郭佳琦，丁 旭，解宇浩，張嘉琪，狄文慧，徐連秀，聶文營(yíng)，郝 峰 (吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)教研室，吉林 吉林 132013)

基因表達(dá)分析是探索目的基因生物活性的首要環(huán)節(jié)，其常用分析方法有蛋白水平和mRNA水平分析等。蛋白水平分析是目前公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但該法不僅需要高特異性抗體，且操作相對(duì)繁瑣。為此常先選用更為敏感的RT-PCR證實(shí)目的基因的mRNA表達(dá)情況，然后應(yīng)用蛋白分析方法進(jìn)一步確認(rèn)目的基因的表達(dá)情況[1-2]。為確保RT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取確定表達(dá)的管家基因ACTB作為模板[3]。當(dāng)原料充足的情況下，理論上，模板量越多，RT-PCR產(chǎn)物量越高，所以做RT-PCR時(shí)為了得到陽(yáng)性結(jié)果更傾向于多加一些模板。但在提取RNA時(shí)可能存在一些雜質(zhì)，常見的污染物有蛋白質(zhì)、醇類、胍鹽、糖類、酚和氯仿等，會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄后形成cDNA的質(zhì)量，進(jìn)而影響PCR結(jié)果。為解決這一問(wèn)題，本研究做RT-PCR時(shí)，選取不同濃度模板證實(shí)模板的質(zhì)量對(duì)RT-PCR的影響，并進(jìn)一步研究其影響因素,為RT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

NanoDrop 2000(美國(guó)Thermo)；PCR儀(美國(guó)ABI)；電泳儀(北京君意)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD)。

大鼠甲狀腺濾泡上皮(fischer rat epithelial,FRT)細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所關(guān)新剛教授饋贈(zèng)；引物由金唯智公司合成；RT-PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；PCR試劑盒、DNA Marker購(gòu)自全式金公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)購(gòu)自BIOSHAR公司；瓊脂糖購(gòu)自O(shè)XOID公司。

1.2 模板濃度的測(cè)定

利用核酸蛋白測(cè)定儀NanoDrop 2000檢測(cè)PCR前模板中A260/A230，A260/A280；蛋白含量A280、A260/A280和蛋白濃度。

1.3 PCR反應(yīng)

引物為自己設(shè)計(jì)：ACTB(Forward)5′-GTC GTC GAC AAC GGC TCC-3′，ACTB(Reverse)5′-AGG TCT CAA ACA TGA TCT GGG T-3′。

向PCR反應(yīng)管中加入上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),25 μL 2×EasyTaq PCR SuperMIx,1 μL模板(濃度分別為5、1、0.2、0.04、0.008 mg/L)，22 μL Nuclease-free Water補(bǔ)齊，反應(yīng)總體系50 μL。PCR擴(kuò)增3輪。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸5 min,反應(yīng)體系溫度最終降至4 ℃;94℃ 預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃ 延伸2 min，30個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸5 min,反應(yīng)體系溫度最終降至4 ℃;94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸5min,反應(yīng)體系溫度最終降至4 ℃。

1.4 電泳檢測(cè)

5 μL PCR產(chǎn)物上樣1.5%瓊脂糖/EB凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝影記錄。

2 結(jié) 果

2.1 NanoDrop 2000檢測(cè)模板的濃度和純度

mRNA濃度為1971.7 mg/L，A260/A280為1.75，A260/A230為1.74；純化PCR產(chǎn)物為模板濃度為763.2 mg/L，A260/A280為1.85，A260/A230為2.05。RNA純品的A260/A280比值在1.9～2.0，A260/A230的比值應(yīng)>2.0[4]；DNA純品A260/A280比值應(yīng)接近1.8～2.0，A260/A230比值應(yīng)在2～2.5之間。

2.2 PCR 50 μL體系中蛋白含量的測(cè)定

為探究RT-PCR結(jié)果影響因素，在高質(zhì)量的模板中混入不同濃度的蛋白質(zhì)：15.827、13.454、12.212、11.078、2.451 g/L，A260/A280分別為0.89、1.04、1.13、1.22、1.52。

2.3 電泳檢測(cè)結(jié)果

不同濃度的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1：5倍比稀釋模板，在260 bp附近均出現(xiàn)特異性條帶，但模板濃度越高，PCR條帶越暗且出現(xiàn)非特異性條帶。應(yīng)用軟件Image J及GraphPad Prism 5對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析表明模板質(zhì)量低時(shí)，模板量越高，RT-PCR產(chǎn)物量越低。

不同濃度純化的PCR產(chǎn)物PCR電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2：5倍比稀釋，在260 bp附近均出現(xiàn)特異性條帶，模板濃度越高，PCR條帶越亮且未出現(xiàn)非特異性條帶。應(yīng)用軟件Image J及GraphPad Prism 5對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析表明模板質(zhì)量高時(shí)，模板量越高，PCR產(chǎn)物量越高。

相同濃度純化的PCR產(chǎn)物并加入不同濃度蛋白質(zhì)的PCR電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3：在高質(zhì)量的模板中混入不同濃度的蛋白質(zhì)，在260 bp附近均出現(xiàn)特異性條帶，蛋白質(zhì)含量越低，PCR條帶越亮,且僅含有最低濃度蛋白質(zhì)的PCR未出現(xiàn)非特異性條帶。應(yīng)用軟件Image J及GraphPad Prism 5對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析顯示模板量相同情況下，蛋白濃度越高，PCR產(chǎn)物的量越低。

M：Marker；1～5模板濃度：5、1、0.2、0.04、0.008 mg/L

M：Marker；1～5模板濃度：5、1、0.2、0.04、0.008 mg/L

M：Marker；1～5模板濃度：5、1、0.2、0.04、0.008 mg/L

3 討 論

PCR是分子生物學(xué)中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，靈敏度高，在揭示生命現(xiàn)象規(guī)律方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。理論上，在原料充足的情況下，模板量越多，PCR產(chǎn)物的越高。但實(shí)際中模板會(huì)存在蛋白質(zhì)、胍鹽等雜質(zhì)，對(duì)PCR產(chǎn)物的質(zhì)和量有嚴(yán)重影響。本研究結(jié)果證實(shí)當(dāng)提取的RNA質(zhì)量不佳時(shí)，會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄后形成cDNA的質(zhì)量，這時(shí)選取過(guò)多低質(zhì)量的模板，不僅PCR產(chǎn)物量越低，且出現(xiàn)非特異性條帶。在純化PCR產(chǎn)物獲得高質(zhì)量的模板后，再次進(jìn)行PCR，得出的結(jié)果與之前相反，上述結(jié)果表明模板質(zhì)量對(duì)RT-PCR結(jié)果有顯著性影響。為獲得準(zhǔn)確的PCR結(jié)果應(yīng)提高模板質(zhì)量，當(dāng)模板質(zhì)量不佳時(shí)，應(yīng)稀釋模板，而非想當(dāng)然的增加模板量。當(dāng)模板質(zhì)量不佳獲得假陰性結(jié)果或者出現(xiàn)非特異性條帶時(shí)，并不是通過(guò)增加模板的量或者降低退火溫度獲得陽(yáng)性結(jié)果和去除非特異性條帶。本研究推斷模板質(zhì)量影響PCR產(chǎn)物量。為進(jìn)一步探究其影響因素，在高質(zhì)量的模板中混入不同濃度的蛋白質(zhì)，探究蛋白質(zhì)對(duì)PCR產(chǎn)物量影響。發(fā)現(xiàn)在模板量相同情況下，蛋白濃度越高，PCR產(chǎn)物的量越低，并出現(xiàn)非特異性條帶，因此可以推斷模板中混入的蛋白質(zhì)會(huì)影響RT-PCR結(jié)果。因此在提取RNA或DNA過(guò)程中，保證完整性的同時(shí)，一定要提高模板純度，而模板的濃度對(duì)RT-PCR結(jié)果影響不大。