。

DWV-B包括狄斯瓦螨病毒(VDV-1)以及VDV-1-DWV重組體。VDV-1是從狄斯瓦螨組織中分離到的類病毒，與DWV具有84%的核苷酸同源性，差異主要集中在5′UTR區(qū)域。VDV-1能和DWV共同感染蜜蜂，并與DWV-A發(fā)生基因重組，產(chǎn)生重組體VDV-1-DWV，VDV-1-DWV是強(qiáng)毒株型，導(dǎo)致蜜蜂殘翅(Ongusetal., 2004; Zionietal., 2011)。

蜂群中一種基因型的流行導(dǎo)致了另一種基因型不占優(yōu)勢(shì)，這種現(xiàn)象叫“重復(fù)感染排除”，新產(chǎn)生的變異體一定程度上保護(hù)了蜂群(Mordecaietal., 2016b)。例如，DWV-B的出現(xiàn)與狄斯瓦螨的流行關(guān)系密切，并且因?yàn)榈宜雇唑拇嬖趯?dǎo)致了病毒遺傳多樣性的快速下降 (Martinetal., 2012)。然而關(guān)于DWV多樣性變化以及變異體之間相互排斥、相互競(jìng)爭(zhēng)的觀點(diǎn)還存在爭(zhēng)議。病毒與宿主之間始終是在相互適應(yīng)，不斷進(jìn)化的過(guò)程中。有研究發(fā)現(xiàn)，即使在有狄斯瓦螨的蜂群中，依然存在DWV的高度多樣性。通過(guò)反向遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同變異體的復(fù)制頻率相似，而且廣泛存在重組現(xiàn)象，但缺乏協(xié)同效應(yīng)和排斥競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，這種病毒高度共存的現(xiàn)象，是DWV不斷適應(yīng)宿主的結(jié)果，有利于病毒形成抗RNA干擾能力，來(lái)應(yīng)對(duì)宿主的防御機(jī)制(Ryabovetal., 2019)。

DWV-C與前面描述的DWV-A和DWV-B不同，是一個(gè)新的、獨(dú)立的分支。從英格蘭南部德文郡地區(qū)的蜂群中，采集經(jīng)歷越冬群落損失后存活的無(wú)癥狀蜜蜂樣本，進(jìn)行雙末端測(cè)序，發(fā)現(xiàn)新的DWV變異體，命名為DWV-C (Mordecaietal., 2016a)。

圖2-b顯示了DWV變異體的同源百分比單位矩圖：氨基酸(下劃?rùn)M線)；核苷酸(無(wú)下劃?rùn)M線)。DWV-C與DWV-A和DWV-B在核苷酸序列和氨基酸序列都存在差異，并且存在A型與C型重組或者B型與C型重組現(xiàn)象。在蜜蜂蜂群中，狄斯瓦螨傳播的DWV變異體主要是B型，而與C型無(wú)關(guān)。而對(duì)歐洲越冬消失的蜂群樣本進(jìn)行DWV三種變異體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DWV-C是越冬蜂群消失最后一個(gè)月的優(yōu)勢(shì)基因型，暗示著DWV-C影響著越冬蜂群消失(Kevilletal., 2017)。更多地區(qū)的樣本調(diào)查顯示，DWV-C在流行性和病毒載量方面，與DWV-A和DWV-B相比，呈較低水平(Kevilletal., 2019)。然而，在調(diào)查巴西的無(wú)刺蜂Meliponasubnitida蜂群時(shí)發(fā)現(xiàn)，蜂群廣泛存在DWV-C，且表現(xiàn)為顯性變異，這表明不同的寄主生物對(duì)不同DWV變異體的敏感性可能不同，這也影響著DWV變異體在不同寄主間的流行情況(de Souzaetal., 2019)。

圖2 三種基因型的進(jìn)化關(guān)系及同源性Fig.2 Phylogeny and homology analysis of three genotypes注：根據(jù)文獻(xiàn)Mordecai et al., 2016a和 Martin and Brettell, 2019修改。

1.3 DWV的研究方法

1.3.1DWV病毒粒子形態(tài)觀察

DWV是RNA病毒，有變異、重組以及隱形感染現(xiàn)象，診斷存在困難。與其他病原體相比，DWV的顆粒極其微小，普通的光學(xué)顯微鏡無(wú)法觀察，通過(guò)透射電鏡，才能觀察到純化后病毒顆粒的形態(tài)特征，然而這只能較為精確地測(cè)定DWV的大小、形狀及相對(duì)位置，結(jié)合X射線晶體學(xué)才能夠進(jìn)一步分析DWV的三維結(jié)構(gòu)(kubníketal., 2017)，但還無(wú)法精確區(qū)分病毒的種類。

病毒粒子的形態(tài)觀察建立在病毒粒子的分離純化基礎(chǔ)上，氯化銫濃度梯度超速離心法是分離純化蜜蜂病毒的常用技術(shù)，具體步驟如下(Fannon and Ryabov, 2016)：

1)收集5 g蜜蜂(一般采集癥狀明顯、發(fā)育不良的殘翅成年蜜蜂比較容易分離到病毒粒子)，在研缽中加入35 mL PBS緩沖液(100 mM PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4)，研磨均勻。

2)4℃，10 000 rpm離心12 min。去除上層脂質(zhì)層和底部未完全研磨組織顆粒層，保留中間層。

3)準(zhǔn)備一個(gè)30 mL離心管，里面加入 2.5 mL 20%蔗糖溶液(蔗糖用PBS緩沖液配制)，隨后加入上述中間層溶液，不要混勻，置于上層，這樣超速離心過(guò)程中上層中的病毒粒子可以穿過(guò)0.5 cm的蔗糖層到達(dá)底部。

4)18℃，28 000 rpm離心3 h 30 min(SW28 Beckman 角轉(zhuǎn)頭)。棄上層，收集底部沉淀，重懸于2 mL PBS緩沖液，4℃過(guò)夜，以便充分重懸病毒粒子。

5)制備氯化銫梯度溶液。35 mL超速離心機(jī)專用離心管，從底部往上依次加入5 mL密度為1.6 g/cm3、1.5 g/cm3、1.4 g/cm3、1.3 g/cm3和1.2 g/cm3。不同密度的氯化銫溶液都是加PBS緩沖液稀釋飽和氯化銫溶液而得。最后將上一步所得的病毒粒子溶液加在最上層。

6)4℃，28 000 rpm離心18 h(SW28 Beckman水平轉(zhuǎn)頭)。

7)收集每個(gè)間隔層的1.5 mL溶液，主要可能存在于1.3～1.4 g/cm3的間隔層，混合所有收集到的溶液，用PBS緩沖液稀釋5～10倍。

8)4℃，28 000 rpm離心3 h(SW28 Beckman 角轉(zhuǎn)頭)，收集底部沉淀，重懸于200 μL 0.1M，pH 7.4的PBS緩沖液。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2DWV的分子鑒定

通過(guò)電鏡觀察到病毒顆粒的形態(tài)特征后，還需要分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)明確病毒的種類。免疫學(xué)檢測(cè)是利用針對(duì)病毒衣殼蛋白高度特異性抗體作為探針，來(lái)定性和定量檢測(cè)病毒。目前，多采用酶聯(lián)免疫技術(shù)來(lái)檢測(cè)DWV，然而這種方法只適用于檢測(cè)高濃度的DWV，當(dāng)不同病毒的基因同源性較高時(shí)，免疫學(xué)檢測(cè)的特異性較差。利用分子技術(shù)檢測(cè)不同病毒核苷酸序列的差異，可以準(zhǔn)確地鑒定出病毒的種類。

在蜜蜂殘翅病的診斷中，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)應(yīng)用最廣泛。RT-PCR將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合，是一種針對(duì)目的產(chǎn)物RNA的核酸分子檢測(cè)技術(shù)。其原理是RNA單鏈在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，隨后以cDNA為模板，在引物和DNA聚合酶的作用下，不斷進(jìn)行目的基因的循環(huán)擴(kuò)增，因此可以檢測(cè)較低水平的DWV樣本，具有很高的靈敏性(Lanzietal., 2006)。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，新的PCR技術(shù)也不斷應(yīng)用于蜜蜂病毒病的診斷，如定量PCR(Quantitative PCR)能對(duì)DWV等RNA病毒濃度進(jìn)行定量檢測(cè)，來(lái)研究病毒載量與危害癥狀的關(guān)系(Highfieldetal., 2009)；多重PCR(Multiplex PCR)可以同時(shí)檢測(cè)多重病毒(Sguazzaetal., 2013)，提高檢測(cè)的效率；巢氏PCR(Nested PCR)通過(guò)兩輪PCR來(lái)提高反應(yīng)的特異性(Fannon and Ryabov, 2016)。目前，基于PCR的核酸分子檢測(cè)技術(shù)相比于傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有高效、精確和低成本等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用到蜜蜂病毒學(xué)的研究工作中。高通量測(cè)序是目前用于發(fā)現(xiàn)新病毒的主要技術(shù)，DWV的幾種變異體都是通過(guò)高通量測(cè)序而發(fā)現(xiàn)的(Mooreetal., 2011)。

1.3.3DWV的體內(nèi)復(fù)制示蹤

為研究DWV的致病機(jī)制，需要研究病毒在體內(nèi)的分布復(fù)、制繁殖以及對(duì)組織細(xì)胞的危害。鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄(Strand specific RT-qPCR)是用于特異性檢測(cè)病毒的反義鏈，結(jié)合TaqMan定量PCR技術(shù)則可以方便的檢測(cè)到DWV是否在宿主體內(nèi)復(fù)制及其繁殖量(Boncristianietal., 2009)，但是無(wú)法直觀觀察病毒在宿主的具體組織和具體位置的復(fù)制繁殖。利用原位雜交技術(shù)(In-situ hybridization)可檢測(cè)DWV在蜜蜂大腦內(nèi)的復(fù)制，分別使用正鏈和反義鏈探針，檢測(cè)DWV的反義鏈基因組和正鏈基因組，結(jié)果顯示在視覺(jué)神經(jīng)網(wǎng)、蘑菇體和觸角神經(jīng)葉都檢測(cè)到DWV正鏈信號(hào)，同時(shí)也都有稍弱的反義鏈信號(hào)，說(shuō)明DWV在蜜蜂大腦內(nèi)成功復(fù)制繁殖(Shahetal., 2009)。而免疫組化技術(shù)也應(yīng)用到檢測(cè)DWV是否在狄斯瓦螨體內(nèi)繁殖，結(jié)果沒(méi)有在狄斯瓦螨的組織內(nèi)檢測(cè)到DWV特異性反應(yīng)指示信號(hào)，只在中腸腔內(nèi)的糞便上檢測(cè)到(Teresaetal., 2008)。以上技術(shù)都非常確定可以檢測(cè)DWV反義鏈，說(shuō)明DWV確實(shí)發(fā)生了復(fù)制和繁殖，但是都?xì)⑺懒四繕?biāo)昆蟲(chóng)，是在非活體組織上研究。如何能夠在活體觀察DWV的繁殖呢？2019年，通過(guò)構(gòu)建重組DWV基因組并在起始位置加上eGFP標(biāo)記蛋白，可以非常直觀的在熒光顯微鏡下觀察DWV的去向以及復(fù)制增殖(Ryabovetal., 2020)。這項(xiàng)技術(shù)是美國(guó)農(nóng)業(yè)部蜜蜂研究所(USDA-ARS，Bee Research Lab)的最新研究結(jié)果。

1.3.4DWV基因組體外重組

由于缺乏細(xì)胞培養(yǎng)體系、血清學(xué)試劑、特定病毒株或克隆株，盡管經(jīng)過(guò)了幾十年的深入研究，到目前為止，所有的研究都使用了直接從蜂箱采集的受感染的蜜蜂模型和病毒分離物。

多個(gè)病毒株、主變異體甚至種可能同時(shí)出現(xiàn)在這些分離物中，因此可能會(huì)得到一些錯(cuò)誤的結(jié)論。構(gòu)建體外重組病毒(反向遺傳學(xué))則可以繞過(guò)病毒分離和純化，在細(xì)胞克隆培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)克隆病毒。有實(shí)驗(yàn)選擇DWV-A 1414株作為目標(biāo)病毒株，根據(jù)Genebank中4個(gè)DWV-A的基因組序列(AJ489744、AY292384、JQ413340、AB070959)設(shè)計(jì)了28條引物。首先使用巢式RT-PCR分段獲得基因產(chǎn)物并測(cè)序驗(yàn)證序列，然后分別獲得5′端和3′端兩個(gè)有重疊區(qū)域的大片段，最后設(shè)計(jì)一對(duì)可擴(kuò)增全基因組的引物，使用One-Step RT-PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)。隨后將純化的10 164 bp DWV-A的全長(zhǎng)序列插入到pBR322載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101菌株。在構(gòu)建過(guò)程中，還在適當(dāng)?shù)奈恢貌迦肓嗣盖形稽c(diǎn)，從而提取質(zhì)粒后可以通過(guò)酶切獲得線性化病毒用于后續(xù)研究(Lampetal., 2016)。應(yīng)用該方法還能構(gòu)建了多個(gè)DWV克隆珠系，研究這些混合株系在同一個(gè)蜜蜂中的復(fù)制動(dòng)態(tài)(Ryabovetal., 2020)。該技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展為病毒的感染與致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

2 流行學(xué)

2.1 DWV的發(fā)現(xiàn)歷史及寄主范圍

1977年，人們?cè)跓o(wú)癥狀的埃及蜜蜂身上首次分離出DWV，但誤認(rèn)為DWV是埃及蜜蜂病毒(Egypt Bee Virus，EBV)(Baileyetal., 1979)。1982年在日本畸形成年蜜蜂身上也分離出DWV，通過(guò)在血清學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DWV與EBV雖存在親緣性，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由于這種分離出的病毒使成年蜜蜂表現(xiàn)出翅膀殘缺癥狀，因此被命名為殘翅病病毒(DWV)(Bailey and Ball, 1991)。DWV最初被發(fā)現(xiàn)危害英國(guó)、拉丁美洲和南非等國(guó)家和地區(qū)的蜜蜂種群(Allen and Ball, 1996)，但隨著狄斯瓦螨的傳播，DWV的流行范圍不斷擴(kuò)大(Ryabovetal., 2014)，成為目前最流行的蜜蜂病毒，對(duì)32個(gè)國(guó)家的調(diào)查顯示，蜂群中DWV的平均感染率至少為55% (Martin and Brettell, 2019)。盡管DWV的毒力相對(duì)較低，但在狄斯瓦螨侵染過(guò)的蜜蜂中，DWV是持續(xù)增殖的，一旦感染就可能爆發(fā)，導(dǎo)致成蜂殘翅以及蜂群損失(Schroeder and Martin, 2012; Mondetetal., 2014)。

目前，DWV的宿主涵蓋了10個(gè)目的68種節(jié)肢動(dòng)物，其中64種節(jié)肢動(dòng)物屬于昆蟲(chóng)綱Insecta，包括膜翅目Hymenoptera、半翅目Hemiptera、鞘翅目Coleoptera、雙翅目Diptera、鱗翅目Lepidotera、革翅目Dermaptera和蜚蠊目Blattodea 7個(gè)目。4種節(jié)肢動(dòng)物屬于蛛形綱Arachnida，包括蜱螨目Arachnoidea、蜘蛛目Araneae和盲蛛目Opiliones 3個(gè)目(Martin and Brettell, 2019)。

2.2 DWV的傳播特征

DWV作為一種專性寄生性生物，其生存依賴于活體宿主細(xì)胞的生命機(jī)制。為了不斷繁殖，DWV需要從一個(gè)寄主傳播到另一個(gè)寄主。DWV的傳播包括了水平傳播與垂直傳播。傳播方式?jīng)Q定著DWV的存在水平以及增殖速度，進(jìn)而影響著DWV的毒力大小以及流行情況，最終表現(xiàn)在對(duì)寄主危害程度和宿主范圍大小的變化。

2.2.1水平傳播

2.2.1.1 食物源-消化道傳播

食物源-消化道傳播是指DWV寄主在食用受污染的食物或者通過(guò)消化道排出有病毒的糞便后，發(fā)生病毒傳播和感染的現(xiàn)象。不管是蜜蜂的食物來(lái)源如蜂蜜、蜂王漿、花粉等，還是蜜蜂體內(nèi)的胸腺、下咽腺、中腸等部位，以及蜜蜂排出的糞便，均檢測(cè)到DWV陽(yáng)性，暗示著在蜜蜂取食、喂食、護(hù)理幼蟲(chóng)或者清理巢房時(shí)，會(huì)發(fā)生DWV的水平傳播(Yue and Genersch, 2005；Singhetal., 2010)。

花粉是蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育的主要蛋白質(zhì)來(lái)源，對(duì)蜜蜂的營(yíng)養(yǎng)代謝有著重要影響。通常情況下，未被蜜蜂采集的花粉不存在DWV，而蜜蜂采集后的花粉檢測(cè)到DWV存在，說(shuō)明DWV的水平傳播可以通過(guò)傳粉昆蟲(chóng)的訪花過(guò)程發(fā)生(Mazzeietal., 2014)?；ǚ壑械鞍踪|(zhì)與脂類的比例不同，也影響著傳粉昆蟲(chóng)的覓食偏好性((Vaudoetal., 2016)，從而影響了DWV的水平傳播速率。

螞蟻是DWV的寄主之一，與DWV的食物源傳播也有著密切關(guān)系。野外的螞蟻Myrmicarubra經(jīng)常取食死亡的蜜蜂，而死亡的蜜蜂體內(nèi)很有可能攜帶DWV (Schl?ppietal., 2019)，暗示著食物源傳播是DWV跨物種水平傳播的機(jī)制之一。

2.2.1.2 媒介傳播

DWV的最初寄主是西方蜜蜂，在蜂群中致病力較弱，存在水平較低，呈隱性感染存在。而狄斯瓦螨最初寄主是東方蜜蜂Apiscerana，因其傳播到西方蜜蜂蜂群，才改變了DWV流行程度及其多樣性，成為DWV最主要的傳播媒介(M?ckeletal., 2011; Wilfertetal., 2016)。一方面，狄斯瓦螨本身的寄生行為，影響著蜜蜂的健康及生理狀態(tài)(張祎和韓日疇, 2012)；另外一方面，狄斯瓦螨的取食行為，使DWV跨越體壁或圍食膜等生理障礙，直接傳播到蜜蜂的血淋巴，導(dǎo)致蜜蜂的DWV水平上升。雖然DWV能否在狄斯瓦螨體內(nèi)復(fù)制尚存在爭(zhēng)議，但因狄斯瓦螨寄生和取食的特性，直接導(dǎo)致了蜂群中DWV的快速流行以及多樣性的下降，并且通過(guò)蛋白組學(xué)，也證明狄斯瓦螨體內(nèi)并沒(méi)有進(jìn)行DWV的復(fù)制，所以DWV的多樣性主要取決于傳播途徑而不是是否在狄斯瓦螨體內(nèi)增殖(Ryabovetal., 2014; Erbanetal., 2015)。DWV還以狄斯瓦螨為媒介，實(shí)現(xiàn)跨物種水平傳播，如Bombuspascuorum和Bombusterrestris等大黃蜂的蜂群已存在DWV的流行，并且發(fā)生著DWV的不同變異體的流行性以及毒力的改變(Manleyetal., 2019)。

此外，梅氏熱厲螨Tropilaelapsmercedesae是蜜蜂的另外一種寄生螨，也是攜帶和傳播DWV的媒介，梅氏熱厲螨可能成為DWV流行的新載體(Khongphinitbunjongetal., 2016)。

2.2.1.3 體表傳播

蜜蜂是一種會(huì)飛行的群居性昆蟲(chóng)，蜂巢內(nèi)龐大的蜜蜂數(shù)量和個(gè)體間頻繁的身體接觸極易導(dǎo)致蜜蜂病毒的傳播。冬季是蜜蜂休憩的季節(jié)，然而由于冬季環(huán)境溫度較低，蜜蜂不得不聚集在一起以保存和提高熱量，保持代謝率。蜜蜂身體接觸的過(guò)程中，很容易出現(xiàn)表皮破損，如體表絨毛掉落，這有利于病毒從傷口進(jìn)入蜜蜂體內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致病毒在蜂群中的流行，這也是冬季蜂群消失的原因之一。而蜂群密度過(guò)大時(shí)或者在外界蜜源缺乏出現(xiàn)盜蜂時(shí)，同樣會(huì)增加蜜蜂個(gè)體的身體接觸，導(dǎo)致DWV的快速流行，因此，適當(dāng)?shù)姆址涮幚?，有利于抑制蜜蜂病毒在蜂群中傳?Bailey and Ball, 1991)。

2.2.2 垂直傳播

垂直傳播是由親代傳播到子代的一種傳播方式。研究發(fā)現(xiàn)，盡管蜂王與雄蜂都表現(xiàn)為健康狀態(tài)，但在蜂王卵巢和雄蜂精囊卻檢測(cè)到了DWV，暗示DWV垂直傳播的可能。實(shí)驗(yàn)室利用人工授精的方式，用DWV陽(yáng)性精子與蜂王DWV陰性的卵子結(jié)合，或者DWV陰性精子與蜂王DWV陽(yáng)性的卵子結(jié)合，均產(chǎn)生了DWV陽(yáng)性的受精卵，發(fā)育為感染DWV的工蜂。DWV陽(yáng)性未受精的卵也可直接發(fā)育為感染DWV的雄蜂，即DWV可以通過(guò)父系或母系，垂直傳播給后代(Yueetal., 2007; de Miranda and Fries, 2008)。

通過(guò)自然交配的方式，受感染的雄蜂能與正常的雄蜂競(jìng)爭(zhēng)，并與蜂王交配，使蜂王攜帶DWV。蜂王交配后的DWV載量明顯高于未交配的對(duì)照組，并且DWV主要存在于腹部和胸腔，而頭部、卵巢、精囊和精子的病毒載量較低，暗示DWV存在垂直傳播的途徑，但主要依賴水平傳播 (Amirietal., 2016)。

DWV的垂直傳播可進(jìn)一步分為病毒在卵表面?zhèn)鞑サ慕?jīng)卵傳播和病毒在卵內(nèi)傳播的經(jīng)卵傳播。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)卵感染DWV的水平與蜂王巢房感染DWV的水平存在正相關(guān)關(guān)系，而當(dāng)蜂王感染DWV水平較低時(shí)，則通常無(wú)法檢測(cè)到卵含有DWV。對(duì)卵表面進(jìn)行漂白劑處理以及無(wú)菌水清洗后，發(fā)現(xiàn)DWV的濃度相對(duì)于未處理的空白對(duì)照顯著下降，表明DWV的垂直傳播更多依賴于卵表面?zhèn)鞑?，而不是卵?nèi)傳播(Amirietal., 2018)。

寄主在感染DWV后，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)會(huì)發(fā)生變化，如免疫系統(tǒng)基因的表達(dá)或抑制，進(jìn)而適應(yīng)DWV不同的傳播方式。通過(guò)對(duì)相關(guān)基因的定量檢測(cè)，或許更有利于理解DWV的水平傳播與垂直傳播以及這些途徑對(duì)宿主帶來(lái)的影響(Ryabovetal., 2016)。

3 病理學(xué)

3.1 DWV對(duì)蜜蜂的危害

DWV是引起蜜蜂感染后具有明確疾病癥狀的幾種蜜蜂病毒之一。DWV感染的典型癥狀包括成年蜜蜂翅膀皺縮、體型縮小和變色，蛹發(fā)育緩慢和幼蜂迅速死亡等(Kovac and Crailsheim, 1988;de Miranda and Genersch, 2010)。DWV感染蜜蜂后，在蜜蜂大腦負(fù)責(zé)視覺(jué)和嗅覺(jué)等關(guān)鍵區(qū)域復(fù)制，最終導(dǎo)致蜜蜂行為異常(Shahetal., 2009)。DWV不僅感染蜜蜂的大腦，還感染分泌腺和脂肪體(Fujiyuki etal., 2009)，而脂肪體對(duì)昆蟲(chóng)的新陳代謝、免疫和信息素的產(chǎn)生起著重要的作用。

比較分析DWV感染的癥狀蜜蜂與無(wú)癥狀蜜蜂，發(fā)現(xiàn)有癥狀的蜜蜂觸角中含有大量的DWV，病毒衣殼在蜜蜂觸角上皮區(qū)域聚集，呈晶體狀排布，而且感染的區(qū)域完整性也受到破壞，暗示著觸角的功能受損，進(jìn)而影響蜜蜂的交流(Kimetal., 2019)。DWV還損傷蜜蜂神經(jīng)元，促使工蜂過(guò)早成熟，過(guò)早地從內(nèi)勤蜂轉(zhuǎn)變?yōu)椴杉?Tranielloetal., 2020)。DWV的復(fù)制水平影響著蜜蜂的壽命，與蜜蜂越冬群體的損失有著很強(qiáng)相關(guān)性，有實(shí)驗(yàn)表明，冬季蜜蜂DWV載量增加，與參與細(xì)胞免疫的基因表達(dá)減少有關(guān)，導(dǎo)致了蜜蜂對(duì)DWV的易感性，最終危及越冬蜜蜂群體(Steinmannetal., 2015)。DWV對(duì)蜂蛹表現(xiàn)出低毒性，感染了高水平DWV的蜂蛹，仍然能正常發(fā)育，死亡率較低(Remnantetal., 2019; Teheletal., 2019)。

3.2 DWV的致病機(jī)理

3.2.1DWV與媒介的協(xié)同作用

生物因素和非生物因素的脅迫增加著蜜蜂感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，除了溫度變化和蜜蜂自身群體的強(qiáng)弱影響著蜜蜂對(duì)病毒的抵抗力外，狄斯瓦螨的媒介作用直接改變了蜂群中DWV的傳播情況 (Priscoetal., 2011)。有研究從動(dòng)態(tài)學(xué)的角度，建立模型來(lái)闡述蜜蜂-DWV-狄斯瓦螨三者的相互關(guān)系 (Kangetal., 2016)，而狄斯瓦螨與DWV的協(xié)同關(guān)系包括影響著病毒癥狀的顯隱性、DWV的復(fù)制水平和流行率以及蜜蜂的免疫反應(yīng)等方面。

病原寄生于寄主，有兩種表現(xiàn)方式：隱性感染和有癥狀的顯性感染。表現(xiàn)為哪種感染，與病原的載量、毒力、傳播途徑以及寄主的免疫反應(yīng)等多方面因素有關(guān)(Sorrelletal., 2009; Rigaudetal., 2010)。在沒(méi)有狄斯瓦螨的情況下，DWV在蜂群中通常呈低水平，表現(xiàn)為隱性感染(Shutleretal., 2014; Robertsetal., 2017)。相反，在存在狄斯瓦螨的蜂群中，DWV在蜂群中通常呈高水平，感染DWV的成蜂出現(xiàn)翅膀殘缺、壽命縮短等癥狀，以及冬季蜜蜂種群損失現(xiàn)象，表現(xiàn)為顯性感染(Dainatetal., 2012; Wuetal., 2017)。

DWV可以感染西方蜜蜂的雄蜂及各個(gè)齡期的工蜂，DWV的滴度從低到高依次是正常成年雄蜂、正常成年工蜂、幼蟲(chóng)、殘翅成年蜂、蛹(Chenetal., 2005)。而狄斯瓦螨的存在不僅導(dǎo)致蜜蜂體內(nèi)DWV滴度的不斷增加、蜜蜂種群中DWV的流行率陡增，還導(dǎo)致DWV多樣性的大量減少，最終形成DWV單一優(yōu)勢(shì)和高致病性(Martinetal., 2012)。狄斯瓦螨的唾液中存在毒性蛋白(Varroatoxic protein，VTP)，在缺乏DWV的情況下能直接殺死東方蜜蜂的幼蟲(chóng)和蛹，其重組表達(dá)的VTP能引起DWV滴度的升高和成蜂翅膀的不正常發(fā)育(Zhang and Han, 2018)。

關(guān)于DWV與狄斯瓦螨的協(xié)同作用對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，目前還存在爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為感染DWV后的蜂蛹，因狄斯瓦螨的誘導(dǎo)而產(chǎn)生免疫抑制，有利于DWV進(jìn)一步復(fù)制(Yang and Cox-Foster, 2005)。其他實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)狄斯瓦螨通過(guò)干擾NF-kb信號(hào)途徑，抑制了體液免疫和細(xì)胞免疫，從而促進(jìn)了螨的繁殖，這也暗示著狄斯瓦螨與DWV之間存在互利共生的關(guān)系(Di Priscoetal., 2016)。然而，相反的觀點(diǎn)則認(rèn)為隨著狄斯瓦螨數(shù)量的增加，免疫反應(yīng)可能會(huì)被激活(Zhangetal., 2010)。對(duì)蜜蜂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性創(chuàng)傷后，檢測(cè)到蜜蜂DWV滴度上升和相關(guān)的免疫基因表達(dá)上調(diào)，這表明狄斯瓦螨吸食血淋巴并不會(huì)抑制蜜蜂的免疫系統(tǒng)；相反，蜜蜂免疫基因表達(dá)增加，一定程度上抑制了狄斯瓦螨的繁殖(Kusteretal., 2014)。蜜蜂對(duì)DWV與狄斯瓦螨的免疫反應(yīng)可能不呈持續(xù)穩(wěn)定狀態(tài)，初始DWV的水平較低，這是由于Toll途徑轉(zhuǎn)錄因子和其他免疫效應(yīng)分子的高水平表達(dá)，但這種表達(dá)是暫時(shí)性的，伴隨著這些途徑的下調(diào)，DWV開(kāi)始不斷地復(fù)制(Zhaoetal., 2019)。

3.2.2DWV與殺蟲(chóng)劑的協(xié)同作用

農(nóng)藥，特別是以神經(jīng)系統(tǒng)為靶標(biāo)殺蟲(chóng)劑，如新煙堿類農(nóng)藥，在防治螨類的同時(shí)，對(duì)蜜蜂這類傳粉型昆蟲(chóng)，不僅有著直接致命影響(Samuelsonetal., 2016)，還能與DWV產(chǎn)生協(xié)同作用，間接加重對(duì)蜜蜂的危害。研究發(fā)現(xiàn)死亡的蜜蜂中殺蟲(chóng)劑的含量與DWV等病毒的流行率呈正相關(guān)，這意味著殺蟲(chóng)劑可以協(xié)同并加重DWV對(duì)蜜蜂健康的危害，威脅蜂群的生存(Martinelloetal., 2017)。病毒與殺蟲(chóng)劑在蜜蜂上的協(xié)同作用關(guān)系比較復(fù)雜：殺蟲(chóng)劑可能成為病毒復(fù)制的加速因子，導(dǎo)致病毒大量擴(kuò)增，進(jìn)而危害蜜蜂(Diaoetal., 2018)，但更高的殺蟲(chóng)劑劑量不意味著一定會(huì)引起更高的病毒滴度，而是通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)免疫信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)作用，來(lái)降低蜜蜂對(duì)病毒感染的耐受度(Di Priscoetal., 2013; Coulonetal., 2018)。

3.2.3DWV與其他病原體的共同感染

蜂群同時(shí)感染多種病原體是非常普遍的現(xiàn)象(Granbergetal., 2013)。當(dāng)兩種病原體同時(shí)感染宿主時(shí)，可能是互利關(guān)系(Positively)也有可能是競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系(Negatively)或者互不影響(Independently)。

微孢子蟲(chóng)Nosemaceranae是一種干擾蜜蜂蛋白質(zhì)代謝的專性寄生蟲(chóng)。最初的研究發(fā)現(xiàn)微孢子蟲(chóng)與DWV共同感染存在拮抗作用，這兩種病原體在蜜蜂的中腸呈顯著的負(fù)相關(guān)，但在蜜蜂頭部或胸部，兩者沒(méi)有表現(xiàn)出相關(guān)性(Costaetal.,2011)。之后在蜜蜂中腸的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明微孢子蟲(chóng)與DWV呈不對(duì)稱的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，且不利于DWV的繁殖。如果蜜蜂先感染DWV，微孢子蟲(chóng)能夠正常繁殖，但如果蜜蜂先感染微孢子蟲(chóng)則抑制DWV的增殖(Doubletetal., 2015)。微孢子蟲(chóng)與DWV的共同感染影響，還與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。在沒(méi)有花粉的條件下，微孢子蟲(chóng)的感染提高了蜜蜂體內(nèi)的DWV水平，但有花粉的條件下，感染微孢子蟲(chóng)的蜜蜂與沒(méi)感染微孢子蟲(chóng)的蜜蜂相比，DWV水平?jīng)]有顯著差異，暗示著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能減少病原體寄生的影響，或者提高蜜蜂的免疫力(Zhengetal.,2015)

花卉是蜂類采蜜和傳粉的主要植物，也是各種病原體的寄主。蜂類在訪花過(guò)程中，受到多種病原體的共同感染，使蜂群的數(shù)量和豐富度迅速下降(Sachman-Ruizetal., 2015)。DWV在不同的植物物種間分布不均勻，DWV如何通過(guò)花傳播和擴(kuò)散，取決于植物的性狀、病毒株的傳染性、寄主免疫能力以及昆蟲(chóng)覓食行為等(Algeretal., 2019)。

3.2.4DWV與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)系

DWV復(fù)制水平，與蜜蜂吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有著密切關(guān)系。花粉含有蛋白質(zhì)、糖類、脂類、維生素和礦物質(zhì)等，是蜜蜂重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源。最初有研究發(fā)現(xiàn)，花粉與糖水相比，前者能激活健康蜜蜂相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)代謝途徑，如卵黃蛋白原(Vg)基因的表達(dá)，進(jìn)而能對(duì)蜜蜂壽命產(chǎn)生積極影響，但是狄斯瓦螨的寄生行為抑制了蜜蜂的相關(guān)代謝途徑，即使攝入花粉也不能逆轉(zhuǎn)這種影響，并且花粉的攝入有利于DWV在蜜蜂體內(nèi)的繁殖(Alauxetal., 2011)。

然而，另外的實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于正常的蜜蜂，花粉和糖水喂食，兩者對(duì)蜜蜂壽命影響差異不大，但當(dāng)蜜蜂被狄斯瓦螨寄生時(shí)，花粉能明顯提高蜂群存活率，并且喂食花粉的蜜蜂比喂食糖水的蜜蜂，具有更低的DWV水平，并且對(duì)微孢子蟲(chóng)的耐受性上升，這可能與花粉中的非極性物質(zhì)，如脂類有關(guān)，反映了花粉可能有助于減少蜂群損失(Annosciaetal., 2017; Tritschleretal., 2017)。

值得注意的是，蜜蜂消化花粉的能力有限，過(guò)量取食花粉反而對(duì)蜜蜂造成危害。只有攝入的蛋白質(zhì)被蜜蜂有效地吸收，才能維持蜜蜂血淋巴中的蛋白質(zhì)正常水平，進(jìn)而促進(jìn)蜜蜂的健康以及提高蜜蜂對(duì)病原的耐受性(Basualdoetal., 2014;Paolietal.,2014)。蜜蜂的營(yíng)養(yǎng)代謝與腸道細(xì)菌群有著密切關(guān)系，在有腸道細(xì)菌的存在下，即使不提供花粉，蜜蜂的營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫系統(tǒng)不會(huì)受到很大影響，但如果使用抗生素，破壞蜜蜂腸道中的細(xì)菌群，蜜蜂的壽命會(huì)顯著縮短(Lietal., 2019)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與病原和寄主的相互作用機(jī)制，仍需要進(jìn)一步研究。

4 防治

DWV的流行與爆發(fā)會(huì)給蜜蜂養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)以及背后的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失，但目前還沒(méi)有針對(duì)DWV的特效藥物。為了減少DWV的傳播與危害，可以從以下兩個(gè)方面著手：一是切斷DWV的傳播途徑；二是應(yīng)用RNAi技術(shù)來(lái)抑制蜂群中DWV的繁殖。

4.1 DWV傳播途徑的切斷

DWV寄生于蜜蜂，水平較低時(shí)以隱形感染的的方式，長(zhǎng)期廣泛地存在于蜂群中，當(dāng)遇到外界壓力的激活或者環(huán)境因子的協(xié)同作用，往往會(huì)快速繁殖，表現(xiàn)顯性癥狀，造成蜜蜂殘翅病的爆發(fā)和流行。其中，狄斯瓦螨作為DWV的傳播媒介，極大地影響了DWV的流行情況。

為了減少DWV的傳播機(jī)會(huì)，一方面，從源頭出發(fā)，保證潔凈的養(yǎng)蜂環(huán)境，定期對(duì)蜂具用品全面清潔消毒。對(duì)來(lái)源復(fù)雜和規(guī)模較大的蜂群采取分散隔離方式放置，減少交叉感染機(jī)會(huì)(張炫等, 2012)。另一方面，要積極采取防治狄斯瓦螨措施，減少DWV的媒介傳播途徑。由于雄蜂房的巢房大小、封蓋時(shí)間以及繁殖環(huán)境的優(yōu)勢(shì)，雄蜂房的狄斯瓦螨感染率是工蜂房的8～10倍(張祎和韓日疇, 2012)，因此割除雄蜂房可以大大減少狄斯瓦螨的數(shù)量(Wantuch and Tarpy, 2009)，但在實(shí)際操作中，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力；殺螨劑可有效防治狄斯瓦螨，針對(duì)狄斯瓦螨的不同分子靶點(diǎn)，最主要有神經(jīng)靶點(diǎn)和肌肉靶點(diǎn)(Sparks and Nauen, 2015)，可使用蠅毒磷、聯(lián)苯菊酯、擬除蟲(chóng)菊酯、雙甲脒、精油、硫丹等殺螨劑，然而大量反復(fù)使用殺螨劑，不僅導(dǎo)致了狄斯瓦螨的抗藥性不斷上升，還會(huì)危害蜜蜂健康以及產(chǎn)生蜂產(chǎn)品農(nóng)藥殘留問(wèn)題(Hillieretal., 2013; Sabováetal., 2019)；生防菌包括真菌與細(xì)菌對(duì)狄斯瓦螨均有一定毒力(Hamiduzzamanetal., 2012; Alquisira-Ramírezetal., 2017)，但還沒(méi)有廣泛應(yīng)用，表現(xiàn)出明顯經(jīng)濟(jì)效益；從寄主的角度出發(fā)，培育抗螨的蜜蜂品種，這種途徑雖然不容易實(shí)現(xiàn)但潛力無(wú)限。直接通過(guò)人工授精的方式，蜜蜂可能無(wú)法表現(xiàn)出抑制螨繁殖的性狀(Beaurepaireetal., 2019)。通過(guò)分子遺傳學(xué)手段，增強(qiáng)蜜蜂梳毛行為、螨敏感衛(wèi)生行為等數(shù)量性位點(diǎn)基因的表達(dá)，可以培育出抗狄斯瓦螨的蜜蜂品種(Zakaretal., 2014)。目前已有抗螨的蜜蜂品種，如俄羅斯蜜蜂品種(Russia Honey Bee，RHB)，成功面向市場(chǎng)(Kirraneetal., 2018)。

4.2 RNAi技術(shù)的應(yīng)用

目前生物技術(shù)RNA干擾(RNA interference, RNAi)在防治DWV方面取得新的進(jìn)展。RNAi指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，主要有3種途徑：microRNA(miRNA)途徑、piwiRNA(piRNA)途徑和small interfering RNA(siRNA)途徑。在害蟲(chóng)防治中應(yīng)用是siRNA途徑(Jogaetal., 2016)，其原理是將外源的dsRNA導(dǎo)入到害蟲(chóng)體內(nèi)，從而激活“siRNA途徑”，Dicer酶將dsRNA切割為24～31 nt左右的小分子RNA，引起同源mRNA特異性降解，沉默重要的基因，最終達(dá)到防治害蟲(chóng)的目的。

早期研究用注射法傳遞dsRNA到狄斯瓦螨身上，表現(xiàn)出高達(dá)97%的RNAi效率 (Campbelletal., 2010)，然而注射法卻不適用于大規(guī)模的防治。用含有dsRNA的蔗糖溶液喂養(yǎng)蜜蜂，在蜜蜂血淋巴中檢測(cè)到dsRNA的存在，狄斯瓦螨取食蜜蜂的血淋巴后，dsRNA從蜜蜂水平轉(zhuǎn)移到狄斯瓦螨，實(shí)現(xiàn)狄斯瓦螨的致死率在60%以上，且dsRNA不會(huì)對(duì)蜜蜂自身造成影響(Garbianetal., 2012)。dsRNA不僅可以轉(zhuǎn)移到蜜蜂不同的組織、不同發(fā)育階段，也可以通過(guò)蜂王轉(zhuǎn)移到后代且具有生物學(xué)活性(Maorietal., 2019)。

細(xì)菌也可作為dsRNA的表達(dá)載體，dsRNA經(jīng)細(xì)菌表達(dá)，再純化后喂食蜜蜂，蜜蜂體內(nèi)病毒的表達(dá)水平下降，幼蟲(chóng)存活率上升，用細(xì)菌來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)dsRNA，是一種新的抗病毒策略(Zhangetal., 2016)。

RNAi也被廣泛應(yīng)用在揭示細(xì)胞色素P450單加氧酶(CYPs)、羧酸酯酶(CarEs)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)等基因在殺蟲(chóng)劑解毒和抗性中的作用。螨類經(jīng)殺螨劑處理后，相關(guān)解毒基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，死亡率下降，通過(guò)RNAi處理，解毒基因表達(dá)顯著下降，導(dǎo)致螨的敏感性和死亡率顯著上升(Liaoetal., 2016; Shenetal., 2016)，RNAi將有利于減低螨的抗藥性以及減少用藥成本。

RNAi的效率不僅與dsRNA的長(zhǎng)度和濃度有關(guān)，還與dsRNA的完整性有關(guān)(Milleretal., 2012)。通過(guò)納米顆?；蛘咧|(zhì)體將dsRNA包裹起來(lái)，再傳遞到昆蟲(chóng)體內(nèi)，能明顯提高RNAi效率，而這些物質(zhì)在保護(hù)dsRNA完整性的同時(shí)，自身容易降解(Heetal., 2013; Taningetal., 2016)。RNAi的效率還取決于多方面因素，包括靶標(biāo)基因的設(shè)計(jì)、靶標(biāo)昆蟲(chóng)的種類、齡期、取食行為以及免疫系統(tǒng)等。隨著對(duì)RNAi的深入研究，相信未來(lái)基于dsRNA的生物農(nóng)藥也將得到應(yīng)用與推廣，但RNAi對(duì)于非靶標(biāo)生物也存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，只有做好風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與預(yù)防，RNAi應(yīng)用安全性才能得到保證，從而更好地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)生物防治。

5 展望

從近些年的研究來(lái)看，DWV的寄主范圍在不斷擴(kuò)大，DWV變異體和重組熱點(diǎn)的出現(xiàn)也威脅著蜜蜂以及新寄主物種的健康與生存。DWV及其變異體的致病機(jī)理研究依然是關(guān)鍵，它們是如何影響蜜蜂的健康、繁殖力以及與狄斯瓦螨-蜜蜂的相互作用，有待新技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用來(lái)深入研究。

目前尚無(wú)治療DWV的藥劑，而狄斯瓦螨對(duì)DWV的傳播起到至關(guān)重要的作用，所以防治狄斯瓦螨是防控DWV的關(guān)鍵。單一的防治手段，往往難以兩全生態(tài)效益以及經(jīng)濟(jì)效益，RNAi技術(shù)的應(yīng)用是防控蜜蜂病毒的很好補(bǔ)充，對(duì)資源昆蟲(chóng)的保護(hù)和生態(tài)環(huán)境安全有著十分重要的意義。相信未來(lái)病蟲(chóng)害的防治將是多種方式的結(jié)合，從而達(dá)到更加高效、安全的目的，未來(lái)的農(nóng)業(yè)也將向環(huán)境友好型不斷邁進(jìn)。