戴宗浩 ，彭夢(mèng)華，孫 毅 ，徐 黎 *

（1.公安部南昌警犬基地，江西南昌330100；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)）

鉤端螺旋體?。╨eptospirosis，簡稱鉤體?。┦怯芍虏⌒糟^端螺旋體所引起的一種人獸共患的自然疫源性傳染病。江西地區(qū)因其獨(dú)特的地理位置和氣候特點(diǎn)而成為我國鉤端螺旋體病的主要自然疫源地之一，導(dǎo)致該病在江西地區(qū)廣泛流行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生危害。隨著國家對(duì)疾控工作的重視和投入，2005年江西省在鉤體病高發(fā)地區(qū)設(shè)立了4個(gè)國家級(jí)鉤體病監(jiān)測(cè)點(diǎn)：上饒縣、上高縣、上猶縣及浮梁縣[1]，逐步了解了江西地區(qū)，尤其是以鼠及豬、水牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物為主要儲(chǔ)存宿主的廣大農(nóng)村疫源地鉤端螺旋體的流行病學(xué)特點(diǎn)，為鉤體病的防控提供了準(zhǔn)確依據(jù)，有效降低了鉤體病的發(fā)生和流行。近10年來，江西省鉤體病的發(fā)病率已經(jīng)處于較低水平。但是隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，城市伴侶犬飼養(yǎng)越來越來多，同時(shí)因監(jiān)管缺失，各個(gè)城市中的流浪犬也逐漸增多，以鼠、犬為主要儲(chǔ)存宿主的城市鉤體病疫源圈逐漸形成。當(dāng)人與犬直接或間接接觸時(shí)，就會(huì)增加人體暴露鉤體病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究的主要目的是明確江西省主要城區(qū)致病性鉤端螺旋體的流行規(guī)律及分子流行病學(xué)特征，為江西省全面防控鉤體病提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 樣本來源

本研究在江西省選擇南昌、宜春、贛州和上饒四個(gè)城市作為調(diào)研地。于2017年1月至2019年12月隨機(jī)在四個(gè)城市的街道及居民區(qū)布控鼠籠，共捕獲老鼠521只；在四個(gè)城市的流浪犬收容所隨機(jī)采集流浪犬血液樣本188份；在四個(gè)城市的犬籍登記處隨機(jī)采集寵物犬血液樣本254份。并做好樣本信息記錄工作。

1.2 主要儀器

GeneAmp PCR System 9700購自美國Applied Biosystems公司；電泳儀、水浴鍋購自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)為美國UVP EC3 Imaging System；臺(tái)式高速離心機(jī)購自美國Beckman公司；Nan-odrop 2000購自美國ThermoScientific公司。

1.3 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取收試劑盒、血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Ex Taq 2×PCR mix、DNA Marker DL 1000/500購自大連寶生物工程有限公司；EMJH培養(yǎng)基（成品）購自吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；鉤端螺旋體肉湯基礎(chǔ)EMJH購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司。

2 方法

2.1 樣本處理

活鼠樣本處理：解剖，摘取兩側(cè)腎臟，無菌操作剪取米粒大小腎臟組織一塊直接接種于3 mL EMJH培養(yǎng)基中培養(yǎng)；另取約一半的腎臟組織于1mLEP管中，用剪刀剪碎后加入1 mL EMJH培養(yǎng)基，吹打混勻使組織碎塊懸浮，靜置5～10min，取200μL上清液接種于3mLEMJH培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

犬血液樣本處理：無菌操作取血液2～3滴接種于3 mLEMJH培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

將上述培養(yǎng)管置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 樣本分離培養(yǎng)純化

2.2.1 樣本分離培養(yǎng)

每周取一次培養(yǎng)物制片（取5μL培養(yǎng)液置于載玻片上，蓋上蓋玻片），用暗視野顯微鏡觀察有無疑似鉤端螺旋體生長，如有，則接種于新鮮培養(yǎng)基中。如無生長，繼續(xù)培養(yǎng)觀察60d，仍無菌生長作為陰性處理。

2.2.2 培養(yǎng)物純化

將鏡檢有雜菌生長的疑似鉤體培養(yǎng)物采用生物過濾法[3]進(jìn)行純化培養(yǎng)，即將污染有雜菌的疑似鉤端螺旋體培養(yǎng)物1 mL接種于50～80g金黃地鼠腹腔內(nèi)，一般在1～2h內(nèi)以無菌操作采集心血2～3滴，接種到培養(yǎng)基中，再進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 PCR檢測(cè)

2.3.1 引物合成

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2]得到引物序列詳細(xì)信息見表1，將該引物序列于NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)引物特異性，將鉤端螺旋體基因引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

2.3.2 樣本DNA的提取

表1 引物名稱、序列及擴(kuò)增片段

參照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書步驟，提取樣本基因組DNA。并用Nanodrop 2000將提取得到的鉤體基因組DNA進(jìn)行定量。

2.3.3 PCR擴(kuò)增

采用25μL反應(yīng)體系（見表2）：

表2 25μL反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：第一個(gè)循環(huán)包括94℃3 min，63℃1.5 min，72℃2 min，接下來的29個(gè)循環(huán)包括94℃ 1 min，63℃ 1.5 min，72℃ 2 min，最后 72℃延伸10 min[2]。

反應(yīng)結(jié)束后，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在紫外燈下觀察，使用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 基因測(cè)序

對(duì)于純化的鉤體培養(yǎng)物，直接提取鉤體菌液DNA，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

對(duì)于PCR結(jié)果陽性，但污染嚴(yán)重，無法純化的培養(yǎng)物，通過基因克隆技術(shù)，將重組菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.5 mLST基因分型

mLST七個(gè)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增、測(cè)序參考文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)LST方案[4]，利用 7 個(gè)位點(diǎn) pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各位點(diǎn)信息見表3，引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表3 mLST研究中7個(gè)位點(diǎn)信息

利用 25μL反應(yīng)體系：Premix Ex Taq12.5μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1μL，DNA 模板 2μL，ddH2O補(bǔ)充8.5μL至25μL反應(yīng)體積。

PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1min，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化、雙向測(cè)序，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

將每株菌株測(cè)序的上下引物序列用DNASTAR軟件中的SeqMan軟件進(jìn)行拼接，然后用BioEdit軟件進(jìn)行序列分析，再將7個(gè)位點(diǎn)序列與mLST(網(wǎng)站http：//pubmLst.org/)上相應(yīng)等位基因進(jìn)行比較，即可獲得每株菌等位基因譜（glmu-pnta-suca-tpia-pfkb-mrea-caib）以及 STs(Sequence Types)型別，再通過數(shù)據(jù)庫查詢可得鉤體的血清群血清型。

3 結(jié)果

3.1 樣本的分離純化結(jié)果

通過對(duì)963份樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)及純化，共培養(yǎng)45份陽性培養(yǎng)物，最終純化出21株菌株，有24株未能純化。

3.2 特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果

用鉤端螺旋體的特異性引物對(duì)純培養(yǎng)分離菌株和基因克隆的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能得到331bp的特異性條帶（見圖1）。

3.3 基因種鑒定結(jié)果

圖1 特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果

將21株純培養(yǎng)分離菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和24份基因克隆菌液送去生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，并將測(cè)序的結(jié)果通過NCBI的BLAST序列比對(duì)。經(jīng)核苷酸序列測(cè)定分析證實(shí)上述序列與鉤端螺旋體菌FDAARGOS_203基因序列(GenBank登錄號(hào)：CP020414.2)同源性為100%，證明所分離到的菌是問號(hào)鉤端螺旋體。

3.4 城市鉤體病流行病學(xué)分析

3.4.1 樣本鉤體陽性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

963份樣本，鉤體陽性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4：

表4 樣本PCR檢測(cè)結(jié)果

3.4.2 城市犬鉤體感染率與季節(jié)分布

城市犬鉤體感染率與季節(jié)分布關(guān)系見表5：

表5 犬鉤體感染率與季節(jié)分布

3.4.3 城市鼠帶菌率與地區(qū)分布

鼠帶菌率與地區(qū)分布關(guān)系見表6：

表6 鼠帶菌率與地區(qū)分布

3.5 mLST鑒定

mLST研究結(jié)果顯示：21株致病性鉤端螺旋體呈現(xiàn)同一個(gè)ST型別：93，屬于鉤端螺旋體澳洲群澳洲型（australis），結(jié)果如表 7：

表7 mLST結(jié)果

4 討論

鉤端螺旋體病是一種重要的人畜共患自然疫源性疾病，也是國家規(guī)定的乙類傳染病，具有重要的公共衛(wèi)生意義。江西地區(qū)是鉤體病的老疫區(qū)，早年的發(fā)病率常年居全國前列。隨著國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和對(duì)人民健康水平的重視，江西省基本完善了對(duì)廣大農(nóng)村疫源地的流調(diào)工作，建立健全了鉤體病的監(jiān)測(cè)及防控機(jī)制，有效控制了該病的發(fā)生和流行。但是，隨著城市養(yǎng)犬熱的興起，以鼠和犬為主要儲(chǔ)存宿主的城市鉤體病疫源圈逐漸形成，但針對(duì)城市鉤端螺旋體病的流調(diào)研究卻鮮見報(bào)道。而對(duì)城市鉤體病的監(jiān)測(cè)缺失，一定程度上會(huì)影響鉤體病的防控全局，造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生隱患。

本研究從江西省選擇四個(gè)地理位置具有代表性的城市（南昌、宜春、上饒和贛州）作為調(diào)研地，調(diào)查江西省城市鉤端螺旋體流行病學(xué)特點(diǎn)。四個(gè)城市的鼠腎平均鉤體分離率為5.95%，四個(gè)城市的鼠腎鉤體分離率無顯著差異，并且高于張翠彩等2019年報(bào)道的江西省鼠類動(dòng)物鉤端螺旋體的分離率4.56%[1]。流浪犬和寵物犬的血液鉤體陽性率分別達(dá)到4.79%和1.97%，顯著高于婁銀瑩等報(bào)道的2017-2019北京地區(qū)犬鉤端螺旋體分子流行率1.06%，尤其是流浪犬的鉤體帶菌率[5]。這個(gè)數(shù)據(jù)說明，江西地區(qū)以鼠和犬為主要儲(chǔ)存宿主的城市鉤端螺旋體疫源圈已然形成，同時(shí)由于犬與人類的關(guān)系比豬和牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物更加親密，更加加大了鉤端螺旋體從動(dòng)物感染人的風(fēng)險(xiǎn)，存在嚴(yán)重公共衛(wèi)生隱患。

通過本次調(diào)研發(fā)現(xiàn)，江西地區(qū)城市犬只冬季的陽性感染率顯著高于其他季節(jié)，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道的鉤體病季節(jié)性分布不一致。我國人鉤體病的流行高峰在夏季的7、8月及初秋的9月左右[3]；徐建民等2010年報(bào)道江西省人鉤體病有明顯的季節(jié)性分布，7～8 月為高峰[6]；婁銀瑩等報(bào)道的 2017～2019 年北京地區(qū)犬鉤端螺旋體感染率秋季（9～11月）最高[5]。江西省城市犬只鉤體季節(jié)性分布與文獻(xiàn)報(bào)道不一致的主要原因可能是由于人和犬感染鉤端螺旋體的途徑不同以及鼠源疫源分布的變化導(dǎo)致的。根據(jù)徐建民等研究分析，江西省人感染鉤體病的途徑主要是接觸疫水，因此人鉤體病的發(fā)生主要集中在7～8月夏季農(nóng)忙時(shí)節(jié)。而城市犬感染鉤體的主要途徑是接觸帶菌老鼠污染的水源或飼料。冬季老鼠戶外食源減少，對(duì)室內(nèi)食物的污染相應(yīng)增多，因此犬接觸污染食物的幾率也相應(yīng)增加。

本研究共分離鉤端螺旋體純化菌株21株，經(jīng)mLST基因分型，21株鉤體全部都是同一個(gè)ST型別：93，屬于澳洲群澳洲型。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，徐建民等對(duì)2002～2008年江西監(jiān)測(cè)菌株研究發(fā)現(xiàn)：黃疸出血群賴型、澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型是江西省人群及宿主動(dòng)物中的優(yōu)勢(shì)型別[7]；張翠彩等報(bào)道黃疸出血群和ST1型別為2016～2018年江西鼠類的優(yōu)勢(shì)型別，并且血清群和ST型別分布在江西省地域差異明顯[1]。婁銀瑩等通過對(duì)2017～2019年北京地區(qū)犬鉤端螺旋體病的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)澳洲群和拜倫群是北京地區(qū)犬鉤端螺旋體病的優(yōu)勢(shì)菌群[5]；本次研究發(fā)現(xiàn)江西省城市中以鼠和犬為主要宿主的鉤端螺旋體優(yōu)勢(shì)菌群為澳洲群澳洲型，與北京城區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌群一致，但與江西省農(nóng)村疫源地的流行菌群不一致，其主要原因有3點(diǎn)：（1）疫源地環(huán)境不同。城市環(huán)境和農(nóng)村環(huán)境存在根本不同，城市環(huán)境相對(duì)比較容易控制；（2）儲(chǔ)存宿主不同。城市鉤體病的儲(chǔ)存宿主相對(duì)單一，主要是鼠和犬。而農(nóng)村疫源地儲(chǔ)存宿主較復(fù)雜，以鼠、豬、水牛等為主；（3）人為干預(yù)程度不同。城市中大多數(shù)寵物犬都會(huì)接種鉤體疫苗，而目前市售鉤體疫苗主要就是預(yù)防黃疸出血型和犬型鉤端螺旋體病。一定程度上抑制了出血黃疸型鉤端螺旋體病在城市中流行。