郝樹(shù)琳，陳宏偉，廖芳麗，李莉，劉昌燕，劉良軍，萬(wàn)正煌，沙愛(ài)華

基于鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組信息的蠶豆F-box基因家族分析

郝樹(shù)琳1，陳宏偉2，廖芳麗3，李莉2，劉昌燕2，劉良軍2，萬(wàn)正煌2，沙愛(ài)華1

（1長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434025；2湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；3荊州市種子管理局，湖北荊州 434020）

【】通過(guò)生物信息學(xué)方法分析蠶豆F-box基因家族成員的分布、結(jié)構(gòu)及進(jìn)化，研究家族成員在不同處理時(shí)間條件下的表達(dá)模式及對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，為該類基因生物學(xué)功能和鹽脅迫機(jī)制的研究提供參考?；谛Q豆鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)，利用NR、Swiss-prot和PFAM 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI網(wǎng)站，對(duì)蠶豆F-box基因進(jìn)行篩選注釋；利用Web Logo 3、Prot Comp 9.0、MEGA-X和MEME等軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和Motif等生物信息學(xué)分析。基于鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析蠶豆（yz17134耐鹽和yz17078不耐鹽）F-box基因家族在鹽脅迫下的差異表達(dá)模式，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）檢測(cè)部分家族成員在16和24 h的表達(dá)情況。基于鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，注釋得到161個(gè)蠶豆F-box基因，均含有F-box保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)C端結(jié)構(gòu)域的不同，將其分成11個(gè)亞族：FBX、FBXFBA、FBXLRR、FBXPP2、FBXKelch、FBXTUB、FBXFBD、FBXDUF、FBXACTIN、FBXWD40和FBO。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，F(xiàn)-box保守基序中包含1個(gè)極度保守的色氨酸殘基。比較分析蠶豆F-box家族和擬南芥F-box家族共同構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)同一C端結(jié)構(gòu)域的基因大多聚集在一起。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，124個(gè)F-box基因定位于細(xì)胞外，37個(gè)定位于細(xì)胞核中?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，蠶豆F-box家族基因的DNA序列中均無(wú)內(nèi)含子，且均由UTR區(qū)和CDS區(qū)組成?；邴}脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的F-box差異表達(dá)模式分析表明，蠶豆F-box基因在2個(gè)不同處理時(shí)間點(diǎn)上的表達(dá)各不相同，在鹽處理16 h的表達(dá)較為明顯。qRT-PCR分析結(jié)果表明，在F-box家族成員中，共存在5個(gè)差異基因。其中、和在鹽處理16 h的表達(dá)量均上調(diào)，和在鹽處理16 h的表達(dá)量均下調(diào)。蠶豆F-box基因家族注釋得到161個(gè)蠶豆F-box基因，分為11個(gè)亞族。其中5個(gè)重要的F-box基因在不同鹽處理時(shí)間的表達(dá)量存在差異。

蠶豆；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；F-box家族；鹽脅迫；表達(dá)模式

0 引言

【研究意義】蠶豆（L）是巢菜屬一年生或越年生草本植物，有生物固氮之王的美譽(yù)，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。在蠶豆生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，生物和非生物脅迫等因素對(duì)蠶豆產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成經(jīng)濟(jì)損失。鹽脅迫是其中一種主要的非生物脅迫，嚴(yán)重危害蠶豆的生長(zhǎng)發(fā)育。F-box基因廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫途徑，如細(xì)胞蛋白質(zhì)降解、激素感知和信號(hào)傳導(dǎo)等[2-4]。因此，研究蠶豆F-box基因功能和培育蠶豆耐鹽品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自然條件下，植物的生長(zhǎng)會(huì)受到內(nèi)部或外部的刺激，為了應(yīng)對(duì)產(chǎn)生的刺激，植物已經(jīng)發(fā)展出多種調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)協(xié)調(diào)它們的生命活動(dòng)。其中，泛素26s蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-26s proteasome system，UPS）降解蛋白是一種重要的翻譯后調(diào)控機(jī)制，并在真核生物中高度保守[5]。UPS催化多種泛素與靶底物的共價(jià)連接，使底物被26S蛋白酶體識(shí)別并進(jìn)行蛋白水解。泛素化主要由泛素激活酶（ubiquitin-activating enzymes，E1s）、泛素偶聯(lián)酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2s）和泛素蛋白連接酶（ubiquitin protein ligases，E3s）3種酶來(lái)完成。其中，E3s起到關(guān)鍵的底物識(shí)別功能[6]。F-box蛋白作為E3s的核心成分，即SCF（Skp1-Cul1-F-box）復(fù)合物，介導(dǎo)不同底物的特異性降解[7]。F-box基因廣泛存在于各種植物，是植物中最大、進(jìn)化最快的基因家族之一，越來(lái)越多的真核F-box基因被發(fā)現(xiàn)[8-11]。F-box基因在不同物種間的數(shù)量相差較大。動(dòng)物體內(nèi)的F-box基因數(shù)量相對(duì)較少，秀麗線蟲(chóng)是目前發(fā)現(xiàn)含有F-box基因最多的動(dòng)物，具有326個(gè)，而人體內(nèi)僅含有38個(gè)，果蠅只含有22個(gè)[12]；植物中F-box基因家族成員個(gè)數(shù)遠(yuǎn)多于動(dòng)物，模式植物苜蓿和擬南芥分別含有972和694個(gè)[13-14]，農(nóng)作物水稻、大豆、玉米和鷹嘴豆分別含有687、509、359和285個(gè)[15-16]，經(jīng)濟(jì)作物蘋(píng)果和梨分別含有517和226個(gè)[17-18]。F-box結(jié)構(gòu)域一般位于蛋白的N端，含有40—50個(gè)氨基酸，與SKP1相互作用形成SCF復(fù)合物，而C端通常是介導(dǎo)底物識(shí)別特異性的二級(jí)結(jié)構(gòu)[14]。在哺乳動(dòng)物中，根據(jù)C末端二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同，F(xiàn)-box蛋白可分為3類。具有LRR結(jié)構(gòu)域的FBXL，具有WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的FBXW和具有其他結(jié)構(gòu)域的FBXO[19]。在植物中，通過(guò)對(duì)擬南芥和水稻F-box蛋白的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)了大量結(jié)構(gòu)域，如WD40（Tryptophan-aspartic acid 40）、kelch重復(fù)序列、LRR（Leucine-rich repeat）、FBD（F-Box and BRCT domain）、環(huán)指結(jié)構(gòu)、PAS/PAC（Per Arnt Sim）、PPR（pentatricopeptide repeat）和TUB（tubby）等[15]。因此，F(xiàn)-box蛋白可以識(shí)別多種類型的底物，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。UFO是植物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)F-box蛋白，在花分生組織鑒定和花器官發(fā)育中具有重要作用[20]。隨著深入研究，越來(lái)越多的F-box蛋白被發(fā)現(xiàn)，并且這些蛋白的功能變得多樣化。在擬南芥中，許多F-box蛋白參與植物激素反應(yīng)。例如，含有F-box結(jié)構(gòu)域的TIR1是擬南芥的生長(zhǎng)素受體[21]。AFB 1-3是一種生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的F-box蛋白，可以結(jié)合類似TIR1的Aux/IAA蛋白，促進(jìn)生長(zhǎng)素的應(yīng)答[22]。F-box蛋白也可調(diào)控赤霉素信號(hào)通路，例如擬南芥的SLEEPY1（SLY1）和SNEEZY（SNE），水稻中的赤霉素不敏感矮桿2（GID2）[23]。在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，乙烯不敏感3（EIN3）通過(guò)結(jié)合F-box1/2（EBF1/2）進(jìn)行降解[24]。COI1也屬F-box蛋白，它是茉莉酸（JA）信號(hào)反應(yīng)的一個(gè)重要因子，也是擬南芥JA依賴性反應(yīng)必需的[25]。此外，F(xiàn)-box蛋白LKP1/ZTL、LKP2/FKL和FKF1參與光形態(tài)發(fā)生、晝夜節(jié)律和開(kāi)花時(shí)間[26]。DOR是擬南芥中與ASK14和CUL1特異性相互作用的F-box蛋白，在耐旱條件下起負(fù)調(diào)控作用[27]。水稻F-box基因與葡萄糖延遲種子萌發(fā)有關(guān)[28]。此外，早期研究中也發(fā)現(xiàn)了一些植物的S位點(diǎn)F-box基因，證明其參與花粉管伸長(zhǎng)，甚至參與自交不親和[29]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)于蠶豆的研究多集中在生理層面，在蠶豆中對(duì)F-box基因家族的鑒定和系統(tǒng)分析鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)蠶豆F-box基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、蛋白保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行分析，同時(shí)利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)F-box家族成員響應(yīng)鹽脅迫的差異表達(dá)模式進(jìn)行分析，為后續(xù)研究蠶豆F-box基因的功能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蠶豆（L）種子由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜糧研究工程中心提供。于2018年9月，選取飽滿、大小均等的2個(gè)不同品種（Y134耐鹽和Y078不耐鹽）的蠶豆種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，用0.8% NaCl處理，分別于16和24 h收集具有胚胎1/4部分子葉的材料，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)，材料收集后液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)于2018年在長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院耐漬油料種質(zhì)資源湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 蠶豆總RNA的提取、文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

植物總RNA提取采用TRNzol試劑法（TRNzol Universal Reagent,天根生化科技有限公司，北京，中國(guó)）分別提取蠶豆芽期胚的總RNA，并用TGem spectrophotometer Plus（天根生化科技有限公司，北京，中國(guó)）微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度（OD260/280比值）以及RNA濃度，最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)合格的樣品送到廣州賽哲生物科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并通過(guò)De Novo方法[30]組裝得到116 093條Unigene，后續(xù)分析基于此測(cè)序結(jié)果進(jìn)行。

1.3 蠶豆和擬南芥F-box基因的篩選

以鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在NR、Swiss-prot和Pfam 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，初步注釋到451個(gè)F-box相關(guān)基因，并用TBtools軟件[31]批量提取相應(yīng)的蛋白序列。將這些蛋白序列于NCBI進(jìn)行Blast搜索比對(duì)，同時(shí)利用CDD（conserved domain database）在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwrpsb/bwrpsb.cgi）對(duì)序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，去除重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本后，最終得到161個(gè)具有F-box結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。根據(jù)Wang等[32]對(duì)梨F-box基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域不同的方法進(jìn)行分類，擬南芥蛋白序列從Ensembl Plants（http://plants.ensembl. org/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載獲得。

1.4 蠶豆F-box基因家族保守域及其進(jìn)化關(guān)系分析

利用序列分析軟件Clustal W對(duì)161個(gè)蠶豆F-box蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，去除保守域之外的區(qū)域，通過(guò)在線軟件Web Logo 3（https://weblogo.Threeplusone. com/）對(duì)蠶豆F-box蛋白進(jìn)行保守基序分析；利用MEGA-X軟件的Clustal W程序，對(duì)161個(gè)蠶豆F-box蛋白和部分功能明確的擬南芥F-box蛋白（共15個(gè)）進(jìn)行多序列比對(duì)，并用最大似然法（maximum likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用Jones-Thornton- Taylor（JTT）模型算法進(jìn)行估計(jì)，并進(jìn)行Bootstrap分析，重復(fù)值設(shè)置為1 000。通過(guò)在線程序iTOL（https:// itol.embl.de/）可視化系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 蠶豆F-box基因家族亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、基因結(jié)構(gòu)及Motif分析

利用在線軟件Prot Comp 9.0（http://linux.softberry. com）對(duì)161個(gè)候選F-box基因家族各成員的氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析；根據(jù)基因組注釋信息，利用TBtools軟件對(duì)F-box基因的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析；利用在線軟件MEME（http://meme-suite.org/）分析蠶豆F-box基因家族成員Motif類型和排列順序，獲得基因家族Motif特點(diǎn)。

1.6 蠶豆F-box基因的表達(dá)模式分析與驗(yàn)證

蠶豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)中各基因片段表達(dá)量的計(jì)算采用FPKM（fragments per kilobase million）法[33]。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，利用TBtools軟件對(duì)F-box基因在2個(gè)不同處理時(shí)間和2個(gè)不同品種間的表達(dá)繪制熱圖。以蠶豆2個(gè)不同處理時(shí)間的2個(gè)品種為材料，選取了5個(gè)在處理16 h上、下調(diào)明顯的F-box基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。各樣品RNA采用第一鏈cDNA合成試劑盒（Promega，Madison，USA）反轉(zhuǎn)錄cDNA，選用蠶豆作內(nèi)參[34]，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），反應(yīng)體系為模板cDNA 1 μL、正/反向引物各0.5 μL（10 μmol·L-1）、2×RealUniversal PreMix（SYBR Green, blue，F(xiàn)P201,TIANGEN,北京，中國(guó)）10 μL和ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 15 min；95℃ 10 s，57℃ 20 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。所用儀器為美國(guó)伯樂(lè)（BIO-RAD，CA，USA）CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采用2-△△CT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的[35]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物

2 結(jié)果

2.1 蠶豆F-box基因家族的鑒定及分類

基于鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，在NR、Swiss-prot和Pfam 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，初步注釋到451個(gè)F-box相關(guān)基因，通過(guò)NCBI Blast預(yù)測(cè)，去除重復(fù)序列和冗余轉(zhuǎn)錄本后，最終得到161個(gè)蠶豆F-box基因。

利用SMART和CDD在線工具對(duì)所得到的161條F-box蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，并根據(jù)Wang等[18]對(duì)梨F-box基因家族的分類方法，按照每個(gè)F-box基因所包含的C端保守結(jié)構(gòu)域類型，將其分為FBX、FBXFBA、FBXLRR、FBXPP2、FBXKelch、FBXTUB、FBXFBD、FBXDUF、FBXACTIN、FBXWD40和FBO 11類。其中FBX類基因64個(gè)，F(xiàn)BXFBA類基因27個(gè)，F(xiàn)BXLRR類基因19個(gè)，F(xiàn)BXPP2類基因8個(gè)，F(xiàn)BXKelch類基因16個(gè)，F(xiàn)BXTUB類基因7個(gè)，F(xiàn)BXFBD類基因10個(gè)，F(xiàn)BXDUF類基因2個(gè)，F(xiàn)BXACTIN類基因2個(gè)，F(xiàn)BXWD40類基因1個(gè)，F(xiàn)BO類基因5個(gè)。

2.2 蠶豆F-box蛋白的保守基序分析

利用序列分析軟件Clustal W對(duì)161個(gè)蠶豆F-box蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，去除保守域之外的不保守區(qū)域，對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基序分析。通常F-box蛋白在N端含有40—50個(gè)氨基酸的F-box基序[18]。由圖1蠶豆F-box蛋白的保守基序圖可知，其約含49個(gè)氨基酸殘基，包括1個(gè)極度保守的色氨酸殘基（W）。此外，在F-box蛋白的保守基序中還存在其他保守氨基酸殘基，如第4位的亮氨酸殘基（L）、第5位的脯氨酸殘基（P）、第12位的蘇氨酸殘基（T）、第30位的纈氨酸殘基（V）。這些保守的氨基酸殘基可能與色氨酸殘基共同維持蠶豆F-box基序的α螺旋結(jié)構(gòu)[36]，進(jìn)而發(fā)揮其特定的功能。

2.3 蠶豆與擬南芥F-box基因的進(jìn)化關(guān)系與功能預(yù)測(cè)分析

利用MEGA-X軟件構(gòu)建蠶豆與擬南芥F-box蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)（圖2）的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)將2個(gè)物種的F-box家族蛋白進(jìn)行聚類分析。研究表明，對(duì)植物的F-box蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，具有相同C端結(jié)構(gòu)域的F-box蛋白傾向于聚集在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一類群中[11]。因此，根據(jù)不同的特異性區(qū)域?qū)-box基因家族成員分為11個(gè)不同的亞群。FBX亞族（64）是由只含有F-box結(jié)構(gòu)域的基因組成，不包含其他任何特定結(jié)構(gòu)域，其成員數(shù)量多于其他子群。其他10個(gè)亞族由包含一個(gè)不可缺少的F-box結(jié)構(gòu)域和其他可變結(jié)構(gòu)域的基因組成，如LRR（命名為FBXLRR）、Tub（FBXTUB）、Kelch（FBXKelch）、FBA （FBXFBA）、FBD（FBXFBD）等。例如，F(xiàn)BXFBA和FBXFBD亞群分別表示含有FBA結(jié)構(gòu)域或FBD結(jié)構(gòu)域而沒(méi)有其他可變域的基因。為了驗(yàn)證上述分類，利用蠶豆F-box全長(zhǎng)序列與部分功能明確的擬南芥全長(zhǎng)序列共同構(gòu)建了一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，事實(shí)上，觀察到一些分組成員聚集在一起，例如FBXFBA、FBXFBD、FBXTUB和FBXPP2，這在一定程度上支持了基于C端結(jié)構(gòu)域分類的方法。

圖1 蠶豆F-box蛋白保守基序

圖2 蠶豆與擬南芥F-box蛋白家族的進(jìn)化分析

由圖2可知，一些F-box亞族與擬南芥F-box蛋白進(jìn)化關(guān)系較近。例如，F(xiàn)BXFBA亞族中Vf057818.2、Vf018051.2、Vf021412.1、Vf002875.1與擬南芥At3g16740、FOA1位于同一進(jìn)化亞枝上；FBX亞族中Vf026637.1、Vf037174.1與擬南芥At3g47550w位于同一進(jìn)化亞枝上，Vf026793.4、Vf029211.1與擬南芥TOC1進(jìn)化關(guān)系較近；FBXFBD亞族中Vf051279.1與擬南芥At5g22700位于同一進(jìn)化亞枝上；FBXTub亞族與擬南芥EID1位于同一進(jìn)化亞枝上；FBXPP2亞族與擬南芥AtPP2-B11、At2g02360位于同一進(jìn)化亞枝上；FBXKelch亞族與擬南芥AFR位于同一進(jìn)化亞枝，表明它們可能具有相似的功能。

2.4 蠶豆F-box基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò)在線軟件Prot Comp 9.0（http://linux.softberry. com）對(duì)161個(gè)蠶豆F-box個(gè)成員的氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)（圖3），結(jié)果顯示，共有124個(gè)候選F-box基因位于細(xì)胞外，其中FBX亞族多達(dá)59個(gè)，占候選基因總數(shù)的47.58%，說(shuō)明這些F-box蛋白可能參與胞外某些特定的生物學(xué)過(guò)程；37個(gè)位于細(xì)胞核中，其中FBXPP2亞族多達(dá)8個(gè)，占候選基因總數(shù)的21.62%，表明其可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)發(fā)揮特定功能。

2.5 蠶豆F-box基因的基因結(jié)構(gòu)及Motif分析

根據(jù)基因組注釋信息，利用TBtools軟件對(duì)F-box基因的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析（圖4），發(fā)現(xiàn)F-box基因家族成員無(wú)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，且每一個(gè)成員都含有UTR區(qū)和CDS區(qū)。根據(jù)F-box家族成員的進(jìn)化關(guān)系可知，同一亞族的編碼區(qū)長(zhǎng)度大致相同。因此，基因結(jié)構(gòu)分析在一定程度上也支持了基于C端結(jié)構(gòu)域分類的方法。

圖3 蠶豆F-box基因家族的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用在線軟件MEME（http://meme-suite.org/）分析蠶豆F-box基因家族成員基序類型和排列順序。如圖4所示，F(xiàn)-box基因家族預(yù)測(cè)含有20個(gè)Motif，F(xiàn)-box基因家族成員之間所包含的Motif數(shù)目及種類存在一定的差異。除了Vf036806.3和Vf033536.1不含Motif1外，其他均含有Motif1，相比Motif1，Motif2在蠶豆F-box基因家族中有60個(gè)成員不含該基序，Motif3在蠶豆F-box基因家族中有131個(gè)成員不含該基序。Motif4出現(xiàn)29次，Motif5出現(xiàn)17次，Motif6出現(xiàn)21次，Motif7出現(xiàn)35次，Motif8出現(xiàn)5次，Motif9出現(xiàn)11次，Motif10出現(xiàn)7次，Motif11出現(xiàn)51次，Motif12出現(xiàn)40次，Motif13出現(xiàn)39次，Motif14出現(xiàn)40次，Motif15出現(xiàn)42次，Motif16出現(xiàn)6次，Motif17出現(xiàn)6次，Motif18出現(xiàn)22次，Motif19出現(xiàn)25次，Motif20出現(xiàn)7次。結(jié)果表明，出現(xiàn)頻率較高的Motif為F-box基因家族中非常重要的保守基序。對(duì)于出現(xiàn)頻率較低的Motif，通過(guò)Smart在線分析，其功能的相關(guān)信息未知，有待日后進(jìn)一步深入研究。

2.6 蠶豆F-box基因在鹽處理不同時(shí)間的表達(dá)模式分析

基因的表達(dá)模式可以為基因功能提供重要的依據(jù)，從蠶豆鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別提取161個(gè)F-box家族基因在不同品種（Y134 T2-T1為以Y078（不耐鹽）品種16 h鹽處理表達(dá)量為參照，Y134（耐鹽）品種16 h鹽處理與之相比較的差異表達(dá)量；CK2-CK1為以Y078（不耐鹽）品種16 h對(duì)照的表達(dá)量為參照，Y134（耐鹽）品種16h對(duì)照與之相比較的差異表達(dá)量，同理T4-T3為以Y078（不耐鹽）品種24 h鹽處理表達(dá)量為參照，Y134（耐鹽）品種24 h鹽處理與之相比較的差異表達(dá)量；CK4-CK3為以Y078（不耐鹽）品種24 h鹽處理表達(dá)量為參照，Y134（耐鹽）品種24 h鹽處理與之相比較的差異表達(dá)量。由圖5可知，隨著鹽處理時(shí)間的增加，蠶豆F-box基因的表達(dá)模式出現(xiàn)差異化。通過(guò)橫向比對(duì)每個(gè)家族成員的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)大部分成員在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)均有高表達(dá)和低表達(dá)，一部分成員在16 h處理表達(dá)量明顯升高，還有一些成員在24 h處理表達(dá)量明顯降低。說(shuō)明這些家族成員可能在鹽脅迫前16 h中參與主要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，并確定F-box基因在蠶豆鹽脅迫下的參與情況，采用熒光定量PCR，在蠶豆2個(gè)品種和2個(gè)處理時(shí)間中進(jìn)行差異表達(dá)分析（圖6）。選取5個(gè)差異表達(dá)基因（在鹽脅迫的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以至少以一個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的FDR＜0.05，且差異倍數(shù)2倍及2倍以上的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因），其中3個(gè)上調(diào)基因，2個(gè)下調(diào)基因。結(jié)果表明，5個(gè)蠶豆F-box基因的表達(dá)變化各不相同，其中在鹽處理16和24 h的表達(dá)量上調(diào)；在鹽處理16 h的表達(dá)量下調(diào)非常明顯，鹽處理24 h表達(dá)量無(wú)顯著差異；在鹽處理16 h上調(diào)非常明顯，在鹽處理24 h不明顯，后者與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不符；在鹽處理16 h表達(dá)量上調(diào)，鹽處理24 h表達(dá)量上調(diào)不明顯；在鹽處理16 h下調(diào)非常明顯，鹽處理24 h表達(dá)量上調(diào)，這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不符。鹽處理16 h，qRT-PCR檢測(cè)到的5個(gè)基因，有4個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致。

圖4 蠶豆F-box基因家族結(jié)構(gòu)和Motif分析

此圖基于蠶豆鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的計(jì)算得出，每種顏色代表相應(yīng)表達(dá)量的數(shù)值，數(shù)值越大，表達(dá)量越高

圖6 蠶豆F-box基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

3 討論

在植物中，F(xiàn)-box作為一個(gè)較大的基因家族，它們參與了多種生物途徑，在整個(gè)植物生命周期的一系列生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，大多數(shù)植物F-box基因的功能仍然未知，特別是在蠶豆中。由于蠶豆的全基因組序列還未公布，在很大程度上限制了其重要性狀基因的研究。本研究基于蠶豆鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)蠶豆F-box基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)、保守基序、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將其劃分為不同亞族。在不同品種的不同鹽脅迫下，對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。

通過(guò)對(duì)蠶豆F-box蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基序分析，得出F-box基序中包含一個(gè)極度保守的色氨酸殘基，這與其他植物相類似。因此，蠶豆也有可能普遍形成SCF復(fù)合物。此外，大多數(shù)已知的蠶豆C端結(jié)構(gòu)域也存在于其他植物中，表明進(jìn)化基因的保守性以及F-box蛋白在不同植物中的相似性。根據(jù)C端結(jié)構(gòu)域的不同，蠶豆F-box蛋白可分為11個(gè)亞家族，其中最豐富的F-box蛋白屬于FBX亞家族，含有未知的C端結(jié)構(gòu)域。Motif分析結(jié)果表明，大多數(shù)基序也存在于其他植物中，而少數(shù)基序是豆科或蠶豆特有的。與其他已知的C端保守結(jié)構(gòu)域一樣，這些推測(cè)的新基序也可能在F-box蛋白與其底物的相互作用中發(fā)揮作用。那些含有豆科或蠶豆特異性基序的蛋白可能具有與豆科特異性細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的功能,但具體功能有待深入研究。

本文使用基于C端底物相互作用域的F-box基因分類標(biāo)準(zhǔn)，再次肯定了之前基于N端F-box基序的分類，說(shuō)明N端F-box基序可能與C端基序共同進(jìn)化，這一點(diǎn)與其他植物相似[13]。此外，F(xiàn)-box基序生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與基因結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果是一致的，說(shuō)明系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)準(zhǔn)確地代表了蠶豆F-box基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。然而，蠶豆F-box家族基因結(jié)構(gòu)中無(wú)內(nèi)含子，無(wú)內(nèi)含子F-box基因在擬南芥、水稻、玉米、鷹嘴豆和胡楊中所占比例較高[16]。由亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果可知，蠶豆F-box蛋白主要存在于細(xì)胞外和細(xì)胞核中，少數(shù)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜和液泡中。大量的豆類F-box蛋白被預(yù)測(cè)有多個(gè)亞細(xì)胞定位。據(jù)報(bào)道，在擬南芥中檢測(cè)到17個(gè)F-box蛋白大部分定位于胞腔內(nèi)，單個(gè)F-box蛋白可以形成多個(gè)SCF復(fù)合物[37]。這些都說(shuō)明了F-box蛋白在調(diào)控植物的生物學(xué)過(guò)程中具有多種作用。

基因表達(dá)模式與基因功能關(guān)系十分密切，通過(guò)研究蠶豆鹽脅迫過(guò)程中基因表達(dá)的變化，可發(fā)現(xiàn)參與鹽脅迫的相關(guān)功能基因。F-box基因被證實(shí)參與非生物脅迫反應(yīng)，Zhao等[3]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的小麥的轉(zhuǎn)基因煙草各項(xiàng)生理指標(biāo)均高于野生型。Jia等[38]發(fā)現(xiàn)擬南芥F-box基因通過(guò)抑制ROS積累和影響體內(nèi)Na+平衡來(lái)提高植株的耐鹽性；An等[39]研究發(fā)現(xiàn)超表達(dá)能夠提高植株的耐鹽和耐旱性。本文基于蠶豆鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析F-box基因在蠶豆鹽脅迫下的差異表達(dá)模式，篩選出5個(gè)表達(dá)差異顯著的基因，用于進(jìn)一步qRT-PCR分析。qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)表達(dá)上調(diào)的差異基因和2個(gè)表達(dá)下調(diào)的差異基因，說(shuō)明它們可能在蠶豆遭受鹽脅迫過(guò)程中起著正向或負(fù)向調(diào)控作用。為研究蠶豆中參與鹽脅迫過(guò)程中的相關(guān)F-box基因的功能和機(jī)制提供基礎(chǔ)。

擬南芥F-box家族蛋白功能的研究報(bào)道很多，UFO參與調(diào)節(jié)花器官發(fā)育[40]，AtPP2-B11對(duì)耐旱性起負(fù)調(diào)控作用，提高鹽脅迫抗性，并參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[38]，AtTR1參與鹽脅迫反應(yīng)[41]?？筛鶕?jù)進(jìn)化樹(shù)中位于同一進(jìn)化亞枝中的擬南芥蛋白功能，預(yù)測(cè)研究物種蛋白的功能，嚴(yán)莉等[42]通過(guò)構(gòu)建擬南芥與黑果枸杞的MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將位于相鄰位置的黑果枸杞和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子列為具有相同或相似結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，從而推測(cè)其功能的一致性。本研究所得的161個(gè)蠶豆F-box蛋白與15個(gè)功能明確的擬南芥F-box蛋白作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)15個(gè)擬南芥F-box蛋白進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近推測(cè)蠶豆F-box蛋白的功能。如Vf002875.1與At3g16740相鄰，根據(jù)擬南芥At3g16740的功能推測(cè)Vf002875.1可能參與影響種子萌發(fā)的過(guò)程[43]；推測(cè)Vf061385.1可能與擬南芥AtPP2-B11功能一致，參與鹽脅迫反應(yīng)[38]；Vf026793.4與擬南芥TOC1進(jìn)化關(guān)系較近，可能參與生物鐘調(diào)節(jié)[44]。通過(guò)對(duì)擬南芥F-box蛋白保守結(jié)構(gòu)域的搜索發(fā)現(xiàn)，含有同一C端結(jié)構(gòu)域的蛋白進(jìn)化到同一亞枝或進(jìn)化關(guān)系較近，證明相鄰或較近進(jìn)化關(guān)系上的蛋白有可能具有相同或相似的功能，為研究F-box蛋白的功能提供了一種思路。此外，在后續(xù)研究中，將對(duì)F-box基因家族成員進(jìn)行轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，分析其在鹽脅迫及其他非生物脅迫中的具體表型影響。

4 結(jié)論

基于蠶豆鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選注釋了161個(gè)蠶豆F-box基因，且均含有F-box保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)C末端氨基酸序列不同使家族成員多樣化，分為11個(gè)亞家族，家族成員均無(wú)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，且家族成員在胞外和細(xì)胞核中均存在。、和正調(diào)控鹽脅迫，和負(fù)調(diào)控鹽脅迫，且鹽脅迫下的F-box家族成員在不同處理時(shí)間下呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)。

[1] 王海飛, 關(guān)建平, 孫雪蓮, 馬鈺, 宗緒曉. 世界蠶豆種質(zhì)資源遺傳多樣性和相似性的ISSR分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(5): 1056-1062.

Wang H F, Guan J P, Sun X L, Ma Y, Zong X X. Genetic diversity and similarity of global faba bean (L.) germplasm revealed by ISSR markers., 2011, 44(5): 1056-1062. (in Chinese)

[2] Baute J, Polyn S, De Block J, Blomme J, Van Lijsebettens M, Inzé D. F-Box protein FBX92 affects leaf size in., 2017, 58(5): 962-975.

[3] Zhao Z, Zhang G, Zhou S, Ren Y, Wang W. The improvement of salt tolerance in transgenic tobacco by overexpression of wheat F-box gene TaFBA1., 2017, 259: 71-85.

[4] Stefanowicz K, Lannoo N, Zhao Y, Eggermont L, Van Hove J, Al Atalah B, Van Damme E J. Glycan-binding F-box protein fromprotects plants frominfection., 2016, 16(1): 213-226.

[5] Smalle J, Vierstra R D. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway., 2004, 55: 555-590.

[6] Sadanandom A, Bailey M, Ewan R, Lee J, Nelis S. The ubiquitin-proteasome system: Central modifier of plant signalling., 2012, 196(1): 13-28.

[7] Ho M S, Ou C, Chan Y R, Chien C T, Pi H. The utility Fbox for protein destruction., 2008, 65(13): 1977-2000.

[8] Somers D E, Fujiwara S. Thinking outside the F-box: Novel ligands for novel receptors., 2009, 14(4): 206-213.

[9] Hua Z, Zou C, Shiu S H, Vierstra R D. Phylogenetic comparison of F-Box (FBX) gene superfamily within the plant kingdom reveals divergent evolutionary histories indicative of genomic drift., 2011, 6(1): e16219.

[10] Navarro-Quezada A, Schumann N, Quint M. Plant F-box protein evolution is determined by lineage-specific timing of major gene family expansion waves., 2013, 8(7): e68672.

[11] Xu G, Ma H, Nei M, Kong H. Evolution of F-box genes in plants: Different modes of sequence divergence and their relationships with functional diversification., 2009, 106(3): 835-840.

[12] Kipreos E T, Pagano M. The F-box protein family., 2000, 1(5): 1-7.

[13] Song J B, Wang Y X, Li H B, Li B W, Zhou Z S, Gao S, Yang Z M. The F-box family genes as key elements in response to salt, heavy mental, and drought stresses in., 2015, 15(4): 495-507.

[14] Jia Q, Xiao Z X, Wong F L, Sun S, Liang K J, Lam H M. Genome-wide analyses of the soybean F-box gene family in response to salt stress., 2017, 18(4): 818-835.

[15] JaIN M, NIJHAWAN A, ARORA R, AGARWAL P, RAY S, SHARMA P, KAPOOR S, TYAGI A K, KHURANA J P. F-Box proteins in rice. genome-wide analysis, classification, temporal and spatial gene expression during panicle and seed development, and regulation by light and abiotic stress., 2007, 143(4): 1467-1483.

[16] Cui H R, Zhang Z R, Lü W, Xu J N, Wang X Y. Genome-wide characterization and analysis of F-box protein-encoding genes in the Malus domestica genome., 2015, 290(4): 1435-1446.

[17] Gupta S, Garg V, Kant C, Bhatia S. Genome-wide survey and expression analysis of F-box genes in chickpea., 2015, 16(1): 1-15.

[18] Wang G M, Yin H, Qiao X, Tan X, Gu C, Wang B H, Cheng R, Wang Y Z, Zhang S L. F-box genes: Genome-wide expansion, evolution and their contribution to pollen growth in pear ()., 2016, 253: 164-175.

[19] 王秀燕, 孫莉萍, 張建鋒, 李輝, 呂文清, 張其清. F-box蛋白家族及其功能. 生命科學(xué), 2008, 20(5): 807-811.

Wang X Y, Sun L P, Zhang J F, Li H, Lü W Q, Zhang Q Q. F-box proteins and their functions., 2008, 20(5): 807-811. (in Chinese)

[20] Hepworth S R, Klenz J E, Haughn G W. UFO in theinflorescence apex is required for floral-meristem identity and bract suppression., 2006, 223(4): 769-778.

[21] Kepinski S, Leyser O. TheF-box protein TIR1 is an auxin receptor., 2005, 435(7041): 446-451.

[22] Walsh T A, Neal R, Merlo A O, Honma M, Hicks G R, Wolff K, Matsumura W, Davies J P. Mutations in an auxin receptor homolog AFB5 and in SGT1b confer resistance to synthetic picolinate auxins and not to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid or indole-3-acetic acid in., 2006, 142: 542-552.

[23] Gomi K, Sasaki A, Itoh H, Ueguchi-Tanaka M, Ashikari M, Kitano H, Matsuoka M. GID2, an F-box subunit of the SCF E3 complex, specifically interacts with phosphorylated SLR1 protein and regulates the gibberellin-dependent degradation of SLR1 in rice., 2004, 37(4): 626-634.

[24] Gagne J M, Smalle J, Gingerich D J, Walker J M, Yoo S D, Yanagisawa S, Vierstra R D.EIN3-binding F-box 1 and 2 form ubiquitin-protein ligases that repress ethylene action and promote growth by directing EIN3 degradation., 2004, 101(17): 6803-6808.

[25] Sheard L B, Tan X, Mao H, Withers J, Ben-Nissan G, Hinds T R, Kobayashi Y, Hsu F F, Sharon M, Browse J, He S Y, Rizo J, Howe G A, Zheng N. Jasmonate perception by inositolphosphate-potentiated COI1-JAZ co-receptor., 2010, 468(7322): 400-405.

[26] Imaizumi T, Schultz T F, Harmon F G, Ho L A, Kay S A. FKF1 F-box protein mediates cyclic degradation of a repressor of CONSTANS in., 2005, 309(5732): 293-297.

[27] Zhang Y, Xu W Y, Li Z H, Deng X W, Wu W H, Xue Y B. F-Box protein DOR functions as a novel inhibitory factor for abscisic acid-induced stomatal closure under drought stress in., 2008, 148(4): 2121-2133.

[28] Song S, Dai X, Zhang W H. A rice F-box gene, OsFbx352, is involved in glucose-delayed seed germination in rice., 2012, 63(15): 5559-5568.

[29] Sonneveld T, Tobutt K R, Vaughan S P, Robbins T P. Loss of pollen-S function in two self-compatible selections of Prunus avium is associated with deletion/mutation of an S haplotype-specific F-Box gene., 2005, 17(1): 37-51.

[30] Grabherr M G, Haas B J, Yassour M, Levin J Z, Thompson D A, Amit I, Adiconis X, Fan L, Raychowdhury R, Zeng Q, Chen Z, Mauceli E, Hacohen N, Gnirke A, Rhind N, di Palma F, Birren B W, Nusbaum C, Lindblad- Toh K, Friedman N, Regev A. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome., 2011, 29(7): 644-652.

[31] Chen C J, Xia R, Chen H, He Y H. TBtools, a Toolkit for biologists integrating various biological data handing tools with a user friendly interface., 2018, 3(27): 1020-1027.

[32] Wang G M, Yin H, Qiao X, Tan X, Gu C, Wang B H, Cheng R, Wang Y Z, Zhang S L. F-box genes: Genome-wide expansion, evolution and their contribution to pollen growth in pear ()., 2016, 253: 164-175.

[33] Kou Y, Qiao L, Wang Q. RETRACTED ARTICLE: Identification of core miRNA based on small RNA-seq and RNA-seq for colorectal cancer by bioinformatics., 2015, 36(4): 2249-2255.

[34] Zhang H M, Wheeler S L, Xia X, Colyvas K, Offler C E, Patrick J W. Transcript profiling identifies gene cohorts controlled by each signal regulating trans-differentiation of epidermal cells ofcotyledons to a transfer cell phenotype., 2017, 8: 2021.

[35] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT-method., 2001, 25(4): 402-408.

[36] Bai C, Sen P, Hofmann K, Ma L, Goebl M, Harper J W, Elledge S J. SKP1 connects cell cycle regulators to the ubiquitin proteolysis machinery through a novel motif, the F-box., 1996, 86(2): 263-274.

[37] Kuroda H, Yanagawa Y, Takahashi N, Horii Y, Matsui M. A comprehensive analysis of interaction and localization ofSKP1-like (ASK) and F-box (FBX) proteins., 2012, 7(11): e50009.

[38] Jia F Y, Wang C Y, Huang J G, Yang G D, Wu C G, Zheng C C. SCF E3 ligase PP2-B11 plays a positive role in response to salt stress in., 2015, 66(15): 4683-4697.

[39] An J P, Li R, Qu F J, You C X, Wang X F, Hao Y J. Apple F-Box protein MdMAX2 regulates plant photomorphogenesis and stress response., 2016, 7: 01685.

[40] Hepworth S R, Klenz J E, Haughn G W. UFO in theinflorescence apex is required for floral-meristem identity and bract suppression., 2006, 223(4): 769-778.

[41] 劉巧紅, 楊亮, 劉志斌, 李旭鋒, 楊毅. 擬南芥AtTR1在鹽脅迫應(yīng)答中的功能初探. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 53(4): 895-901.

Liu Q H, Yang L, Liu Z B, Li X F, Yang Y. First exploration on protein function of Arabidopsis AtTR1 in response to salt stress., 2016, 53(4): 895-901. (in Chinese)

[42] 嚴(yán)莉, 王翠平, 陳建偉, 喬改霞, 李健. 基于轉(zhuǎn)錄組信息的黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子家族分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(20): 3991-4002.

Yan L, Wang C P, Chen J W, Qiao G X, Li J. Analysis of MYB Transcription Factor Family Based on Transcriptome Sequencing inMurr., 2017, 50(20): 3991-4002. (in Chinese)

[43] 段桂芳, 王立群, 李新梅, 趙福, 羅俊, 趙小英, 劉選明. 擬南芥F-box基因At3g16740的表達(dá)分析. 生命科學(xué)研究, 2013, 17(6): 486-492.

Duan G F, Wang L Q, Li X M, Zhao F, Luo J, Zhao X Y, Liu X M. Expression Analysis of F-box Gene At3g16740 in., 2013, 17(6): 486-492. (in Chinese)

[44] Más P, Kim W Y, Somers D E, Kay S A. Targeted degradation of TOC1 by ZTL modulates circadian function in., 2003, 426(6966): 567-570.

Analysis of F-Box gene family based on salt-stressed transcriptome sequencing inL

HAO ShuLin1, CHEN HongWei2, LIAO FangLi3, LI Li2, LIU ChangYan2, LIU LiangJun2, WAN ZhengHuang2, SHA Aihua1

(1College of Agriculture, Yangtze University/Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry, Jingzhou 434025, Hubei;2Institute of Food Crops, Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement, Wuhan 430064;3Seed Authority of Jingzhou, Jingzhou 434020, Hubei)

【】The distribution structure and evolution of F-box gene family members inwere analyzed by bioinformatics method to study the expression patterns of family members and their responses to salt stress under different treatment times. It can provide a reference for the study of the biological function and the mechanism of F-box genes.【】Based on the salt-stressed transcriptome sequencing (RNA-seq) data, the NR, Swiss-Prot, PFAM and NCBI websites were used at the same time to screen and annotate the F-box genes of. The softwares including Web Logo 3, Prot Comp 9.0, MEGA-X and MEME were also applied to analyze the bioinformatics of conserved domain, subcellular localization, phylogenetic tree and Motif. Based on salt stress transcriptome data, the differential expression patterns of F-box gene family in(yz17134 salt tolerance and yz17078 salt intolerance) under salt stress were analyzed, and real-time fluorescence quantitative PCR (qrt-pcr) was used to verify the specific expression of part family members at 16 h and 24 h.】Based on salt-stressed transcriptome sequencing (RNA-seq) data, 161F-box genes were annotated and all contain F-box conserved domain. According to different C-terminal domains, they were divided into 11 subfamilies (FBX, FBXFBA, FBXLRR, FBXPP2, FBXKelch, FBXTUB, FBXFBD, FBXDUF, FBXACTIN, FBXWD40, and FBO). The analysis of the conserved domain showed that the F-box conserved Motif contained an extremely conserved tryptophan residue. By comparing and analyzing the evolutionary tree constructed by the F-box family ofand the F-box family of, it was found that most of the genes in the same C-terminal domain were clustered together. The results of subcellular localization prediction showed that 124 F-box genes were located outside the cell, and 37 F-box genes were located in the nucleus. The analysis of gene structure showed that there were no introns in the DNA sequences of the F-box family genes of, and all of them were composed of UTR zone and CDS zone. Analysis of F-box differential expression patterns based on salt-stressed transcriptome data showed that F-box gene expression inwas diverse from each other at two different processing time points, the expression was more obvious at 16 hours after salt treatment. The results of qRT-PCR analysis showed that there were five different genes in the F-box family. The expressions of,andwere all up-regulated at 16 hours after salt treatment,andwere both down-regulated at 16 hours after salt treatment.【】161F-box genes were identified by family annotation, and they were identified by family annotation, which were Evolutionarily divided into 11 subfamilies. 5 important genes were obtained through a series of bioinformatics analysis. What’s more, there exist difference among the expressions in diverse salt treatment time.

L; RNA-seq; F-box gene family; salt stress; expression pattern

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.17.003

2019-12-19；

2020-03-05

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD1001303/2019YFD1001300）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-09）、國(guó)家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-08-G13）、湖北省技術(shù)創(chuàng)新重大專項(xiàng)（2016ABA087，2018ABA090）

郝樹(shù)琳，E-mail：shulinlin6@163.com。通信作者沙愛(ài)華，E-mail：aihuasha@163.com。通信作者萬(wàn)正煌，E-mail：zhwan168@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）