汪澤江，劉丹，姜軍，王凱,

(1.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074；2.湖北大學化學化工學院，湖北 武漢 430026)

0 引言

卟啉及其衍生物廣泛存在于自然界中，并在生命活動中扮演著重要的角色[1-3].現(xiàn)代研究表明，卟啉在生物醫(yī)藥、材料、催化以及光化領域都有著重要的地位[4].卟啉作為一種重要的光敏劑，是光動力治療中的重要環(huán)節(jié).光動力療法(photodynamic therapy, PDT)包括3個不可或缺的部分：光敏劑、光、氧氣，主要是通過光敏劑吸收能量后的光敏反應產生高毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，特別是單線態(tài)氧(1O2)來破壞腫瘤細胞和誘導癌細胞凋亡[5-7].隨著對卟啉作為光敏劑治療腫瘤的深入研究，卟啉類光敏劑與DNA的相互作用研究也尤為重要[8-9].隨著對生命的研究日益加深，科學家們發(fā)現(xiàn)，以脫氧核糖核酸為單元組成的DNA是一種長鏈聚合物[10].它所攜帶的遺傳信息是生命體的重要基石，控制的蛋白質的合成[11].多種疾病與DNA有關，因此研究DNA的結合位點，篩選新型藥物放入作用靶點，在基因水平上進行疾病的診斷和治療，對防病抗病的健康研究十分重要.大部分卟啉化合物能可逆的與DNA結合，并且卟啉的主要是以DNA-卟啉復合物的方式進行的，所以研究卟啉與DNA的相互作用在生物活性研究方面有重大意義[12].目前主要運用光譜學原理研究卟啉化合物與DNA的相互作用模式[13].

卟啉的近紅外區(qū)吸收較弱，這導致卟啉的光熱效應較小及組織穿透深度較低，導致對深部癌細胞的療效降低[14].共軛體系的增加有助于提升卟啉化合物的紅外吸收以及單線態(tài)氧的量子產率[15].此外，有機卟啉類化合物存在水溶性差、生物利用度低、腫瘤選擇性不高等需要克服的主要障礙.

因此，我們設計并合成了一種新的三苯胺-鋅卟啉(ZnTPor)，其是將三苯胺共軛修飾到卟啉環(huán)上再與低細胞毒性的鋅(Zn(II))配位，形成典型的供體-受體-供體(D-A-D)結構.同時為了提高有機物的親水性，在共軛結構上引入聚乙二醇(PEG)鏈，具體見Scheme I.以有機小分子聚乙二醇-卟啉(PPor)作為參照，借助于紫外可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜，考察ZnTPor與DNA結合模式，同時，以2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)作為標記物，對其單線態(tài)氧能力進行了評價.

Scheme I PPor 和ZnTPor的合成路線

1 材料和方法

1.1 實驗儀器及試劑Cary UV-100紫外-可見光譜儀；Fluoromax-4c-L熒光光譜儀(HoRIBA Scientific)；Varian Mercury-VX400(400 MHz) 核磁共振儀；Bruker Auto MALDI-TOF 質譜儀；ct-DNA購于Sigma-Aldrich 公司，其他試劑由國藥集團化學試劑有限公司提供，未進一步純化.水為純化水.PPor、TPor的制備方法參照文獻[16].

1.2 ZnTPor的制備稱取50 mg(0.038 5 mmol)TPor溶解在50 mL二氯甲烷中，85 mg(0.46 mmol)乙酸鋅溶于5 mL甲醇后加入，室溫避光攪拌12 h.減壓濃縮除去溶劑后用二氯甲烷萃取，水及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑后柱層層析分離提純，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇=100∶1(V/V)，得到紫色固體ZnTPor.1H NMR (400 MHz, DMSO)δ為8.91 (d,J=7.0 Hz, 4H), 8.80 (d,J=4.5 Hz, 2H), 8.76 (s, 2H), 8.04 (t,J=8.4 Hz, 8H), 4.32 (s, 4H), 3.88 (s, 4H), 3.67 (d,J=4.7 Hz, 4H), 3.61 (d,J=4.7 Hz, 4H), 3.56 (d,J=4.9 Hz, 4H), 3.50 (d,J=4.6 Hz, 4H), 3.47～3.42 (m, 4H), 1.10 (t,J=7.0 Hz, 6H). MS (Maldi-TOF)：m/z=1 364.5 [M+1]+.

1.3 溶液的配置

1.3.1 Tris-HCl緩沖溶液的配制 將0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)與0.1 mol/L鹽酸溶液混合，配制成pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液，濃度為0.05 mol/L，其中含0.1 mol/L NaCl[17].

1.3.2ct-DNA儲備液的配制 根據朗伯-比爾定律即A=εlc，可計算得到DNA濃度.其中A表示吸光度；ε為摩爾吸光系數；l為比色皿厚度；c為吸光物質濃度[18].

稱取5 mgct-DNA溶于50 mL Tris-HCl緩沖溶液中，利用紫光-可見光譜儀測得其在260 nm和280 nm處的吸光度值.現(xiàn)已知ct-DNA在260 nm處的摩爾吸光系數為6 600 L· mol-1· cm-1，根據A=εlc計算得到ct-DNA濃度為1.33×10-4mol/L.并且A260 nm∶A280 nm=0.88∶0.486=1.81>1.8，所以該ct-DNA蛋白質的含量滿足測試要求.

1.3.3 卟啉儲備液的配制 溶解卟啉化合物于DMSO中，配制成濃度為1 mmol/L的溶液備用，再根據測試需要用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至所需濃度即可.

1.4 DNA相互作用

1.4.1 紫外可見光譜測試 量取10 μL 濃度為1 mmol/L 卟啉儲備液于比色皿中，然后加入3 mL Tris-HCl緩沖溶液稀釋至3 μmol/L.以不同濃度的ct-DNA溶液滴定，檢測其在350～500 nm范圍內吸光度的變化.每次加入ct-DNA后充分混合5 min，樣品池厚度為1 cm.本次共測試11個ct-DNA濃度，分別為0、0.09、0.13、0.22、0.44、0.66、0.88、1.75、2.61、3.45、4.29 μmol/L.

1.4.2 熒光發(fā)射光譜測試 量取10 μL 1 mmol/L 卟啉儲備液于比色皿中，然后加入3 mL Tris-HCl緩沖溶液稀釋至3 μmol/L.以不同濃度的ct-DNA溶液滴定，檢測其在600～750 nm范圍內熒光強度的變化.每次加入ct-DNA后充分混合5 min，樣品池厚度為1 cm.ZnTPor和PPor的激發(fā)波長分別是432和421 nm，激發(fā)狹縫2 nm，發(fā)射狹縫2 nm，掃描速度240 nm/min.本次共測試6個ct-DNA濃度，分別為0、0.66、0.88、1.75、2.61、3.45 μmol/L.

1.5 單線態(tài)氧產生量取1 mmol/L的卟啉儲備液300 μL于1.2 mL DMSO，然后加入PBS緩沖溶液定容至10 mL，稀釋濃度至30 μmol/L.從中取100 μL置于比色皿，然后加入0.5 μmol/L濃度的DCFH溶液2.9 mL，卟啉濃度變?yōu)? μmol/L.每組用氙燈照射兩分鐘，共測試8組，激發(fā)波長為488 nm，以DCFH的PBS溶液為空白對照，檢測500～600 nm范圍內熒光強度的變化.

2 結果與討論

2.1 與DNA結合模式

2.1.1 紫外-可見光譜法 在紫外-可見吸收光譜中，以不同濃度的ct-DNA滴定卟啉化合物，觀察卟啉Soret帶的吸收變化.如圖1所示，隨著ct-DNA濃度的增加(0～4.29 μmol/L)，卟啉化合物在Soret帶的吸光度均有不同程度的減弱并伴隨著紅移.這是因為卟啉的大環(huán)π*共軛體系與DNA堿基對發(fā)生π電子堆積，卟啉π*空軌道與堿基對的π電子軌道發(fā)生耦合導致能級降低，π→π*躍遷能級減小，從而出現(xiàn)了紅移.另一方面，耦合作用使π*軌道部分充滿電子，π→π*躍遷幾率減小，因此出現(xiàn)減色效應[12,19].由表1和圖2-1的減色(Hypochromicity)和紅移(Bathochromic shift)數據可以看出，ZnTPor沒有出現(xiàn)較大的紅移(<5 nm)但出現(xiàn)了較大程度的減色(>50%)，初步推斷卟啉ZnTPor與DNA的結合模式為嵌插結合模式.PPor出現(xiàn)了一定程度的紅移(5 nm)的減色程度很小(<30%)，這表明PPor與DNA可能以嵌插或外部鍵合兩種模式結合.

結合常數K可用來表示卟啉化合物與DNA結合能力，表現(xiàn)為插入模式K值在106～107，表現(xiàn)為外部鍵合模式的K值在105左右[12].其方程可表示為：

圖1 ZnTPor (A)和 PPor (B)的ct-DNA滴定紫外-可見吸收光譜

表1 ct-DNA滴定法測定PPor和ZnTPor的紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射、結合常數

D/Δεap=D/Δε+1/(ΔεK)

(1)

其中D表示DNA的濃度，單位為mol/L；Δεap=|εA-εF|；Δε=|εB-εF|;εA=Aobs/ [Porphyrin]；εB和εF分別表示DNA-卟啉復合物的消光系數和未與DNA結合的自由卟啉的消光系數.D/Δεap和D之間具有一定的線性關系可線性擬合得出方程.線性擬合后將斜率1/Δε與截距1/(ΔεK)相除可計算得到K值(如圖2)，計算結果列于表1中.從表1中數據可以看出，PPor結合常數較小，結合紫外吸收可表明與DNA結合模式為外部鍵合.ZnTPor結合常數K大于106，與DNA結合能力較強.

圖2 ZnTPor(A) 和 (B) PPor 的D/Δεap與D之間的關系

2.1.2 熒光發(fā)射光譜法 以不同濃度ct-DNA滴定卟啉，測得熒光發(fā)射光譜如圖3所示.由表1和圖3的數據不難看出，兩種卟啉化合物均未出現(xiàn)較大位移(<5 nm)，其中ZnTPor隨著ct-DNA濃度增加，熒光強度有明顯的降低，這是因為卟啉插入到DNA后，與DNA之間發(fā)生了能量傳遞導致熒光強度的降低.PPor的熒光強度減弱程度低，再次驗證了ZnTPor的DNA結合能力較強.ZnTPor發(fā)生一定程度的藍移，可能是因為卟啉環(huán)中配位了金屬鋅離子，使得卟啉本身電子云密度降低，也可能與金屬鋅的軸向配位有關.同時，ZnTPor與DNA相互作用后的紅移和增強的熒光表明它可能是插入DNA的J聚集體[18].

圖3 ZnTPor (A)和PPor (B)的ct-DNA滴定熒光發(fā)射光譜

圖4 DCFH的PBS緩沖溶液(A)在不同光照時間后的熒光發(fā)射光譜、(B) ZnTPor+DCFH和(C) PPor+DCFH的不同光照時間后的熒光發(fā)射光譜、(D) ZnTPor+DCFH和PPor+DCFH混合液 分別在523 nm處熒光強度與光照時間之間的變化曲線

2.2 單線態(tài)氧產生能力DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)是非標記性的氧化敏感的熒光探針，本身沒有熒光，進入細胞后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH，細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF[20].所以可以根據檢測DCF的熒光間接判定細胞內活性氧的水平.因為DCFH-DA易氧化的酚羥基形成乙酸酯后相對于DCFH的抗氧化能力增強.所以根據文獻方法對DCFH-DA進行預處理，使其水解成為DCFH后使用.

如圖4(A)所示，在DCFH的PBS溶液空白對照組中，光照后熒光強度變化不大，因此空氣氧化DCFH產生熒光對實驗的影響可忽略不計.圖4(B)和(C)中可以觀察到ZnTPor和PPor光照時間不同熒光強度的變化.在圖4(D)中通過對比可觀察到，隨著光照時間的延長，在兩種卟啉的存在下，DCF的熒光強度不斷增強.說明卟啉樣品在光照后產生了單線態(tài)氧，氧化DCFH使其成為具有綠色熒光的DCF.熒光強度越強，越快趨于飽和，說明單線態(tài)氧產生速率越快，即單線態(tài)氧產生效率ZnTPor>PPor.

對比兩種卟啉化合物的單線態(tài)氧產生效率：ZnTPor>PPor，這可能是TPA作為供電子基團增加了卟啉的光敏活性，同時增大了共軛體系使得化合物光敏性增強，再加上卟啉與金屬鋅配位后，鋅卟啉具有的高三重態(tài)量子產率[20]，使得卟啉化合物自身的光敏性增強，具有更好的單線態(tài)氧產生能力.

3 結論

本研究通過紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜數據進行線性擬合，計算DNA與卟啉的結合常數K值，研究卟啉化合物與ct-DNA的結合模式，這對生物活性的研究十分重要.發(fā)現(xiàn)兩種卟啉化合物ZnTPor和PPor均能與DNA有較好結合，PPor為外部結合模式，ZnTPor和為嵌插模式.同時本研究還測試了化合物的單線態(tài)氧產生情況，以DCFH為活性氧探針，通過間接法測得單線態(tài)氧產生能力：ZnTPor>PPor.再次驗證了ZnTPor的優(yōu)良光學性能，具有D-A-D結構三苯胺卟啉復合物，有利于電子的轉移, 增加卟啉的光敏活性，同時三苯胺連在卟啉環(huán)上增大了共軛體系使得化合物光敏性增強，與金屬鋅配位，也可增強卟啉的光敏性，使其具有更好的單線態(tài)氧產生能力.