陳飛虎 ，張夢娟 ，周亞南 ，高 蕊，區(qū)海蘊，劉雨星，王笑焓，朱芝秀

(江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，江西南昌330045)

巴氏桿菌是一種兩端鈍圓，中間稍微向外凸出的G-短桿菌[1]，是造成巴氏桿菌病的病原菌，病料瑞氏染色特征為兩極濃染[2]。臨床上，巴氏桿菌病是一種表現(xiàn)為畜禽急性、敗血性的一類疾病[3]，牛雞鴨豬兔等均有可能感染該傳染病[4]，鴨場中易群發(fā)該病，發(fā)病傳染急而迅速，并且病鴨短時間死亡[5～6]，對養(yǎng)禽場造成嚴重損害。2019年4～6月間，南昌某番鴨養(yǎng)殖場爆發(fā)疑似巴氏桿菌病例，本試驗通過對疑似病例進行病理解剖及細菌分離培養(yǎng)鑒定等操作，為對番鴨巴氏桿菌的防治提供良好建議與適當方法。

1 材料

1.1 實驗動物

病料：某養(yǎng)殖場病死成年番鴨；試驗小白鼠：18～22g，南昌大學實驗動物室購買。

1.2 實驗儀器及藥品

電子數(shù)顯微游標卡尺（購自上海美耐特旗艦店）；PCR儀（購于Bio-Rad公司）；牛津杯（購自上海申源科學儀器有限公司）；微量生化管及藥敏試紙（購自杭州天和微生物有限公司）。

2 方法

2.1 細菌分離鑒定

2.1.1 病理檢查

臨床解剖：觀察氣管環(huán)、喉頭、肺、心肌及心內外膜、心冠脂肪、腸黏膜等組織出血狀況；觀察肝臟病變情況；截取心臟、肝臟病變部位進行瑞氏染色鏡檢。

2.1.2 細菌分離培養(yǎng)

無菌操作取死亡鴨心、肝器官，勾取病變部位劃線接種5%兔血平板，37℃溫箱靜置24h，觀察血平板優(yōu)勢菌落形態(tài)、溶血狀況等；接種環(huán)無菌操作挑取單個典型菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)；挑取鏡檢菌落再次劃線接種5%兔血平板進行純培養(yǎng)，分離菌命名為：Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2。

2.1.3 分離菌生化反應實驗

勾取 Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2，分別接種微量生化反應管，同時在微量生化反應管中滴加無菌血清1～2滴，37℃下靜置1～2d，觀察生化反應管反應情況，對照生化反應說明書分析并記錄結果。

2.1.4 分離菌分子生物學鑒定

根據(jù)細菌16srDNA通用引物[7]，用細菌常規(guī)擴增法對分離菌進行PCR擴增[8]。由湖南擎科生物科技有限公司測序，進入Blast系統(tǒng)進行16srDNA同源性分析，利用DNAStar軟件構建16srRNA系統(tǒng)進化樹。

2.2 分離菌體外抑菌

2.2.1 藥敏試驗

無菌條件下，均勻涂布 Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2發(fā)酵液于血清平板，用眼科鑷夾取藥敏紙片輕貼血清平板表面，記錄藥敏紙片藥物名稱及放置順序，37℃靜置24h，觀察抑菌情況，游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

2.2.2 乳酸菌對分離菌體外抑制試驗

將分離菌發(fā)酵液均勻涂布血清平板，其上對稱放置2個牛津杯，把雞唾液乳桿菌、豬小腸乳桿菌發(fā)酵液依次緩慢注入牛津杯內，3 7℃靜置24h，觀察抑菌現(xiàn)象并測量抑菌圈的直徑。

2.3 動物致病性試驗

將購買的試驗小白鼠適應環(huán)境一周后隨機分為5組。試驗組分別腹腔注射Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2發(fā)酵液（0.1mL/只），對照組同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察試驗小白鼠的發(fā)病情況，對具有典型癥狀的死亡小白鼠進行細菌分離培養(yǎng)。

3 結果

3.1 臨床檢查結果

氣管環(huán)出血（圖1），心冠脂肪出血（圖2），肝臟針尖狀壞死（圖3）。取肝臟瑞氏染色境檢，表現(xiàn)為典型的兩極著色（圖4）。

3.2 病原菌分離培養(yǎng)結果

Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2 在 5%兔血平板上呈水滴樣，半透明，不溶血（圖5），經(jīng)G染色鏡檢可見G-短桿菌（圖6）。

圖1 氣管環(huán)出血

圖2 心冠脂肪出血

圖3 肝臟針尖狀壞死

圖5 分離菌血平板菌落

圖6革蘭氏染色結果

圖4瑞氏染色結果

3.3 分離菌生化試驗結果

由 表 2 可 知 ：Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2可分解葡萄糖等，其中Y-X-2分解麥芽糖等產(chǎn)酸產(chǎn)氣，另外3株分離菌不產(chǎn)氣只產(chǎn)酸，乳糖不分解。

表2 分離菌生理生化特性

3.4 分離菌分子生物學鑒定結果

電泳結果如圖7所示，目的條帶在約1800pb處出現(xiàn)。擴增后的序列與多殺性巴氏桿菌同源性高至 99%（圖 8），Y-G-1與 MG597107.1菌株，Y-X-1與KX579748.1菌株的親緣關系最近，進化樹上處于同一分支（圖9）。

圖7 分離菌電泳結果

3.5 分離菌藥敏試驗結果

由表3可知，分離菌對頭孢曲松等抗生素敏感，對克林霉素等耐藥

3.6 乳酸菌對分離菌體外抑制試驗結果

圖8 分離菌16S rDNA同源性分析

圖9 分離菌16S rRNA序列進化樹

表3 藥敏試驗結果 mm

見表4可知，兩種不同源乳酸菌對分離菌均產(chǎn)生了抑制作用，顯然雞唾液乳桿菌對分離菌的抑制作用更明顯。

表4 乳酸菌抑菌實驗結果 mm

3.7 動物致病性結果

試驗組小白鼠均死于攻毒后的12h之內，對照組生理狀態(tài)正常。從解剖死亡小鼠臟器中分離到形態(tài)一致的細菌，染色鏡檢結果與原分離菌一致。

4 討論

根據(jù)病理剖檢、分離菌培養(yǎng)特性、生化試驗等結果，對比《伯杰氏細菌分離鑒定手冊》[9]，可初診分離菌為巴氏桿菌；依據(jù)上述分子生物學鑒定結果，分離菌確診為多殺性巴氏桿菌。

分離菌生化反應結果與劉燕發(fā)表的試驗結果大致相同[10]，只有個別糖酵解試驗不同，可能與菌株、地域差異有關。分離菌藥敏試驗結果，對阿莫西林等高敏，與劉杰等發(fā)表的論文結果不同，可能是用藥習慣、菌株與地域不同造成[11]。

體外抑菌試驗結果，乳酸菌對巴氏桿菌有較強的抑制作用，與邊彥超等發(fā)表的文章一致[12～13]。乳酸菌與高敏藥物配合使用，可以緩解抗生素泛濫所導致的耐藥性問題。動物致病性試驗結果，試驗小白鼠均于12h內死亡，分離菌有較強的毒力，可能與菌株的莢膜有關[14]。

我國作為農(nóng)業(yè)大國，畜牧業(yè)快速發(fā)展，集約化規(guī)模養(yǎng)殖也越來越普遍，禽類巴氏桿菌病作為一類高發(fā)接觸性傳染病更得受到重視。畜牧場應當建立合理的飼養(yǎng)標準，做好防治，保持空氣流通，環(huán)境衛(wèi)生等條件，同時做好免疫預防。一旦發(fā)現(xiàn)發(fā)病禽類個體，應當立即隔離，嚴格消毒污染場所，以防更大范圍的感染，用藥方面應當追求合理配藥，防止濫用。