張雪松 王宇飛 王國棟 向雪松 王竹

摘要：目的：建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿中2種全麥?zhǔn)称飞飿?biāo)志物烷基間苯二酚（ARs）的方法。方法：血漿加入內(nèi)標(biāo)，經(jīng)丙酮提取，離心取上清液過濾，濾液吹干異丙醇定容，使用實心核色譜柱（21mm×100mm，16μm）為分離柱，以異丙醇∶乙腈=30∶70為流動相，等度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測，用內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果：2種ARs在2～200ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，r2>0998 0。方法檢出限為01ng/mL，定量限為03ng/mL，加標(biāo)回收率為882%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為248%～132%（n=6）。結(jié)論：該方法快速準(zhǔn)確、靈敏度高、前處理簡單，能夠有效測定血漿中2種ARs的含量。

關(guān)鍵詞：烷基間苯二酚;全麥?zhǔn)称?血漿;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

烷基間苯二酚（Alkylresorcinols，ARs）是weIlkert等[1]首次于小麥、黑麥等麥類中發(fā)現(xiàn)，特異地存在于小麥、黑麥等麥類的麩皮中，而胚和胚乳中不含有ARs。麥類麩皮中的ARs的烷基側(cè)鏈一般為含有15～25個奇數(shù)碳原子的飽和碳鏈，分別為5十五烷基間苯二酚（AR C15∶0）、5十七烷基間苯二酚（AR C17∶0）、5十九烷基間苯二酚（AR C19∶0）、5二十一烷基間苯二酚（AR C21∶0）、5二十三烷基間苯二酚（AR C23∶0）、5二十五烷基間苯二酚（AR C25∶0），其中主要以AR C19∶0與AR C21∶0為主[2]。麥類麩皮中的ARs被人體攝入后，可在血漿等生物樣本中檢測到其同系物或代謝物，當(dāng)人們進(jìn)食無麩皮的膳食時，則不能檢出，因此可以作為全麥產(chǎn)品攝入的生物標(biāo)志物[34]。最初對于血漿AR的測定方法主要是氣相串聯(lián)質(zhì)譜法[5]，但是ARs需要進(jìn)行化學(xué)衍生化為可揮發(fā)成分再進(jìn)行測定，前處理過程繁瑣，無法快速地檢測大量樣品，一定程度上限制了ARs作為生物標(biāo)志物在流行病學(xué)研究中的應(yīng)用。隨后逐漸采用液相串聯(lián)質(zhì)譜法，但是該方法需采用正相色譜，適用范圍窄，同時也需要進(jìn)行固相萃取，且檢測過程ARs回收率較低[67]。而目前我國還未有血漿中ARs檢測方法的報道，因此，本研究針對麩皮中含量較高的AR C19∶0與AR C21∶0，應(yīng)用反相超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）建立一種快速簡便的方法測定血漿中的ARs，以便于ARs作為攝入全麥的生物標(biāo)志物的推廣應(yīng)用。

1材料與方法

11樣品

大鼠血漿：雄性SD大鼠，體重約200g，正常飲食，禁食過夜后取空腹血液，以3 000r/min離心10min后取上層血漿，分裝于凍存管中，樣品置于-80℃冰箱冷凍保存，避免反復(fù)凍融。

人血漿：遵循赫爾辛基宣言的倫理學(xué)指導(dǎo)方針，招募男性健康無全谷物飲食習(xí)慣志愿者，本實驗需進(jìn)行2次血漿采集，第一次是空白血漿采集，由專業(yè)人員采集空腹血2mL。第二次是提供給志愿者晚餐全麥饅頭（ARs含量約為39mg/個），志愿者自愿進(jìn)食，晚餐后禁食，次日由專業(yè)人員抽取空腹血2mL。空腹血經(jīng)3 000 r/min離心10min后，提取上層血漿，置于凍存管中，于-80℃冰箱冷凍保存。

12儀器與設(shè)備

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀Waters Xevo，TQS，Waters公司;離心機(jī)Eppendorf 5418，Eppendorf公司;精密電子天平PB602N，MettlerToledo公司;渦旋混合儀GENIUS3，Ika公司;超純水系統(tǒng)MilliQ Advantage A10，Millipore公司;-80℃醫(yī)用低溫保存箱DW86L626，海爾公司;CORTECS UPLC C18 色譜柱（粒徑16μm、內(nèi)徑21mm、長度100mm），Waters公司;CORTECS UPLC C18 保護(hù)柱（粒徑16μm、內(nèi)徑21mm、長度5mm），Waters公司。

13試劑

5十九烷基間苯二酚（AR C19∶0，95%，Sigma公司）、5二十烷基間苯二酚（AR C20∶0，95%，Sigma公司）、5二十一烷基間苯二酚（AR C21∶0，95%，Sigma公司）、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）、丙酮（色譜純，F(xiàn)isher公司）、異丙醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）、乙醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）、乙醚（分析純，北京化工廠）、乙酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。

14實驗方法

141標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取1mg AR C19∶0、AR C21∶0的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至100mL，制成10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃保存。稱取1mg AR C20∶0標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至100mL，制成10μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，-20℃保存。使用前將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，配制成2、4、8、10、20、40、80、100、200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)AR C20∶0濃度為100ng/mL。

142超高效液相色譜條件色譜柱：Waters CORTES UPLC C18色譜柱（內(nèi)徑21mm、柱長100mm、粒徑16μm）;流動相：乙腈∶異丙醇=70∶30，等度洗脫;柱溫30℃;進(jìn)樣量2μL;流速03mL/min。

143質(zhì)譜條件采用電噴霧負(fù)離子模式（ESI）電離;多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行定性定量分析;錐孔電壓30V;錐孔氣流量150L/h;離子源溫度 150℃;脫溶劑氣溫度500℃;AR C19∶0、AR C20∶0、AR C21∶0特征離子及相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

144樣品處理取100μL血漿加入50μL AR C20∶0標(biāo)準(zhǔn)溶液（100ng/mL）后，加入850μL丙酮渦旋振蕩2min，在10 000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min后，取上清溶液過022μm濾膜，取500μL濾液在25℃氮氣吹干，加入50μL異丙醇復(fù)溶，混合均勻后，在10 000r/min轉(zhuǎn)速下離心1min取上清檢測。

15統(tǒng)計方法

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入編輯，以SAS 94進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用oneway ANOVA方差分析，以P<005 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

21提取溶劑的選擇

以大鼠血漿為樣品，比較乙醚、丙酮等提取溶劑的提取效果。具體方法：（1）乙醚提取，取100μL大鼠血漿加入50μL AR C20∶0標(biāo)準(zhǔn)溶液（100ng/mL），加入05mL乙醇、05mL水和3mL含有60μL乙酸的乙醚，渦旋振蕩2min，以-40℃冰乙醇冷凍水相，取上層有機(jī)相，乙醚重復(fù)萃取3次，有機(jī)相合并后過022μm濾膜，濾液氮氣吹干，50μL甲醇復(fù)溶，渦旋混勻后上機(jī)檢測。（2）丙酮提取甲醇復(fù)溶，取100μL血漿加入50μL AR C20∶0標(biāo)準(zhǔn)溶液（100ng/mL）后，加入850μL丙酮渦旋振蕩2min，在10 000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min后，取上清溶液過022μm濾膜，取500μL濾液在25℃氮氣吹干，加入50μL甲醇復(fù)溶，混合均勻后，再以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心1min后取上清檢測。（3）丙酮提取異丙醇定復(fù)溶，濾液氮氣吹干后加入50μL異丙醇復(fù)溶，其余與方法2步驟一致。由表2可知，方法1 AR C19∶0和AR C20∶0均未檢出，方法2與方法3結(jié)果無顯著性差異，但方法3精密度較好（RSD%<10%），選擇方法3作為樣品的提取方法。

22色譜條件的確定

ARs屬于弱極性物質(zhì)，并且隨著烷基側(cè)鏈長度的增加極性逐漸減弱，以往研究多采用正相色譜體系分離ARs，適用范圍窄，在本項目前期測定全麥樣品中ARs方法的基礎(chǔ)上，采用異丙醇∶乙腈=30∶70為流動相，并因異丙醇粘度較大，選擇背壓較低的實心核色譜柱（Waters CORTES UPLC C18），3種ARs可以在5min內(nèi)得到良好的分離。

23質(zhì)譜檢測條件的確定

通過比較全掃描模式下的手動優(yōu)化和儀器自動優(yōu)化結(jié)果，采用電噴霧負(fù)離子模式（ESI），并確定了AR C19∶0、AR C21∶0、AR C20∶0的質(zhì)譜檢測條件。采用表1中的質(zhì)譜條件對AR C19∶0、AR C20∶0、AR C21∶0進(jìn)行定性分析（附圖）。

24標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液經(jīng)022μm濾膜過濾后分別注入液相色譜質(zhì)譜儀中，測定相應(yīng)的AR C19∶0、AR C21∶0峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中的AR C19∶0、AR C21∶0濃度為橫坐標(biāo)，以AR C19∶0、AR C21∶0的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)AR C20∶0的響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。向空白人血漿中加入AR C19∶0與AR C21∶0標(biāo)準(zhǔn)品，以信噪比 S/N=3時對應(yīng)的濃度為方法檢出限;以信噪比 S /N=10時對應(yīng)的濃度為方法定量限。表3可見，AR C19∶0與AR C21∶0在2～200ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，且方法靈敏度高。

25方法精密度、準(zhǔn)確度

取已知本底值的大鼠血漿和人血漿，分別添加3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平平行測定6次，以加標(biāo)回收率評價方法的準(zhǔn)確度，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評價方法的精密度。表4～5可見，加標(biāo)回收率在882%～115%之間、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<132%（n=6）。

3結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜建立了血漿中AR C19∶0、AR C21∶0的測定方法。該方法前處理簡單，靈敏度高，精密度、準(zhǔn)確度良好，能夠達(dá)到血漿中AR C19∶0、AR C21∶0定性定量的要求。但要明確全麥?zhǔn)称分蠥Rs的攝入量與血漿中ARs含量的關(guān)系，還需要進(jìn)一步的實驗研究?！?/p>

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