劉佼佼，王學(xué)敏，馬琳，崔苗苗，曹曉宇，趙威

紫花苜蓿的分離、鑒定及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

劉佼佼1，王學(xué)敏2，馬琳2，崔苗苗2，曹曉宇2，趙威1

（1河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/牡丹學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

【】WRKY是轉(zhuǎn)錄因子大家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄因子MsWRKY42在紫花苜?？鼓婢尺^(guò)程中的作用，為進(jìn)一步研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子在紫花苜?？鼓娣肿诱{(diào)控中的作用奠定基礎(chǔ)。通過(guò)同源比對(duì)方法從紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得序列。使用MEGA-X對(duì)MsWRKY42蛋白序列及擬南芥序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)PlantCARE預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子的順式作用元件。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析在紫花苜蓿不同組織中的表達(dá)量及其在NaCl（0.3 mol·L-1）、PEG（15%）、4℃、40℃、低磷以及ABA（0.1×10-3mol·L-1）處理后的表達(dá)量變化。構(gòu)建pCAMBIA1300-融合表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化本氏煙草（），確定MsWRKY42蛋白的亞細(xì)胞定位。利用酵母單雜交系統(tǒng)檢測(cè)MsWRKY42和啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件W-box的體外結(jié)合活性。該基因包含1個(gè)1 692 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼563個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，該蛋白屬于Ⅱb類(lèi)WRKY家族成員，含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指基序，與擬南芥WRKY家族中的相似度最高，故將其命名為。在紫花苜蓿啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到多個(gè)順式作用元件，主要包括脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育等不同生命活動(dòng)相關(guān)的調(diào)控作用元件。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在紫花苜蓿各組織中均有不同程度的表達(dá)，其中根、葉中的表達(dá)量最高，莖、花、莢果中次之，芽中最低。經(jīng)NaCl、PEG、低溫、高溫、低磷和ABA處理后的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，MsWRKY42蛋白定位在細(xì)胞核上。酵母單雜交系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示，MsWRKY42能夠與W-box順式作用元件特異性結(jié)合。MsWRKY42為典型的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞核，能夠與W-box順式作用元件特異性結(jié)合；該基因在紫花苜蓿不同組織部位中均有表達(dá)，在根和葉中的表達(dá)量最高，且表達(dá)受NaCl、PEG、低溫、高溫脅迫和ABA激素的正向誘導(dǎo)。在紫花苜蓿中，該基因可能參與多種非生物脅迫反應(yīng)。

紫花苜蓿；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；非生物脅迫；亞細(xì)胞定位；結(jié)合活性分析

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（L.）是多年生豆科牧草，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、分布范圍廣，是中國(guó)北方干旱和半干旱地區(qū)促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的關(guān)鍵草種之一[1]。隨著生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)都面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)，苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展受到遏制。發(fā)掘紫花苜蓿重要抗逆基因資源，了解其抗逆調(diào)控機(jī)制，對(duì)于指導(dǎo)苜蓿抗逆遺傳育種和生產(chǎn)實(shí)際具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不斷適應(yīng)環(huán)境變化，已經(jīng)形成了一套復(fù)雜高效的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)錄因子在其中起核心調(diào)控作用[2]。WRKY作為植物中十大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因其N(xiāo)端含有保守的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域而得名，其C末端包含獨(dú)特的鋅指基序——C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H- X-H）或C2HC（C-X5-8-C-X25-28-H-X1-2-C）。一般情況下，根據(jù)N端結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和C端鋅指基序的特征將WRKY家族分為三類(lèi)：第一類(lèi)（Ⅰ）有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域；第二類(lèi)（Ⅱ）有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，在此基礎(chǔ)上根據(jù)其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分為5個(gè)亞類(lèi)（Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe）；第三類(lèi)（Ⅲ）有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)域。WRKY蛋白能夠與靶基因啟動(dòng)子中的順式作用元件W-box（TTGACC/T）發(fā)生特異性結(jié)合，從而調(diào)控目的基因的表達(dá)，進(jìn)而廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育代謝以及各種生物、非生物脅迫（干旱脅迫、高鹽脅迫、溫度脅迫和營(yíng)養(yǎng)脅迫）響應(yīng)過(guò)程，被稱(chēng)為非生物脅迫響應(yīng)的“中心調(diào)控因子”[3-5]。擬南芥（）中有眾多WRKY轉(zhuǎn)錄因子都和植物耐旱或耐鹽性相關(guān)[6]。其中，通過(guò)調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與氣孔關(guān)閉以保持水分[7]；直接與逆境誘導(dǎo)型基因和啟動(dòng)子中的W-box結(jié)合，提高擬南芥的耐旱和耐鹽性[8]。玉米（L.）中的可在干旱和高鹽條件下被誘導(dǎo)，并且過(guò)表達(dá)可以激活等多個(gè)基因，從而增強(qiáng)植物對(duì)干旱和高鹽脅迫的耐受性[9]。YANG等[10]研究表明核桃（）和通過(guò)脫落酸（abscisic acid，ABA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑提高植物對(duì)鹽、滲透等的耐受性。溫度環(huán)境是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的另一重要因素。Zou等[11]研究發(fā)現(xiàn)，低溫敏感性植物的成熟花粉對(duì)冷脅迫刺激的敏感度非常高，花粉中特異性表達(dá)的能負(fù)調(diào)控低溫應(yīng)答途徑。油菜（）中的能激活A(yù)BA信號(hào)途徑中的相關(guān)基因提高植物的耐低溫能力[12]。在熱激蛋白HSP101啟動(dòng)子的控制下，過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻（L.）幼苗的耐熱性[13]。擬南芥的是首個(gè)被報(bào)道的參與調(diào)節(jié)低磷脅迫的WRKY家族成員。在沉默株系中，磷饑餓相關(guān)基因（如磷酸酶、和高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的表達(dá)降低[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)AtWRKY42和AtWRKY6可與AtPHO1（AtPHOSPHATE1）結(jié)合，通過(guò)抑制的表達(dá)能夠負(fù)調(diào)控磷從地下部分向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]；同時(shí)，磷的缺乏誘導(dǎo)26S蛋白酶體降解AtWRKY6和AtWRKY42轉(zhuǎn)錄因子[16]。低磷條件下，與野生型相比，過(guò)表達(dá)的水稻植株低磷耐受性增強(qiáng)，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)磷穩(wěn)態(tài)與磷饑餓之間的潛在串?dāng)_[17]。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于WRKY家族的研究多集中在一些模式植物中，在牧草中鮮有報(bào)道。紫花苜蓿作為牧草中的典型代表，WRKY蛋白在紫花苜蓿中的分子機(jī)理尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究從紫花苜蓿中成功克隆WRKY基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并研究在不同組織中和非生物逆境脅迫下的表達(dá)模式，同時(shí)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析、構(gòu)建超表達(dá)植物表達(dá)載體，為深入研究的功能和抗逆調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為紫花苜?？鼓嬗N篩選優(yōu)良的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為紫花苜蓿中苜一號(hào)（L.，Zhongmu No.1）品種，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所保存。PROMEGA總RNA提取試劑盒，購(gòu)自普洛麥格公司，TransScript Green One-Step qRT-PCR SuperMix、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、DH5α Chemically Competent Cell、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、DNA凝膠試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)所用的內(nèi)切酶、連接酶均購(gòu)自NEB（北京）有限公司。

1.2 紫花苜蓿MsWRKY42的克隆

使用Eastep? Super Total RNA Extraction Kit試劑盒（Promega）提取紫花苜蓿葉片總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。利用TransScript Green One-Step qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。

根據(jù)已公開(kāi)的擬南芥的cDNA序列，在紫花苜蓿二倍體水平CADL比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// www.alfalfatoolbox.org/doblast/Home.gy?filterword=DOBLAST&function=function0）中進(jìn)行比對(duì)，參考相似度最高的序列設(shè)計(jì)特異引物（電子附表1），以紫花苜蓿cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、KOD-plus 1 μL、10×Buffer for KOD 5 μL、25 mmol·L-1MgSO42 μL、2 mmol·L-1dNTPs 5 μL、引物各1.5 μL和PCR grade water 32 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃30 s，68℃2 min，34個(gè)循環(huán)；68℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化后，連入Peasy-T1-Blunt載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 MsWRKY42的序列分析

利用SnapGene軟件分析開(kāi)放閱讀框及其氨基酸序列；通過(guò)Protparam（https://web.expasy. org/protparam/）分析的理化性質(zhì)；利用在線程序PSORT II Prediction（https://psort.hgc.jp/form2. html）對(duì)MsWRKY42蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用SOPMA（http://www.sopma.org/）在線預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用在線軟件SWISS-model（https:// swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

使用ClustalX軟件與其他物種的同源基因進(jìn)行多序列比對(duì)；將與擬南芥WRKY基因家族多序列比對(duì)后，用MEGA-X軟件選擇最大似然法（ML）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)定為500，通過(guò)Bootstrap對(duì)生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行校正；利用PlantCARE（http://www.plantcarescience.com/）預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子。

1.4 MsWRKY42組織特異性表達(dá)分析

分別提取中苜1號(hào)根、莖、葉、芽、花和莢果的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。根據(jù)得到的序列設(shè)計(jì)特異引物Q42F/R（電子附表1），以紫花苜蓿為內(nèi)參基因，利用ABI7500 Real-Time PCR system（美國(guó)ABI公司），依照TaKaRa SYBY Premix Ex Taq說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3次生物學(xué)重復(fù)，2次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCT方法[18]計(jì)算的表達(dá)量。

1.5 不同處理下MsWRKY42的表達(dá)分析

中苜一號(hào)種子經(jīng)氯氣消毒，平鋪在有濾紙的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌水將濾紙浸濕，在光照培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗）中培養(yǎng)至種子露白，發(fā)芽后的種子移至1/2 MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4周后，分別移入0.3 mol·L-1NaCl、15% PEG、4℃、40℃、缺磷和0.1×10-3mol·L-1ABA處理的環(huán)境中，分別在0、2、4、6、8、12、24和48 h取樣，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)樣品取樣完成，液氮速凍，-80℃保存。

1.6 MsWRKY42的亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)亞細(xì)胞定位引物GFP-MsWRKY42F/R（電子附表1），在目的基因ORF兩端（去掉終止密碼子）加入酶切位點(diǎn)HⅠ和Ⅰ，以測(cè)序成功的陽(yáng)性質(zhì)粒T-blunt-為模板進(jìn)行擴(kuò)增、回收。用HⅠ和Ⅰ雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA1300-，產(chǎn)物純化。用連接酶將目的基因片段連接載體pCAMBIA1300-，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR及測(cè)序驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-。將重組質(zhì)粒和對(duì)照空載質(zhì)粒pCAMBIA1300-分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株中，把菌液PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的單克隆菌落于含有35 μg·mL-1利福平和50 μg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在28℃搖床以250 r/min培養(yǎng)14 h；收集、重懸菌體，調(diào)整菌體濃度使其OD600在0.5—1.0，靜置3 h后選擇5—7片長(zhǎng)勢(shì)一致的本氏煙草葉片（帶有RFP標(biāo)簽的核定位蛋白的煙草），用去掉針頭的注射器注射含有目的基因載體和空載體的菌液。注射后的煙草置于28℃溫室中培養(yǎng)2 d，光照周期為16 h/8 h（光照/黑暗）。用LEICA TCS SP8共聚焦顯微鏡觀察侵染的葉片，確定蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.7 MsWRKY42結(jié)合活性分析

根據(jù)W-box的序列（C/T）TGAC（C/T）設(shè)計(jì)能合成3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的W-box引物，在設(shè)計(jì)引物的同時(shí)加上RⅠ/Ⅰ酶切位點(diǎn)（電子附表1），連接酵母載體pHISi，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHISi-W- box。測(cè)序驗(yàn)證正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母YM4271，挑取陽(yáng)性克隆，搖菌后制作感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)菌液均勻涂于加有不同濃度 3-AT的SD/-His單缺陷平板上，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況，篩選出3-AT濃度以消除pHISi-W-box引起的HIS的本底表達(dá)。根據(jù)的ORF序列（去掉終止密碼子）設(shè)計(jì)帶有HⅠ和Ⅰ雙酶切位點(diǎn)的上下游引物PMsWRKY42F/R（電子附表1）。以含有CDS片段的T載體質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含有酶切位點(diǎn)的目的片段并回收，連接酵母表達(dá)載體pGADT7，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGADT7-，測(cè)序驗(yàn)證正確后將pGADT7-、pHISi-W-box質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母YM4271菌株中，挑取單克隆，搖菌后稀釋成不同濃度，點(diǎn)涂在3-AT固體缺陷培養(yǎng)基SD/-His-Leu-ura上，同時(shí)分別將pHISi+pGADT7-42、pGADT7+pHISi、pGADT7+pHISi-W-box作為對(duì)照，觀察轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 MsWRKY42的克隆

以紫花苜?？俁NA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，MsWRKY42F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得反應(yīng)產(chǎn)物。該產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，條帶明亮單一，大小與基因組測(cè)序結(jié)果一致（圖1），初步判定獲得目的條帶。

將PCR產(chǎn)物純化回收后，連接至Peasy-T1-Blunt載體上，再轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，挑取單菌落檢驗(yàn)。菌液PCR結(jié)果顯示，所選菌液能夠擴(kuò)增出與目的片段大小一致的DNA片段。將上述菌液送至生物公司測(cè)序，結(jié)果顯示與參考序列一致，表明克隆成功。

M：Trans2K Plus II DNA分子標(biāo)記；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 MsWRKY42的序列分析

利用SnapGene軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，該基因片段包含一個(gè)1 692 bp的開(kāi)放閱讀框，共編碼563個(gè)氨基酸。該序列編碼的蛋白理論等電點(diǎn)為7.70，相對(duì)分子量60.74 kD，不穩(wěn)定系數(shù)為42.49，屬于不穩(wěn)定蛋白，該蛋白平均親水系數(shù)為-0.668，為親水性蛋白。利用在線程序PSORT II Prediction對(duì)MsWRKY42蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白位于細(xì)胞核上的可能性最高，為56.15%。

利用DNAMAN軟件將與其他物種氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列含有WRKY家族典型的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域，同時(shí)含有1個(gè)C2H2鋅指基序（圖2）。氨基酸序列與豆科植物的相似度很高，其中，與蒺藜苜蓿的相似度為96.27%。與擬南芥WRKY基因家族多序列比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），參考擬南芥分組方法，MsWRKY42轉(zhuǎn)錄因子屬于Ⅱb組。

對(duì)MsWRKY42蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖4），該蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件中，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高，為63.94%。α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角所占比例依次為22.91%和10.83%，沒(méi)有β-折疊。通過(guò)在線程序SWISS-model對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模擬預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖5），MsWRKY42蛋白與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// www.rcsb.org/）WRKY蛋白晶體結(jié)構(gòu)模型中的2AYD（AtWRKY1）序列同一性最高。MsWRKY42蛋白由5條反平行β鏈組成，其中一條β鏈末端為鋅結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 MsWRKY42啟動(dòng)子分析

通過(guò)PlantCARE啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件分析啟動(dòng)子（表1）。結(jié)果顯示，該基因啟動(dòng)子包含許多順式作用元件，其中有參與逆境脅迫、參與ABA以及MeJA反應(yīng)的元件，也存在光響應(yīng)、晝夜節(jié)律響應(yīng)等元件。暗示可能受干旱、高溫等與水分脅迫相關(guān)的逆境誘導(dǎo)。

2.4 MsWRKY42蛋白的定位

通過(guò)進(jìn)行亞細(xì)胞定位（圖6），在注射空載體pCAMBIA1300-的對(duì)照組中，綠色熒光在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有分布，而注射融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-的細(xì)胞中，僅在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)有綠色熒光，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均無(wú)熒光，且綠色熒光與核定位的marker蛋白的紅色熒光完全重合。說(shuō)明MsWRKY42蛋白定位且只定位在細(xì)胞核上，這一結(jié)果與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.5 MsWRKY42組織特異性表達(dá)分析

采用qRT-PCR技術(shù)分析在紫花苜蓿各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果（圖7）表明，在紫花苜蓿在各個(gè)組織中均有不同程度表達(dá)。其中在根、葉中的表達(dá)豐度較高，莖、花、莢果中次之，在芽中表達(dá)豐度最低。

MsWRKY42；紫花苜蓿Medicago sativa；AtWRKY42：擬南芥Arabidopsis thaliana，NP_001328851.1；MtWRKY：蒺藜苜蓿Medicago truntula，XP_013462871.1；CaWRKY31：鷹嘴豆Cicer arietinum，XP_004486177.1；SsWRKY6：密花豆Spatholobus suberectus，TKY72179.1；GmWRKY42：大豆Glycine max，AJB84600.1；GhWRKY42：陸地棉Gossypium hirsutum，AIE43854.1。下同The same as below。方框表示W(wǎng)RKY結(jié)構(gòu)域。三角表示C2H2基序The WRKY domain are represented in the boxes. The C2H2 motif are represented on the triangle

紅色線條表示延伸鏈；紫色線條表示無(wú)規(guī)則卷曲；藍(lán)色線條表示α-螺旋

圖5 MsWRKY42蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

表1 PlantCARE 啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果

圖片采用綠色熒光、明場(chǎng)、綠色熒光和明場(chǎng)疊加3個(gè)視野拍攝。35S::GFP：攜帶空載pCAMBIA1300-GFP的農(nóng)桿菌菌株。35S::MsWRKY42::GFP：攜帶重組載體pCAMBIA1300-MsWRKY42-GFP的農(nóng)桿菌菌株。比例尺=25 μm

不同字母表示在P＜0.05水平差異顯著。下同

2.6 MsWRKY42受多種逆境脅迫誘導(dǎo)

通過(guò)對(duì)材料進(jìn)行非生物脅迫研究（圖8），在300 mmol·L-1NaCl處理下，在2 h和6 h出現(xiàn)峰值，在6 h之后逐漸降低，但處理48 h后表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照（0 h）；用15%的PEG模擬干旱脅迫，的表達(dá)量在2 h內(nèi)迅速上調(diào)，隨后下降，在12和48 h時(shí)表達(dá)量與對(duì)照差異不顯著；4℃低溫處理下，表達(dá)量在2 h時(shí)被快速誘導(dǎo)，在4 h急劇下降，隨后又逐漸上升；40℃高溫處理下，表達(dá)量整體趨勢(shì)是升高的，且到處理的48 h時(shí)仍保持上升趨勢(shì)；缺磷處理下，在4 h時(shí)的表達(dá)量最高，為對(duì)照表達(dá)量的6.2倍，隨后表達(dá)逐漸降低；0.1×10-3mol·L-1ABA處理下，表達(dá)量在2 h時(shí)劇增，隨后表達(dá)豐度下降，整個(gè)處理過(guò)程中表達(dá)量始終顯著高于對(duì)照。

2.7 MsWRKY42蛋白結(jié)合活性分析

為了明確MsWRKY42蛋白與W-box的結(jié)合活性，對(duì)其進(jìn)行了體外結(jié)合活性分析。結(jié)果顯示，抑制酵母報(bào)告載體pHISi和pHISi-W-box本底表達(dá)的3-AT濃度為150 mmol·L-1（圖9-A）。將不同的酵母轉(zhuǎn)化子點(diǎn)涂在含有150 mmol·L-13-AT的培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示，只有pGADT7-42+pHISi-W-box的酵母轉(zhuǎn)化子能夠生長(zhǎng)，其他對(duì)照均沒(méi)有生長(zhǎng)（圖9-B）。說(shuō)明報(bào)告基因HIS在MsWRKY42的酵母中表達(dá)，證明MsWRKY42能夠與W-box順式作用元件特異性結(jié)合。

圖8 不同脅迫下MsWRKY42的表達(dá)模式

A：3-AT濃度的篩選；B：稀釋不同倍數(shù)的4種酵母轉(zhuǎn)化子在SD/-His-Leu-ura培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)

3 討論

3.1 MsWRKY42蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

本研究從紫花苜蓿中克隆得到的cDNA序列，該基因編碼的蛋白可能為不穩(wěn)定蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)結(jié)果表明屬于WRKY家族Ⅱb亞類(lèi)（圖3），該分支多個(gè)基因已證實(shí)與植物的非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)，例如與、互作關(guān)聯(lián)，對(duì)干旱、冷、ABA等多種非生物逆境應(yīng)答相關(guān)[19]；能夠通過(guò)ABA轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與菊花（）對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)過(guò)程[20]。因此，推測(cè)也可能參與了紫花苜蓿的非生物脅迫響應(yīng)。本研究對(duì)MsWRKY42蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白是由5條反平行β鏈和鋅結(jié)合位點(diǎn)組成的球狀結(jié)構(gòu)，與AtWRKY1蛋白結(jié)構(gòu)相似（圖5）。Duan等[21]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力是由β2鏈與β3鏈之間的β折疊區(qū)域決定的，推測(cè)具有與相似的與DNA的結(jié)合方式。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示MsWRKY42蛋白定位在細(xì)胞核上，這與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相同，同時(shí)與擬南芥[16]報(bào)道相同，也與其作為轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能一致。

W-box大多存在于植物WRKY基因的啟動(dòng)子中，尤其是與脅迫相關(guān)的WRKY基因，其中，W-box的數(shù)量、排列方式等對(duì)結(jié)合活性都有很大影響。WRKY家族與順式作用元件W-box的結(jié)合已有許多研究，AtWRKY57[8]、AtWRKY6[22]等轉(zhuǎn)錄因子均與W-box特異性結(jié)合，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，本研究中與W-box能夠特異性結(jié)合，這些結(jié)果不僅表明W-box在WRKY轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮其生物學(xué)功能中起重要且廣泛的作用，而且，推測(cè)與擬南芥中的、存在相似的調(diào)控模式。

3.2 非生物脅迫對(duì)MsWRKY42的影響

通過(guò)PlantCARE在線網(wǎng)站對(duì)啟動(dòng)子內(nèi)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，包括2個(gè)脅迫響應(yīng)元件ARE、5個(gè)脫落酸（ABA）響應(yīng)元件ABRE、2個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif和2個(gè)CGTCA-motif，因此，推測(cè)可能通過(guò)ABA信號(hào)途徑參與多種脅迫反應(yīng)。基于此，研究對(duì)多種逆境下基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。

PEG是一種高分子滲透劑，能使植物細(xì)胞和組織處于類(lèi)似于干旱脅迫的狀態(tài)中[23]。WRKY 家族基因可通過(guò)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑行使功能[24]。擬南芥中、和三者能夠協(xié)同互作，與ABA信號(hào)途徑基因和啟動(dòng)子中的W-box結(jié)合，單獨(dú)或協(xié)同調(diào)控這些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響擬南芥的耐旱和耐鹽性[25]。本研究中，在干旱、ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)量在2 h處均顯著上調(diào)，推測(cè)可能通過(guò)ABA信號(hào)通路參與干旱脅迫反應(yīng)。Gruber等[26]研究顯示，鹽脅迫下WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族被顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明其廣泛參與到植物的耐鹽機(jī)制中。本研究中，鹽脅迫下的表達(dá)量顯著增高，與GRUBER等[26]研究結(jié)果一致。擬南芥中的、和能與一些熱激轉(zhuǎn)錄因子的W-box結(jié)合從而參與調(diào)控高溫脅迫反應(yīng)[27]。本研究結(jié)果顯示，在高溫條件下，的表達(dá)量在2 h升高后沒(méi)有太大的變化，但在48 h時(shí)有一個(gè)顯著的升高。資料表明，WRKY能夠通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與植物的低溫脅迫應(yīng)答。例如花粉中特異性表達(dá)的能負(fù)調(diào)控CBF介導(dǎo)的低溫應(yīng)答途徑[11]。在低溫下被誘導(dǎo)表達(dá)的，通過(guò)激活下游基因、、和的表達(dá)增強(qiáng)植物的耐寒性[28]。本研究中低溫也顯著誘導(dǎo)的增強(qiáng)表達(dá)。以上的結(jié)果表明，可能參與了多個(gè)逆境響應(yīng)過(guò)程。

土壤有效磷的供應(yīng)情況以及植物對(duì)磷的吸收能力是植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵制約因素[29]。以往的研究發(fā)現(xiàn)可以與磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHT1;1啟動(dòng)子區(qū)域中的兩個(gè)W-box結(jié)合，上調(diào)表達(dá)，從而參與對(duì)低磷脅迫的反應(yīng)[30]。本研究對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的序列分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子中含有W-box，可能其他的WRKY轉(zhuǎn)錄因子也能夠調(diào)控的表達(dá)，暗示W(wǎng)RKY42在抗逆調(diào)控中不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是處于復(fù)雜但相互平衡的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中。本研究中在低磷條件下迅速被誘導(dǎo)，隨后下降，在24 h開(kāi)始上升，可能是因?yàn)閃RKY蛋白和自身啟動(dòng)子中的W-box順式作用元件相結(jié)合從而調(diào)控自身表達(dá)，也可能在此過(guò)程中存在其他轉(zhuǎn)錄因子的競(jìng)爭(zhēng)，抑制對(duì)自身的調(diào)控。

從本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿的對(duì)多種逆境脅迫均有響應(yīng)，且基因誘導(dǎo)表達(dá)的豐度較高，暗示該基因可能參與了多種非生物逆境，包括磷營(yíng)養(yǎng)脅迫的調(diào)控。前人對(duì)其他物種的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)和的表達(dá)調(diào)控低磷逆境[16]；通過(guò)ABA信號(hào)途徑來(lái)提高野生草莓（）對(duì)鹽和干旱的抗性[31]。但像這樣，在同一物種中參與多個(gè)逆境響應(yīng)的還未見(jiàn)報(bào)道。雖然非生物脅迫下紫花苜蓿中的生物學(xué)功能以及其調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，但本研究結(jié)果加深了對(duì)參與植物逆境應(yīng)答調(diào)控的認(rèn)識(shí)，為紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控非生物脅迫分子機(jī)制研究提供一定的依據(jù)。

4 結(jié)論

從紫花苜蓿中克隆獲得一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為，該序列ORF為1 692 bp，編碼563個(gè)氨基酸，為不穩(wěn)定蛋白，該蛋白具有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域和C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的Ⅱb亞類(lèi)，位于細(xì)胞核，可以與W-box特異性結(jié)合；在紫花苜蓿具有組織特異性，推測(cè)其在紫花苜蓿適應(yīng)多種非生物脅迫過(guò)程中起重要作用。

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Isolation, Identification, and Response to Abiotic Stress ofgene fromL.

LIU JiaoJiao1, WANG XueMin2, MA Lin2, CUI MiaoMiao2, CAO XiaoYu2, ZHAO Wei1

(1College of Agriculture, Henan University of science and technology/College of Tree Peony, Luoyang 471023, Henan;2Institute of Animal Sciences, Chinese Academyof Agricultural Sciences, Beijing 100193)

【】The WRKY gene family in plants encodes a large group of transcription factors (TFs) that play essential roles in diverse stress responses, developmental and physiological processes. It laid a foundation for further research on the role of WRKY transcription factor in alfalfa stress-resistant molecular regulation by analyzing the role of MsWRKY42 transcription factor in alfalfa. 【】sequence was obtained by homologous alignment and sequence characteristics of it were analyzed by online bioinformatics tools. The phylogenetic tree ofandgenes was constructed by MEGA-X. The putative cis-elements in promoter region ofwas analyzed by PlantCARE. The real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression pattern ofMsWRKY42 in different organs and its response to abiotic including NaCl (0.3 mol·L), PEG(15%), 4℃, 40℃, low phosphorus and ABA (0.1×10-3mol·L-1). The fusion expression vector of pCAMBIA1300-was constructed and delivered intobymediated method to determine the subcellular localization of WRKY protein. The yeast one-hybrid technique was used to analyze the binding activity of MsWRKY42 and the cis-acting element W-box.【】The gene contained a 1 692 bp open reading frame encoding 563 amino acids. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis results indicated that the protein is a member of the IIb sub-group WRKY family and contains a WRKY conserved domain and a C2H2zinc finger motif. It has the highest similarity tofamily, therefore, named as. A variety of cis-acting elements were identified in the promoter region of, including regulatory elements such as stress response, hormone response, and diurnal regulation. Real-Time PCR analysis showed thathad the highest expression in roots and leaves. The expression ofwas up-regulated by NaCl, PEG, low temperature, high temperature, low phosphorus and ABA treatments. Subcellular localization indicated thatwas mainly located on the nucleus in plant cells. The results of the binding activity analysis showed that MsWRKY42 was able to specifically bind to W-box.【】is a typical transcription factor, which can specifically bind to cis-acting elements, and the protein is localized in the nucleus. The gene was expressed in different tissues of alfalfa, and was induced by NaCl, PEG, high temperature, low phosphorus and ABA treatment. It is speculated that thegene may play a role in response to multiple stress defense responses as a WRKY transcription factor.

alfalfa; WRKY transcription factor; abiotic stress; subcellular localization; binding activity analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.17.004

2019-10-30；

2020-02-16

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31872410）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牧草產(chǎn)業(yè)體系崗位科學(xué)家（CARS34）、河南科技大學(xué)學(xué)科提升計(jì)劃（13660001）

劉佼佼，E-mail：1192771534@qq.com。通信作者趙威，E-mail：zhaowei1@haust.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）