鄧明勇，李畫敏，魏子貢

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

得益于簡單的分子遺傳操作、能在高密度條件下生長、能高水平地生產(chǎn)外源蛋白以及具有高等真核生物類似的翻譯后修飾功能，甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母已經(jīng)成為生產(chǎn)重組蛋白最重要的表達(dá)平臺之一[1-2].

為了進(jìn)一步提高畢赤酵母中外源蛋白的產(chǎn)量，研究者們已經(jīng)提出了很多策略，其中最普遍的一個策略就是通過引入多個拷貝的外源基因來提高mRNA的水平[3].很多蛋白表達(dá)的實例已經(jīng)顯示這一策略能顯著增加畢赤酵母重組蛋白產(chǎn)量[4-5].但是，這需要通過構(gòu)建含有多拷貝外源基因的表達(dá)菌株來實現(xiàn).傳統(tǒng)構(gòu)建畢赤酵母多拷貝菌株的方法有兩種：第一種方法是通過體外構(gòu)建含有多個重復(fù)外源基因表達(dá)盒的載體，然后將其整合到畢赤酵母基因組中[6]；另一種方法則是通過直接增加抗生素的濃度篩選整合有多個外源質(zhì)粒的克隆[7].這兩種方法都具有很大的局限性：利用體外構(gòu)建多拷貝的方法通常費(fèi)時費(fèi)力、需要多輪重復(fù)構(gòu)建，并且隨著拷貝數(shù)的增加載體的構(gòu)建愈發(fā)困難，最終通常無法得到理想中的高拷貝菌株；而利用抗生素篩選的方法需要較高的成本，并且，即使將抗生素濃度提高很多倍，最終得到的重組菌株中質(zhì)?？截悢?shù)仍然很低[8].近來，一種利用leu2-d作為缺陷型標(biāo)記介導(dǎo)畢赤酵母多拷貝質(zhì)粒整合的方法已經(jīng)被提出.leu2-d包含29 bp的釀酒酵母LEU2(beta-isopropylmalate dehydrogenase；參與亮氨酸生物合成第三步)內(nèi)源性啟動子以及完整的leu2開放閱讀框.研究證明，利用leu2-d作為缺陷型標(biāo)記能顯著增加釀酒酵母中2μ型質(zhì)粒的拷貝數(shù)[9].Maritza O B等研究發(fā)現(xiàn)，leu2-d也可以作為缺陷型標(biāo)記介導(dǎo)畢赤酵母多拷貝質(zhì)粒整合[10].這是因為當(dāng)完整的leu2內(nèi)源性啟動子截短至29 bp時，依靠單拷貝的leu2-d無法補(bǔ)足亮氨酸合成的缺陷，只有整合足夠拷貝leu2-d的菌株才能在MD培養(yǎng)基上生長.利用這一系統(tǒng)能直接篩選到含有5～20個質(zhì)?？截惖漠叧嘟湍刚暇?，大大減少了構(gòu)建多拷貝菌株的實驗操作和成本.

本研究證明了使用一個僅攜帶15 bp的釀酒酵母LYS1(saccharopine dehydrogenase；參與賴氨酸生物合成最后一步)內(nèi)源性啟動子及其完整的編碼基因(lys1-d)作為缺陷型標(biāo)記能更加高效地介導(dǎo)畢赤酵母超高拷貝質(zhì)粒整合，旨在為構(gòu)建畢赤酵母多拷貝整合菌株增加新的工具.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 畢赤酵母X33、大腸桿菌XL10-gold、質(zhì)粒pGAPZB、EGFP-N3均由實驗室保存.

1.1.2 試劑 蛋白胨、酵母粉、YNB購自美國BD公司；D-生物素、L-賴氨酸購自美國Sigma公司；博來霉素購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒和DNA回收試劑盒均購自美國OMEGA公司；一步克隆試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自北京Neb公司；高保真PCR酶購自北京全式金生物公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.1.3 gRNA表達(dá)盒 根據(jù)畢赤酵母lys1(NCBI Gene ID:854852)的基因序列，利用CHOPCHOP網(wǎng)站設(shè)計gRNA，得到gRNA表達(dá)盒為：5’-CCAGTTCAAGTTACCTAAACAAATCAAACTTGGCCTGATGAGT CCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCGCCAAGGAATTGTTAGATACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGCCGGCATGGTCCC AGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTCAAGAGGATGTCAGAAT GCC-3’(命名為：RZ-LYS1gRNA-RZ)，下劃線處為N20序列.

1.1.4 引物 本研究中所用引物序列如表1所示，引物均由上海生工生物合成.

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母lys1基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及消除 畢赤酵母CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9參考Weninger A的方法由本實驗室前期構(gòu)建并保存[11].對于lys1基因敲除，將質(zhì)粒pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9用NotI酶切后，與gRNA表達(dá)盒RZ-LYS1gRNA-RZ連接，得到的載體pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9-LYS1gRNA即能介導(dǎo)畢赤酵母lys1基因敲除.該質(zhì)粒上攜帶一個博來霉素抗性基因(ble)和畢赤酵母自主復(fù)制序列(PARS1)，它們能分別用于轉(zhuǎn)化子的篩選和質(zhì)粒復(fù)制.此外，由于PARS1序列極易丟失，只需要在無抗生素抗性的培養(yǎng)基上傳代即可篩選出消除CRISPR/Cas9質(zhì)粒的敲除突變株[12].

表1 本研究使用的引物

圖1 pGK1-lys1-d-EGFP載體圖譜

1.2.2 構(gòu)建表達(dá)載體pGK1-lys1-d-EGFP首先，以畢赤酵母基因組DNA為模板，使用引物對GK1F/GK1R PCR擴(kuò)增得到畢赤酵母gk1(3-phosphoglycerate kinase)基因的啟動子(PGK1)片段，將PGK1片段與BglII和EcoRI雙酶切的pGAPZB載體連接，得到pGK1載體[13].然后，以質(zhì)粒EGFP-N3為模板，使用引物對EGFPF/EGFPR擴(kuò)增得到EGFP基因片段，將EGFP基因片段與EcoRI和SalI雙酶切的pGK1載體片段連接，得到pGK1-EGFP載體.最后，使用釀酒酵母基因組DNA作為模板，引物對lys1-dF/lys1-dR擴(kuò)增得到的lys1-d片段；以pGK1-EGFP質(zhì)粒為模板，引物對TEFF/AOXTTR擴(kuò)增得到pGK1-EGFP片段；將兩個擴(kuò)增片段克隆連接即得到pGK1-lys1-d-EGFP表達(dá)載體(見圖1).在電轉(zhuǎn)化前，pGK1-lys1-d-EGFP載體使用XbaI酶切，得到的線性化載體能靶向整合到畢赤酵母染色體上的PGK1啟動子位點.

1.2.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化 畢赤酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備參照Lin-Cereghino J的方法[14].電轉(zhuǎn)化時，2 μg線性的載體或200 ng環(huán)形的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至50 μL感受態(tài)細(xì)胞中(1.5 kV，5.0 ms)，利用MD(0.34% YNB，1% 硫酸銨，2% 葡萄糖，0.4 μg/mL生物素和1.5% 瓊脂)或添加適量抗生素的YPD培養(yǎng)基(1% 酵母粉，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖)篩選重組子.

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度 接種適量畢赤酵母細(xì)胞于MD培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h(30 ℃，200 r/min)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)接至5 mL新鮮MD培養(yǎng)基中(控制細(xì)胞起始OD600為0.5)，24 h后收集細(xì)胞.取適量收集的細(xì)胞，用含有0.5%牛血清白蛋白的滅菌PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用適當(dāng)?shù)臏缇鶳BS重懸細(xì)胞，控制細(xì)胞濃度為106個/mL.使用貝克曼CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，所有樣品的數(shù)據(jù)均在相同的電壓下收集.

1.2.5 熒光定量PCR確定質(zhì)粒的拷貝數(shù) 為了確定不同轉(zhuǎn)化子整合的質(zhì)?？截悢?shù)，使用熒光定量PCR的方法進(jìn)行測定.首先，提取畢赤酵母X33基因組DNA，將其按1∶10的梯度稀釋5次；然后，使用引物對qMET2F/qMET2R和qPGK1F/qPGK1R分別測定met2基因和PGK1啟動子的Ct值(每個梯度設(shè)置3個重復(fù))；最后，利用模板濃度的負(fù)對數(shù)與對應(yīng)濃度下的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程.依賴于同源單交換，pGK1-lys1-d-EGFP質(zhì)粒能插入畢赤酵母基因組PGK1啟動子位點[15].隨著一個線性的質(zhì)粒成功插入，基因組中PGK1啟動子會增加一個拷貝，而met2基因一直是單拷貝的.因此，通過比較met2基因和PGK1啟動子的拷貝數(shù)可以計算出轉(zhuǎn)化子整合的質(zhì)粒拷貝數(shù).

2 結(jié)果

2.1lys1基因敲除將構(gòu)建成功的pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9-LYS1gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33菌株，在含有終濃度為100 ng/μL博來霉素的YPD平板上生長3 d，任意挑取一個單菌落提取其基因組并測序.測序結(jié)果如圖2A所示，可以看出在基因組上gRNA靶向位置發(fā)生“TA”雙堿基缺失突變(將此突變株命名為XL1).為了確認(rèn)該菌株的表型，將其分別劃線于MD和添加L-賴氨酸(終濃度0.04%)的MD培養(yǎng)基，結(jié)果顯示(如圖2B)，突變株無法在缺少L-賴氨酸的MD培養(yǎng)基上生長，證明lys1基因成功敲除.

圖2 lys1基因敲除 A：lys1基因突變位點(紅色框線處為gRNA靶向位置)； B：突變株XL1表型分析.L-Lys(0.04%)：培養(yǎng)基含0.04% L-賴氨酸

2.2 質(zhì)粒整合按實驗方法制備畢赤酵母XL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，將2 μg線性的pGK1-lys1-d-EGFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至50 μL感受態(tài)細(xì)胞中，于MD平板培養(yǎng)基中培養(yǎng).8 d后，平板上長出8個單菌落，挑取這些單菌落于液體MD培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，結(jié)果只生長出6個單菌落(將此6個菌株分別命名為：Clone1、Clone2、Clone3、Clone4，Clone5和Clone6).而另外2個單菌落無法生長，經(jīng)推斷，這可能是由于它們整合的拷貝數(shù)太低，以致無法在液體MD培養(yǎng)基中的正常生長.

2.3 綠色熒光蛋白表達(dá)為了確定這6個轉(zhuǎn)化子表達(dá)綠色熒光蛋白能力的差異，利用流式細(xì)胞儀檢測了同樣條件下培養(yǎng)24 h的6個轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度.如圖3所示，所有轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未轉(zhuǎn)化的畢赤酵母X33菌株.并且可以觀察到6個轉(zhuǎn)化子中綠色熒光蛋白的含量也存在很大的差異.經(jīng)推斷，這很有可能是由于這些轉(zhuǎn)化子整合的質(zhì)?？截悢?shù)不同造成的.

2.4 確定質(zhì)粒拷貝數(shù)為了驗證這一推測，利用熒光定量PCR的方法對轉(zhuǎn)化子內(nèi)的質(zhì)粒的拷貝數(shù)進(jìn)行了測定.首先，利用野生型X33基因組DNA繪制如圖4所示met2基因和PGK1啟動子對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.99). 然后，提取這6個轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，分別測定met2基因和PGK1啟動子的Ct值，并計算拷貝數(shù).結(jié)果正如設(shè)想中的一樣，這些轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒的拷貝數(shù)也存在非常大的差異.如表2所示，所有轉(zhuǎn)化子中質(zhì)?？截悢?shù)均處于19～168之間.

2.5 質(zhì)?？截悢?shù)與EGFP熒光強(qiáng)度的相關(guān)性隨即，又對這6個菌株表達(dá)外源蛋白的產(chǎn)量與整合的質(zhì)?？截悢?shù)做了相關(guān)性分析.結(jié)果顯示，這些菌株中質(zhì)?？截悢?shù)與蛋白產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性(如圖5.R2> 0.99).從圖中可以觀察到整合了167.58個拷貝的Clone6，其熒光強(qiáng)度高達(dá)1 368 732，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于整合19.81個拷貝的Clone4的熒光強(qiáng)度100 318.這些結(jié)果表明，lys1-d缺陷型標(biāo)記能有效地介導(dǎo)畢赤酵母超高拷貝質(zhì)粒整合從而增加EGFP的表達(dá).

圖3 胞內(nèi)EGFP熒光強(qiáng)度

表2 6個轉(zhuǎn)化子中質(zhì)?？截悢?shù)

圖4 PGK1啟動子與met2基因拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 質(zhì)?？截悢?shù)與EGFP熒光強(qiáng)度的相關(guān)性

3 討論

傳統(tǒng)的用于篩選多拷貝整合菌株的抗生素：如博來霉素(Zeocin)、遺傳霉素(G418)價格極其昂貴(超過400元/g)，利用高濃度抗生素篩選多拷貝克隆的方法大大增加了實驗成本.并且使用高濃度的抗生素會提高菌株的自然耐藥性，不利于生態(tài)環(huán)境.

利用大腸桿菌體外構(gòu)建多拷貝的方法通常需要包含多個特殊的限制酶切位點的載體，通過酶切連接的方式逐輪增加基因表達(dá)盒的拷貝數(shù)[16].相比于高濃度抗生素篩選，這種方式一定程度上降低了成本，并且整合的基因拷貝數(shù)可以實現(xiàn)精準(zhǔn)的控制.但是，體外構(gòu)建最大的弊端就是周期長、實驗步驟繁瑣、難以達(dá)到高拷貝.

最近報道的leu2-d系統(tǒng)只需利用一步簡單的轉(zhuǎn)化篩選便能得到5～20質(zhì)粒拷貝的整合菌株，解決了傳統(tǒng)方法成本高、周期長、步驟繁瑣的問題.

本研究中的lys1-d系統(tǒng)與leu2-d系統(tǒng)一樣能簡便、高效地介導(dǎo)畢赤酵母多拷貝質(zhì)粒整合.并且，與leu2-d相比，使用lys1-d缺陷型標(biāo)記能將整合的質(zhì)?？截悢?shù)提高至168.這一系統(tǒng)為構(gòu)建畢赤酵母超高拷貝質(zhì)粒整合菌株增添了有效的工具.